CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

CARIP-Seq'in genel amacı, genom çapında kromatinle ilişkili RNA'ları araştırmaktır. ChIP-Seq'in amacı, embriyonik kök hücrelerde protein-DNA etkileşimlerini küresel ölçekte değerlendirmektir. Bu yöntemler, epigenetik ve kök hücre alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya, embriyonik kök hücrelerde genom konumunu, transkripsiyon faktörlerini veya epigenetik düzenleyici bağlanma veya histon modifikasyonu doluluğunu veya kromatinle ilişkili RNA'ları tanımlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniklerin temel avantajı, kromatin bileşenleri ile ilişkili RNA'ların genom çapında tarafsız sorgulanmasına ve protein DNA etkileşimlerinin küresel olarak tanımlanmasına izin vermesidir. Bu yöntemler embriyonik kök hücre biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, kanser biyolojisini veya diğer insan hastalıklarını incelemek için diğer memeli hücre tiplerine de uygulanabilir. Embriyonik kök hücreleri toplamak için hücreleri önce fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Daha sonra, hücreleri önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış% 0.25 tripsin ile ayırın. Tripsinasyondan sonra,% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş önceden ısıtılmış MEF ortamında hücreleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, konik bir tüpteki hücrelere% 1'lik bir nihai konsantrasyona% 37 formaldehit ekleyin ve hücreleri çapraz bağlamak için sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Fiksasyon reaksiyonunu durdurmak için, dört santigrat derecede önceden soğutulmuş 1.25 molar glisin, 0.125 molar'lık bir nihai konsantrasyona ekleyin. Ardından, tüpü bir döndürücüye yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca dakikada sekiz devirde ters çevirin. Beş dakika sonra, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.

Santrifüjleme bittikten sonra süpernatanı atın. Ardından, peleti önceden soğutulmuş fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın ve numuneyi tekrar santrifüjleyin. Daha sonra, fosfat tamponlu salini çıkarın ve hücreleri bir dakika boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun.

Embriyonik kök hücreler buz üzerinde çözüldükten sonra, peleti 2.5 mililitre sonikasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Transkripsiyon faktörlerini veya epigenetik faktörleri incelemek için, hücre peletini sodyum dodesil sülfat olmadan sonikasyon tamponunda yeniden askıya alın. Histon modifikasyonları için, hücre peletini sodyum dodesil sülfat içeren tamponda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, kromatin immünopresipitasyonu için, kromatini 30 saniye açık ve 30 saniye dinlenme modu ile% 40 genlikte 14 ila 18 döngü boyunca sonikleştirin. Kromatini protein faktörü ChIP için çözündürmek için, sonikasyon tamponunu 28 mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ile tamamlayın. Histon modifikasyonlarındaki protein faktörleri için 28 mikrolitre sodyum deoksikolat ve 0.28 mililitre% 10 Triton X-100 ekleyin ve iyice karıştırın.

Ardından, kromatini önceden temizlemek için numuneyi 10.000 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı bir tüpe 40 mikrolitre A veya G manyetik boncuk ekleyin. Daha sonra, boncukları 600 mikrolitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın ve boncuklarla birlikte tüpü bir mıknatıs içeren bir rafa aktarın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin.

Daha sonra, fosfat tamponlu salini çıkarın ve boncukları 100 mikrolitre fosfat tamponlu salin içinde tekrar süspanse edin. Tüpe, iki ila dört mikrogram antikor ekleyin ve boncuklara antikor bağlanmasını teşvik etmek için dakikada sekiz devirde 40 dakika boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirerek inkübe edin. Ardından, boncukları yıkamak için 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin ekleyin.

Yıkadıktan sonra, kromatine bağlı proteinleri immünopresipite etmek için sonikasyonlu kromatin ekstraktını gece boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, boncukları yıkayın ve RIPA tamponu, tuzlu RIPA tamponu, lityum klorür tamponu, Triton X-100 ile Tris-EDTA tamponu ve Tris-EDTA tamponu ile her biri bir döndürücü üzerinde 10 dakika inkübe edin. ChIP için çapraz bağlantıyı çözmek için, boncukları 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponunda yeniden askıya alın.

Daha sonra üç mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ve mililitre Proteinaz K başına beş mikrolitre 20 miligram ekleyin ve boncukları gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ertesi gün, tüpleri birkaç kez ters çevirin, manyetik rafta bırakın ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Ardından, 0.5 molar sodyum klorür içeren 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyerek manyetik boncukları yıkayın ve iki süpernatanı birleştirin.

CARIP için çapraz bağlantıyı çözmek için, boncukları 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, mililitre Proteinaz K başına üç mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ve beş mikrolitre 20 miligram ekleyin ve boncukları dört ila 12 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Yine, tüpü birkaç kez ters çevirin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için manyetik rafa yerleştirin.

Ardından, 0.5 molar sodyum klorür içeren 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyerek manyetik boncukları yıkayın ve ardından iki süpernatanı birleştirin. Son olarak, fenol kloroform izoamil alkol kullanarak RNA örneğini hacimce 25 ila 24 hacimce bir hacim oranında izole edin. Daha sonra, kromatinle ilişkili immünopupipitasyonlu RNA örneğinden DNA'yı çıkarmak için DNaz kullanın.

Ardından, CARIP numunesine 10X DNaz tamponu ekleyin ve son hacmi 1X konsantrasyona ayarlayın. Ardından, numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, rastgele heksamer primerlerinin mililitresi başına 10.5 mikrolitre RNA ve üç mikrogramlık bir mikrolitre ekleyerek bir PCR reaksiyonu ayarlayarak ilk tamamlayıcı DNA zincirini sentezleyin.

İkincil yapıyı denatüre etmek için, önce tüpü 65 santigrat derecede beş dakika, ardından iki dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından, ana karışımı PCR tüpüne ekleyin ve 25 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Ardından, üst simge iki mikrolitresi başına 200 birimlik bir mikrolitre ekleyin ve termodöngüleyici programını çalıştırın.

Tamamlayıcı DNA'nın ikinci zincirini sentezlemek için, reaktifleri, tamponu ve enzimleri ekleyerek buz üzerinde reaksiyonu ayarlayın. Ardından, reaktifleri nazikçe karıştırmak için girdap yapın ve iki saat boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. DNA sentezlendikten sonra, bir PCR saflaştırma kiti kullanarak tamamlayıcı DNA'yı saflaştırın.

Daha sonra, çift sarmallı DNA'yı birleştirin, DNA'yı üç kez 10 dakika veya dört kez 10 dakika boyunca 250 ila 500 baz çifti boyutunda paylaşmak için bir su banyosu sonifiyesi ve 1.5 mililitrelik bir tüp kullanın. Ardından kütüphaneyi hazırlayın ve yeni nesil dizileme işlemini gerçekleştirin. Burada, kök hücre kolonilerini görselleştirmek için embriyonik kök hücrelerin faz kontrast görüntüleri yakalandı.

Bu protokolde hücreler, hücrelerin farklılaşmasını önlemek için kültür ortamında LIF ve/veya GSK3i ile mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastlarının varlığında veya yokluğunda kültürlendi. Daha sonra, çapraz bağlı embriyonik kök hücre kromatininin sonikasyon verimliliğini görselleştirmek için, sonikasyonlu çift sarmallı DNA% 2'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi. Jel görüntüsü, 200 ila 500 baz çifti aralığında kesilmiş kromatini gösterir.

Daha sonra, embriyonik kök hücrelerde histon modifiye edici bir enzimin ve histon modifikasyonlarının genom çapında doluluğunu değerlendirmek için yeni nesil bir dizileme platformu kullanılarak ChIP-Seq kütüphaneleri oluşturuldu ve dizilendi. Özel UCSC tarayıcı görünümünden, zenginleştirilmiş H3K4 trimetilasyonu, H3K4 dimetilasyonu ve KDM5B, çekirdek pluripotentlik düzenleyici geninde, POU5F1'de ve HOXC kümesinde görülebilir. Embriyonik kök hücrelerde kromatinle ilişkili RNA'ları değerlendirmek için CARIP-Seq analizi de yapıldı.

Özel UCSC tarayıcı görünümü, embriyonik kök hücrelerde H4K20 trimetilasyon ile ilişkili RNA ve H4K20 trimetilasyon doluluğunu gösterir. CARIP-Seq sonuçlarından, RNA'nın H4K20 trimetilasyonu ile ilişkili olmasına rağmen, belirli lokus ile etkileşime girmeyebileceği yorumlanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, CARIP-Seq kullanarak kromatinle ilişkili RNA'ları nasıl araştıracağınızı ve embriyonik kök hücrelerde küresel ölçekte protein DNA etkileşimlerini nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.