Name: CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin ChIP-Seq ve CARIP-Seq yöntemleriyle embriyonik kök hücrelerde protein-DNA etkileşimlerini ve kromatin ilişkili RNA'ları haritalamayı. Bu teknikler epigenetik araştırmalar için güçlü araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Wayne State Üniversitesi, Karmanos Kanser Enstitüsü, Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (1K22HL126842-01A1) B.L.K. için layık bir hibe tarafından desteklenmiştir Bu eser Wayne State Üniversitesi yüksek performans Grid bilgi sayısal kaynaklar için kullanılan (< https://www.grid.wayne.edu/>). Jiji logg CARIP Seq veri analizi ile yardım için teşekkür.
YAZARLARIN KATKILARI:
B.L.K. CARIP-Seq yöntemi gebe, tasarlanmış ve ChIP-Seq ve CARIP-Seq deneyler, sıralama veri analiz ve el yazması askere. Tüm yazarları okudum ve onaylanmış bu el yazması son sürüm.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Çip Seq küresel protein-DNA etkileşimleri konumunu değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir (Örn., transkripsiyon faktörleri/histon enzimler/histon modifikasyonları ve DNA değiştirme) ES hücrelerde, yeni geliştirilen CARIP-Seq Protokolü içinde yararlı iken RNA'ların genom çapında Derneği ile kromatin bileşenlerinin sorguluyor. Çip Seq ES Hücre epigenetik manzara ve diğer hücre tipleri değerlendirmek için kullanılan temel bir araçtır. ChIP-Seq ve CARIP-Seq kitaplıkları kalitesini büyük ölçüde ChIP-grade antikorl...

Embriyonik kök (ES) hücre kader kararlar arasında ekstrasellüler sinyalleri ve transkripsiyon-düzenleyiciler, histon değiştiriciler ve histon kuyrukları sonrası çeviri değiştirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi iletişim tarafından düzenlenmektedir. Bu etkileşimler kromatin erişilebilirlik ve kromatin paketlenmesi birine iki durumu kolaylaştırmak: euchromatin, açık ve transcriptionally etkin olan ve sık ve genellikle transcriptionally etkin olmayan heterochromatin. Transkripsiyon faktörleri DNA fingerprinting bağlama benzeşim ve euchromatic bölgeleri ile epigenetik değiştiriciler ortak Gen ifadesinin kontrolünde katılmak için. ChIP-Seq1, dahil olmak üzere yeni nesil sıralama yöntemleri, ES hücre kendini yenileme ve pluripotency2,3için,4 temel genom çapında transkripsiyon ağlar eşleştirmesi'nde vesile olmuştur ,5,6. Ayrıca, RNA immunopreciation yeni nesil (RIP-Seq) sıralama7 değerlendirme RNA-protein etkileşimlerinin tarafından takip ederken DNA bağlayıcı proteinler RNA'ların transkripsiyon olaylar7, düzenleyen ile etkileşim öneririm 8 , 9 , 10 , 11 , 12, kaç çalışmalar kromatin12veya RNA ve histon değişiklikler arasındaki küresel etkileşim ile ilişkili RNA'ların genom çapında lokalizasyonu araştırdı. Uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs) olan proteinleri kromatin ilişkili13,14,15etkinliği düzenleyen bulduk RNA'ların bir sınıfıdır. Örneğin, Xist düzenleyen, kadın memeli hücrelerinde inactivation bir X kromozomunun, epigenetik repressors16,17alımı yoluyla bir lncRNA olur. Ancak, kromatin ile ilişkili RNA'ların tam spektrum büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, biz yeni bir protokol, kromatin ilişkili RNA immunoprecipitation (CARIP) için yeni nesil sıralama (CARIP-kromatin ilişkili RNA'lar Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere ES hücrelerdeki genom-wide olarak tanımlamak için Seq), ardından tarif Yeni nesil sıralama ve histon değişiklikler, transkripsiyon faktörleri ve epigenetik değiştiriciler küresel doluluk eşlemek için ChIP-Seq. Diğer RIP-Seq yöntemleri7farklı olarak, CARIP-Seq kromatin ile ilişkili RNA'ların doğrudan tanımlanması için izin crosslinking ve sonication adımları içerir. Birlikte, ChIP-Seq genom çapında protein-DNA etkileşimleri tanımlamak için güçlü bir araçtır, CARIP-Seq anket için güçlü bir yöntem ise RNA'ların kromatin bileşenleriyle ilişkilendirilmiş.

<table><tbody><tr><td>Fare lösemi inhibitör faktörü (ESGRO LIF)</td> <td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 veya 107 </td></tr><tr><td>birimleri GSK3 ve beta; inhibitör CHIR99021 (GSK3i)</td> <td>Stemgent</td><td></td><td>Çözücü: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>MEK inhibitörü PD0325901 (MEKi)</td> <td>Stemgent</td><td></td><td>Çözücü: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz</td><td>İnvitrojen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu salin)</td><td>İnvitrojen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol (50 mM)</td> <td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Hücre Nitelikli Fetal Sığır Serumu, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax %0.1 Jelatin Çözeltisi</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1.25 M suda stok konentrasyonu</td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF) çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat çözeltisi (%20)</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonifier</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>İmmünopresipitasyon için Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>İmmünopresipitasyon için Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A / Protein G ve Mıknatıs Başlangıç Paketi</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Lityum klorür</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA Saflaştırma Kiti (toplam RNA preparatlarından mRNA saflaştırması için)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Çift Sarmallı cDNA Sentezi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA Uç Onarım Kiti</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Parçası (3'&rarr; 5' ekzo-)</td> <td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td> <td>İnvitrojen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Merdiven</td><td>İnvitrojen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-jel EX agaroz jelleri, %2</td> <td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion yüksek kaliteli HF tamponlu 2X ana karışım</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb + Trimetil-Histon H3 (Lys4) - ChIP Onaylı</td><td>Antikor EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 (di metil K4) antikoru [Y47] - ChIP Sınıfı (ab32356)</td> <td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Düz Tabanlı Hücre Kültürü Plakaları (6 kuyulu)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standart Doku Kültürü Kapları (10cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometre 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaksiyon Temizleme Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H4 (tri metil K20) antikoru - ChIP Sınıfı (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake döndürücü</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq platformu</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq ve chip-seq: kromatin ilişkili rna ve protein-dna etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Embriyonik kök (ES) hücre kendini yenileme ve farklılaşma dışsal sinyalleri ve transkripsiyon faktörleri, epigenetik düzenleyiciler ve combinatorially gen etkisi histon sonrası çeviri değişiklikler iç ağlar tarafından yönetilir Yakındaki genlerin ifade durumu. Kromatin dinamikleri ve gen ekspresyonu düzenleyen çeşitli proteinler ile etkileşim için RNA da gösterilmiştir. Kromatin ilişkili RNA immunoprecipitation (CARIP) yeni nesil sıralama (CARIP-Seq) tarafından takip RNA'ların kromatin proteinleri kromatin immunoprecipitation ardından yeni nesil sıralama () tarafından süre ile ilgili ankete roman bir yöntemdir ChIP-Seq) histon, transkripsiyon faktörleri ve küresel ölçekte-ES hücrelerdeki epigenetik değiştiriciler translasyonel modifikasyon konumunu eşlemek için bir güçlü genomik tekniktir. Burada, CARIP-Seq ve ChIP-Seq yeni nesil sekanslama için Kütüphane inşaat dahil olmak üzere, küresel kromatin ilişkili RNA ve epigenomic haritalar ES hücreleri oluşturmak için gerçekleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Başarılı bir şekilde H3K4me3, H3K4me2 ve KDM5B bu çip Seq Protokolü6kullanarak ES hücrelerdeki genom çapında bağlama sorguladık. ES hücreler kültürlü besleyici-Alerjik koşullarda (Şekil 1) ve yukarıda açıklandığı gibi çapraz bağlı. Sonication daha sonra ChIP-Seq Protokolü 3.2. adımında açıklandığı gibi gerçekleştirilen ve DNA üzerinde bir % 2 özel jel (Şekil 2) çalıştırarak değerlendirilir. Daha sonra ChIP...

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

CARIP-Seq'in genel amacı, genom çapında kromatinle ilişkili RNA'ları araştırmaktır. ChIP-Seq'in amacı, embriyonik kök hücrelerde protein-DNA etkileşimlerini küresel ölçekte değerlendirmektir. Bu yöntemler, epigenetik ve kök hücre alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya, embriyonik kök hücrelerde genom konumunu, transkripsiyon faktörlerini veya epigenetik düzenleyici bağlanma veya histon modifikasyonu doluluğunu veya kromatinle ilişkili RNA'ları tanımlamaya yardımcı olabilir.Bu tekniklerin temel avantajı, kromatin bileşenleri ile ilişkili RNA'ların genom çapında tarafsız sorgulanmasına ve protein DNA etkileşimlerinin küresel olarak tanımlanmasına izin vermesidir. Bu yöntemler embriyonik kök hücre biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, kanser biyolojisini veya diğer insan hastalıklarını incelemek için diğer memeli hücre tiplerine de uygulanabilir. Embriyonik kök hücreleri toplamak için hücreleri önce fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.Daha sonra, hücreleri önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış% 0.25 tripsin ile ayırın. Tripsinasyondan sonra,% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş önceden ısıtılmış MEF ortamında hücreleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, konik bir tüpteki hücrelere% 1'lik bir nihai konsantrasyona% 37 formaldehit ekleyin ve hücreleri çapraz bağlamak için sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Fiksasyon reaksiyonunu durdurmak için, dört santigrat derecede önceden soğutulmuş 1.25 molar glisin, 0.125 molar'lık bir nihai konsantrasyona ekleyin. Ardından, tüpü bir döndürücüye yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca dakikada sekiz devirde ters çevirin. Beş dakika sonra, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.Santrifüjleme bittikten sonra süpernatanı atın. Ardından, peleti önceden soğutulmuş fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın ve numuneyi tekrar santrifüjleyin. Daha sonra, fosfat tamponlu salini çıkarın ve hücreleri bir dakika boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun.Embriyonik kök hücreler buz üzerinde çözüldükten sonra, peleti 2.5 mililitre sonikasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Transkripsiyon faktörlerini veya epigenetik faktörleri incelemek için, hücre peletini sodyum dodesil sülfat olmadan sonikasyon tamponunda yeniden askıya alın. Histon modifikasyonları için, hücre peletini sodyum dodesil sülfat içeren tamponda yeniden süspanse edin.Daha sonra, kromatin immünopresipitasyonu için, kromatini 30 saniye açık ve 30 saniye dinlenme modu ile% 40 genlikte 14 ila 18 döngü boyunca sonikleştirin. Kromatini protein faktörü ChIP için çözündürmek için, sonikasyon tamponunu 28 mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ile tamamlayın. Histon modifikasyonlarındaki protein faktörleri için 28 mikrolitre sodyum deoksikolat ve 0.28 mililitre% 10 Triton X-100 ekleyin ve iyice karıştırın.Ardından, kromatini önceden temizlemek için numuneyi 10.000 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı bir tüpe 40 mikrolitre A veya G manyetik boncuk ekleyin. Daha sonra, boncukları 600 mikrolitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın ve boncuklarla birlikte tüpü bir mıknatıs içeren bir rafa aktarın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin.Daha sonra, fosfat tamponlu salini çıkarın ve boncukları 100 mikrolitre fosfat tamponlu salin içinde tekrar süspanse edin. Tüpe, iki ila dört mikrogram antikor ekleyin ve boncuklara antikor bağlanmasını teşvik etmek için dakikada sekiz devirde 40 dakika boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirerek inkübe edin. Ardından, boncukları yıkamak için 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin ekleyin.Yıkadıktan sonra, kromatine bağlı proteinleri immünopresipite etmek için sonikasyonlu kromatin ekstraktını gece boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, boncukları yıkayın ve RIPA tamponu, tuzlu RIPA tamponu, lityum klorür tamponu, Triton X-100 ile Tris-EDTA tamponu ve Tris-EDTA tamponu ile her biri bir döndürücü üzerinde 10 dakika inkübe edin. ChIP için çapraz bağlantıyı çözmek için, boncukları 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponunda yeniden askıya alın.Daha sonra üç mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ve mililitre Proteinaz K başına beş mikrolitre 20 miligram ekleyin ve boncukları gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ertesi gün, tüpleri birkaç kez ters çevirin, manyetik rafta bırakın ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Ardından, 0.5 molar sodyum klorür içeren 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyerek manyetik boncukları yıkayın ve iki süpernatanı birleştirin.CARIP için çapraz bağlantıyı çözmek için, boncukları 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, mililitre Proteinaz K başına üç mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ve beş mikrolitre 20 miligram ekleyin ve boncukları dört ila 12 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Yine, tüpü birkaç kez ters çevirin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için manyetik rafa yerleştirin.Ardından, 0.5 molar sodyum klorür içeren 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyerek manyetik boncukları yıkayın ve ardından iki süpernatanı birleştirin. Son olarak, fenol kloroform izoamil alkol kullanarak RNA örneğini hacimce 25 ila 24 hacimce bir hacim oranında izole edin. Daha sonra, kromatinle ilişkili immünopupipitasyonlu RNA örneğinden DNA'yı çıkarmak için DNaz kullanın.Ardından, CARIP numunesine 10X DNaz tamponu ekleyin ve son hacmi 1X konsantrasyona ayarlayın. Ardından, numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, rastgele heksamer primerlerinin mililitresi başına 10.5 mikrolitre RNA ve üç mikrogramlık bir mikrolitre ekleyerek bir PCR reaksiyonu ayarlayarak ilk tamamlayıcı DNA zincirini sentezleyin.İkincil yapıyı denatüre etmek için, önce tüpü 65 santigrat derecede beş dakika, ardından iki dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından, ana karışımı PCR tüpüne ekleyin ve 25 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Ardından, üst simge iki mikrolitresi başına 200 birimlik bir mikrolitre ekleyin ve termodöngüleyici programını çalıştırın.Tamamlayıcı DNA'nın ikinci zincirini sentezlemek için, reaktifleri, tamponu ve enzimleri ekleyerek buz üzerinde reaksiyonu ayarlayın. Ardından, reaktifleri nazikçe karıştırmak için girdap yapın ve iki saat boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. DNA sentezlendikten sonra, bir PCR saflaştırma kiti kullanarak tamamlayıcı DNA'yı saflaştırın.Daha sonra, çift sarmallı DNA'yı birleştirin, DNA'yı üç kez 10 dakika veya dört kez 10 dakika boyunca 250 ila 500 baz çifti boyutunda paylaşmak için bir su banyosu sonifiyesi ve 1.5 mililitrelik bir tüp kullanın. Ardından kütüphaneyi hazırlayın ve yeni nesil dizileme işlemini gerçekleştirin. Burada, kök hücre kolonilerini görselleştirmek için embriyonik kök hücrelerin faz kontrast görüntüleri yakalandı.Bu protokolde hücreler, hücrelerin farklılaşmasını önlemek için kültür ortamında LIF ve/veya GSK3i ile mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastlarının varlığında veya yokluğunda kültürlendi. Daha sonra, çapraz bağlı embriyonik kök hücre kromatininin sonikasyon verimliliğini görselleştirmek için, sonikasyonlu çift sarmallı DNA% 2'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi. Jel görüntüsü, 200 ila 500 baz çifti aralığında kesilmiş kromatini gösterir.Daha sonra, embriyonik kök hücrelerde histon modifiye edici bir enzimin ve histon modifikasyonlarının genom çapında doluluğunu değerlendirmek için yeni nesil bir dizileme platformu kullanılarak ChIP-Seq kütüphaneleri oluşturuldu ve dizilendi. Özel UCSC tarayıcı görünümünden, zenginleştirilmiş H3K4 trimetilasyonu, H3K4 dimetilasyonu ve KDM5B, çekirdek pluripotentlik düzenleyici geninde, POU5F1'de ve HOXC kümesinde görülebilir. Embriyonik kök hücrelerde kromatinle ilişkili RNA'ları değerlendirmek için CARIP-Seq analizi de yapıldı.Özel UCSC tarayıcı görünümü, embriyonik kök hücrelerde H4K20 trimetilasyon ile ilişkili RNA ve H4K20 trimetilasyon doluluğunu gösterir. CARIP-Seq sonuçlarından, RNA'nın H4K20 trimetilasyonu ile ilişkili olmasına rağmen, belirli lokus ile etkileşime girmeyebileceği yorumlanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, CARIP-Seq kullanarak kromatinle ilişkili RNA'ları nasıl araştıracağınızı ve embriyonik kök hücrelerde küresel ölçekte protein DNA etkileşimlerini nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Bu video, in ovo elektroporasyon ile transfeksiyon sonrası diseke civciv embriyonik omurilik örnekleri üzerinde tüm transkriptom analizi yapmak için temel adımları göstermektedir.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Burada, RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşimlerini yakalamak için RNA ile ilişkili üç boyutlu genom organizasyonunu haritalamak için bir protokol sunuyoruz.

RNA ile İlgili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi

Doğrudan LNCRNA-protein etkileşimlerini tanımlamak için UV tabanlı bir ChIRP yöntemi.

Kültürlenmiş Hücrelerden Fare Testisine Doğrudan Etkileşime Giren Proteinlerin Doğrulanabilir Tanımlanması İçin UV Tabanlı ChIRP Yöntemi

Öğrenin ChIP-Seq ve CARIP-Seq yöntemleriyle embriyonik kök hücrelerde protein-DNA etkileşimlerini ve kromatin ilişkili RNA'ları haritalamayı. Bu teknikler epigenetik araştırmalar için güçlü araçlar sunar.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Daha fazla video keşfet