Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, nöral kas kavşağındaki sinaptik akımları kaydetmek için levator auris longus kasını ve sinirini izole etmektir. Bu yöntem, uç plaka akım boyutu, kuantal içerik, salınım olasılığı ve nörotransmisyon ile kas uyarılabilirliği arasındaki ilişkiler gibi sinaptik fizyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir sinapstan elde edilen ayrıntılı elektrofizyolojik kayıtların, canlı hücre optik deneyleri ile kolayca birleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, sinir ve kas arasındaki sinaptik fonksiyon ve geri bildirim iletişimi hakkında fikir verebilse de, drosophila'dan memelilere kadar diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, memeli sinir kası hazırlığı, özellikle de sinir kırılgan olduğu için mücadele edecektir. Sonraki voltaj kelepçesi verilerini dikkatli bir şekilde elde etmek ve yorumlamak da zor olabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Prosedürü göstermek laboratuvarımdan Steve Burke olacak. Bu işleme başlamak için, stereo-diseksiyon mikroskobu altında, farenin arkasındaki deride kürek kemiği seviyesinde küçük bir kesi yapın.

Bir çift mikrodiseksiyon makası kullanın. Cildi başın ve sırtın üzerinden kesin. Daha sonra, kürek kemiğinin yakınındaki kesi boyunca cildi yukarı çekin.

Sağ kürek kemiğinden başlayarak LAL'den daha düşük olan kasları kesin. Ardından, kesilen dokuyu yavaşça orta hattın hemen sağına kaldırın. Sol LAL'den daha düşük olan birkaç kas katmanını çıkarmak için makasın bıçakları kafatasına bastırılarak sol kulağa doğru bir kesim yapın.

Kulak kanalının etrafını saran ve kulağın medial tarafındaki kaslara giren LAL'i innerve eden siniri kesmekten kaçının. Sinirin mümkün olduğunca çoğunu bağlı tutarak kulak kanalını kesmeye devam edin. Ardından, kulak kanalının arkasındaki yağ dokusunu kulağın ventrolateral kısmı boyunca kesin.

Kası fareden tamamen çıkarmak için sağ tarafta yapılan işlemlere benzer şekilde sol kürek kemiği boyunca kesin. Daha sonra, kulağın kulak kepçesini taban boyunca kesin ve kulağın kıkırdaklı kısmını LAL'e bağlı bırakın. Kası, alt taraf yukarı bakacak şekilde çevirin.

LAL kasını izole etmek için, LAL'i ve çevresindeki dokuyu silikon elastomer tabanlı bir Petri kabına yerleştirin ve diseke edilen dokuyu tabana sabitleyin. Dokuyu sık sık fizyolojik bir tuzlu su çözeltisinde yıkayın. Ardından, hazırlığı yerinde tutmak için kulak kanalına bir böcek iğnesi yerleştirin.

Daha küçük pimler kullanarak, kalan dokuyu LAL'in orta hattının karşı tarafına sabitleyin. Bir çift forseps kullanın. Kası germek için cildi kulağın yan kısmında nazikçe yukarı çekin ve cilde küçük bir iğne yerleştirin.

Mendil tabağa iyice sabitlenene kadar bu adımı tekrarlayın. LAL'i kaplayan ve bağ dokusu yoluyla LAL'e bağlı olan ve özellikle orta hatta yakın olan kasları çıkarın. Daha sonra, üstteki kas tabakasını yukarı çekin ve bıçaklar çekilmekte olan kas tabakasına doğru yönlendirilmiş olarak bağ dokusunu kesin.

Orta hatta giden yolun yaklaşık 3/4'üne kadar orta hatta doğru kesin ve sadece LAL kalana kadar kas katmanlarını çıkarmaya devam edin. Temizleme işlemi sırasında sinirlerin zarar görmediğinden emin olun. Bunu takiben, elektrotların kazınmasına yardımcı olmak için LAL'i kaplayan kalan bağ dokusunun bir kısmını çıkarın.

Sadece işlem sırasında LAL'e zarar verme riski olmadan kolayca yapılabilen dokuyu çıkarın. LAL'i innerve eden siniri tanımlamak için, bir sinir stimülatörü kullanarak, sinir stimülatörü ile sinirlere dokunun. Kas kasıldığında, doğru sinir tanımlanmıştır.

Ardından, sinirin yakınındaki dokuyu dikkatlice tutun ve siniri kulağı çevreleyen dokudan ayırmak için yaylı makas kullanın. Hasarı en aza indirmek için, sinirin çoğunu, daha sonra siniri kayıt kabına sabitlemek için kullanılacak olan bazı çevre dokulara gömülü tutun. Bu noktada, araştırmacı, LAL 20 mililitre veya daha fazla fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile yıkandığı sürece bir saat ara verebilir.

Daha sonra, kasın pimini çıkarın ve elektrofizyoloji deneyleri için diseksiyon mikroskobu altında bir sahne ekine aktarın. Kası uçlarından ve kenarı boyunca sabitleyin. Siniri kas liflerine dik olarak konumlandırın ve sinirin ucunda sağlam kalan fazla dokudan bir miktar fazla doku yoluyla tabağın dibine sabitleyin.

Dokuyu her zaman fizyolojik bir tuzlu su çözeltisinde yıkayın. Elektrofizyoloji deneyi için, perfüzyon odasını LAL ile mikroskop aşamasına sabitleyin. Referans elektrodu, bir agar köprüsü ile kayıt odasına bağlanan üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş bir kaba yerleştirin.

Bu noktada, sinir uyarıcı elektrodu sinirin üzerine yerleştirin. Nöromüsküler kavşak görselleştirmesi için yeterli floresan elde etmek için LAL preparatını 10 dakika boyunca 4-Di-2-Asp'ye maruz bırakın. 10 dakika sonra, 4-Di-2-Asp çözeltisini normal kalsiyum çözeltisi ile değiştirin.

Bu arada, cam kılcal damarları voltaj algılayan ve akım geçiren elektrotlar için uygun solüsyonlarla doldurun. Hava kabarcıklarını gidermek için kılcal damara hafifçe vurun ve doldurulmuş kılcal damarı başlıktaki elektrot tutucusuna sabitleyin.tage. Standart parlak alan ve floresan aydınlatmalı dik bir mikroskop kullanarak, düşük büyütmeli bir su çıkarma hedefi ile hazırlık boyunca kas liflerine dik uzanan parlak bir floresan yeşil nöromüsküler kavşak bandı arayın.

Ardından, elektrofizyoloji ile incelemek için kasın üst tabakasında bir nöromüsküler kavşağı tanımlamak için daha yüksek büyütmeli bir su çıkarma hedefine geçin. Öncelikle parlak alan kullanarak, elektrodu belirlenen nöromüsküler kavşağın 100 mikronu içinde kas zarının üzerine yerleştirin. Bu şekil, 12 haftalık vahşi tip bir R62 fareden alınan akım kelepçesi altında bir LAL fiberden gelen akım darbelerinin ve voltaj tepkilerinin bir örneğini göstermektedir.

Kayıtlar normal fizyolojik tuzlu su çözeltisinde elde edildi ve mEPP'lerin varlığı bu kayıtların motor uç plakasından alındığını gösteriyor. Burada, voltaj kelepçesi koşulu altında elde edilen bir EPC ve iki mEPC'nin temsili bir kaydı bulunmaktadır. Bu şekil, temsili bir fiberden üst üste binen EPC'leri ve mEPC'leri göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, vezikül salınımı alımı veya morfolojik değişiklikler ile ilgili soruları yanıtlamak için FM143 veya histoloji gibi membran boyaları ile canlı hücre görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, fizyoloji alanındaki araştırmacıların drosophila'dan memelilere kadar çeşitli organizmalarda sinaptik iletim ve sinir hücresi iletişimini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, nöromüsküler kavşaktaki sinaptik akımları kaydetmek için innerve levator auris longus kasını nasıl izole edeceğinizi iyi anlamalısınız. Bu prosedürü denerken, LAL'e bitişik kas dokusunun çıkarılmasına ve sinirin izole edilmesine büyük özen göstermeyi unutmamak önemlidir.