Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Bu deneyin genel amacı, belirli nöronların lazer ablasyonunun devre aktivitesi ve davranışı üzerindeki etkisini test etmektir. Bu deneysel teknikle, davranışın altında yatan bir devrede nöronların gerekliliğini inceleyebiliriz. Bu yöntem, avın nasıl algılandığı ve avın yakalanma davranışının sinirsel aktivite tarafından nasıl üretildiği gibi davranış ve sinirbilim alanındaki temel sorularımızı yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, bu nöronların genetik etiketlenmesi ve ayrıca lazerin yüksek uzamsal çözünürlüğü nedeniyle nöronların spesifik olarak kesilebilmesidir. Larvaları yükselttikten ve metin protokolüne göre% 2 düşük erime noktalı agaroza monte ettikten sonra, agaroz gömülü larvaları iki fotonlu lazer tarama mikroskobunun altına yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın. Görüntü alma yazılımını açın ve lazeri açmak için lazer sekmesinin altındaki açma düğmesine tıklayın.

Lazerin durumunun meşgulden kilitli moda geçmesini bekleyin. Kanallar sekmesinde, lazerin dalga boyunu EGFP ablasyonu için 880 nanometre veya GCaMP ablasyonu için 800 nanometre olarak ayarlayın. Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 20X öznel lensi seçin.

Ardından, bul sekmesine tıklayın, optik yolları değiştirmek için GFP'ye tıklayın ve floresanı doğrudan gözle görüntüleyin. Zebra balığı larva beynini görüş alanında ortalayın, ardından iki foton mikroskobuna geri dönmek ve lazer gücünü ve kazancını ayarlamak için edinme sekmesine tıklayın. Ablasyon öncesi koşulun bir kaydı olarak, Z yığını seçeneğini seçmek için Z yığınına tıklayın.

Ardından, larva beyninin ventral ucuna odaklandıktan sonra, alt limiti ayarlamak için önce ayarla düğmesine tıklayın ve beynin en sırt yüzeyine odaklandıktan sonra, üst limiti ayarlamak için son ayarla düğmesine tıklayın. Son olarak, Z yığını görüntü alımını çalıştırmak için denemeyi başlat düğmesine tıklayın. Ardından, lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 63X öznel lensi seçin.

Ardından, epifloresan mikroskobuna geçmek için bul sekmesine tıklayın. Gözle kesilecek hücreleri ortalayın, ardından lazer tarama mikroskobuna geri dönmek için edinme sekmesine tıklayın. Alım modu sekmesinde, çerçeve boyutunu 256 x 256 olarak ayarlayın.

Canlı yayına tıklayın ve ilgilendiğiniz nöronları gözlemleyin. Daha sonra, dorsal en taraftan başlayarak, ablasyon yapılacak hücrelerin odakta olduğu bir odak düzlemi bulun. Bölgeler fonksiyonunu kullanarak, her nöronda hücre boyutunun çapının yaklaşık 1/3'ü kadar küçük dairesel bir alanı ROI olarak işaretleyin.

Tarama hızını 256 x 256 piksel başına 13,9 saniye olarak ayarlayın, bu da piksel başına yaklaşık 200 mikrosaniye veya yarım mikron başına 200 mikrosaniye lazer bekleme süresine karşılık gelir. Ayrıca, yineleme döngüsünü dört tekrara ayarlayın. Zaman serisini ve ağartma işlevlerini yürütmek için denemeyi başlat'a tıklayın.

Hedeflenen hücrelerdeki floresansın gittiğinden emin olmak için ablasyondan önceki görüntüyü zaman serisi döngüsündeki ablasyondan sonraki görüntüyle karşılaştırın. Ardından, odak düzlemini biraz daha derine hareket ettirin ve ablasyona uğramamış hücrelerin göründüğü bir sonraki odak düzlemini seçin. Ağartma işlevini az önce gösterildiği gibi gerçekleştirin ve ilgilenilen nöral yapıdaki tüm hücreler kesilene kadar işlemi tekrarlayın.

Ablasyondan sonra, hücrelerde floresan kaldırılıp kaldırılmadığını kontrol edin ve gerekirse lazer ışınlamasını tekrarlayın. Işınlamayı takiben larvaların geri kazanılması gerekir. Larvaların etrafındaki agarozda dikkatlice küçük dikey kesimler yapın.

Ardından, anestezik etkisini yitirdiğinde balığın agarozdan kendi kendine yüzerek çıkmasını bekleyin. Paramecia'yı kültürledikten ve metin protokolüne göre bir zebra balığı larvasını uyuşturduktan sonra, larvaları %2 düşük erime noktalı agarozun içine yerleştirin ve agarozun yüzeyi hafif dışbükey görünecek şekilde fazla agarozu hemen çıkarın. Bir diseksiyon iğnesi kullanarak larvaları hızlı bir şekilde dik pozisyonda yönlendirin.

Daha sonra, paramesyumun yüzmesi için yer açan zebra balığı kafasının etrafındaki agarozu çıkarmak için cerrahi bir bıçak kullanarak agarozda birkaç küçük kesik yapın. Sistem suyunu hazneye hafifçe dökerek kalan agarozu dikkatlice çıkarın. Ardından, görsel bir uyaran olarak hizmet etmesi için kayıt odasına bir paramesyum koyun.

Ardından kayıt odasını bilimsel bir CMOS kamera ile donatılmış bir epifloresan mikroskobunun altına yerleştirin ve 2.5X objektif lens seçin. Donanımlı kamera için görüntü alma uygulamasını başlatın. Sıra bölmesine tıklayın ve bölmede sabit disk kaydı'nı seçin.

Tarama ayarı bölümünde, kare sayısını 900 veya istenen başka bir toplam kare sayısına ayarlayın. Yakalama bölmesinde, pozlama süresini 30 milisaniye olarak ayarlayın ve gruplamayı ikiye iki olarak ayarlayın. Kamera görünümünde larvaları bulmak ve odaklanmak için yakalama bölmesinde canlı'ya tıklayın ve ardından canlı durdur'a tıklayın ve başlat düğmesine tıklayın.

Filmi cxd formatında kaydedin ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Davranışsal kayıt sistemini kurduktan ve metin protokolüne göre bir larvayı bir kayıt odasına yerleştirdikten sonra, 50 paramecia toplamak için bir mikro pipet kullanın ve bunları kayıt odasına yerleştirin. Kayıt haznesinin üstüne bir kapak fişi yerleştirmek için, hazneye hava girmesini önlemek için kayıt odasının su yüzeyine yerleştirmeden önce kapak fişinin üzerine küçük bir damla su damlatın.

Kayıt odasını aydınlatma sistemine yerleştirin. Ardından, 10 dakika boyunca saniyede 11 kare hızında hızlandırılmış kaydı başlatın. Son olarak, metin protokolüne göre analiz yapın.

Pretektal bölgedeki çekirdekleri ve koku soğanı nöronlarının bir alt popülasyonunu etiketleyen Gal4 hattı ile yapılan bu deneyde. Pretektal nöronlar bilateral olarak lazerle ablasyon yapıldı. Koku alma nöronları kontrol olarak ablasyon yapıldı.

Sonuçlar, iki foton lazerin, bitişik nöritleri etkilenmeden bırakırken hedeflenen hücreleri ablate edebildiğini göstermektedir. Bu deneyde, aksonlarını ipsilateral olarak ILH'ye doğru yansıtan pretektal nöronların fonksiyonel bağlantısı araştırıldı. Hem pretektum hem de ILH, avın proksimal varlığında nöronal aktivite gösterdi, bu da her iki nöronal aktivitenin de görsel olarak yönlendirildiğini düşündürdü.

Kalsiyum görüntüleme ayrıca pretektumdaki nöronal aktiviteyi ve pretektal nöron ablasyonlu larvalardaki ILH'yi gözlemlemek için kullanıldı. Lazerle ablasyon yapılan sol pretektum rezidüel veya hiç nöronal aktivite göstermedi. Ek olarak, ipsilateral ILH, önemli ölçüde yer değiştirmiş nöronal aktivite sergiledi, bu da ILH'nin ana girdisinin ipsilateral pretektumdan geldiğini düşündürdü.

Buna karşılık, lazer ablasyonlu pretektumun diğer tarafındaki ILH, ipsilateral pretektumdaki nöronal aktivite ile karşılaştırılabilir nöronal aktivite gösterdi, bu da sağ ILH'nin sağ pretektumdan girdi aldığını düşündürür. Bir kez ustalaştıktan sonra, her zebra balığı larvası için yaklaşık bir saat içinde lazer ablasyon yapılabilir. Bu prosedürü denerken, lazerin ısı hasarından kaçınarak, uygun lazer ışınlaması ile yalnızca hedeflenen nöronları ablate etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, bu nöronların bilişsel işlevlerde veya motor işlevlerde nasıl yer aldığı gibi ek soruları yanıtlamak için ön beyin veya arka beyin gibi diğer beyin bölgelerindeki nöronların ablasyonu gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, davranışsal sinirbilim alanındaki araştırmacıların zebra balığı modellerinde fonksiyonel sinir devrelerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı larvalarının beynindeki nöronları özel olarak lazerle nasıl ablate edeceğinizi ve işlevsel ve davranışsal sonuçları nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Lazerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü hazırlarken her zaman üreticinin talimatlarına uyun.