Name: Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Öğrenin, iki fotonlu lazerle zebra balığı larvalarında genetik olarak işaretlenmiş nöronları ablasyon yaparak devre aktivitesi ve davranış üzerindeki etkileri nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, nöral devrelerin işlevsel rollerini analiz etmek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmalar MEXT, JSP'ler KAKENHI Grant numaraları JP25290009, JP25650120, JP17K07494 ve JP17H05984 alınan hibe tarafından finanse edilmiştir.

1. bir Subpopulation bir lazer iki fotonlu mikroskop kullanarak nöronların ablasyon
Not: Kullanıcılar Ca görüntüleme aşağıdaki ablasyon edâ planlıyorsanız, UAShspzGCaMP6s satır21kullanın. Kullanıcılar davranış kayıt ablasyon takip edâ planlıyorsanız, ablasyon EGFP pozitif hücrelerinin daha GCaMP6s ifade hücrelerinin gerçekleştirmek kolay olan UAS:EGFP çizgi kullanın.
<ol><li>Etiketler belirlenmesi için belirli sinir hücreleri ve UAS:EGFP ya UAShspzGCaMP6s Gal4 bir satýr çiftleşme kadar ayarlayarak başlar. Sedef homozygotes elde edilebilir için her iki ebeveyn sedefli arka plan kullanmayı unutmayın. Not: Sedef homozygotes yok melanophores vücut yüzeyi (Şekil 1B) içerir. Mevcut çalışma, (ki Pretetto etiketleri) bir Gal4 satır gSAIzGFFM119B ve başka bir Gal4 hattı (hangi ILH etiketleri) hspGFFDMC76A kullanılan21vardır.</li>
	<li>Ertesi gün çiftleşme kurulumu, zebra balığı yumurta toplamak ve onları bu noktada faiz nöronlar floresan gazetecilere ifade edecek larva aşaması için yükseltmek.</li>
	<li>Zebra balığı larva de %2 düşük erime noktası-özel (Şekil 1B) bağlayın.<ol>
<li>%2 özel stok çözelti hazırlama başlayın: 2 g dağıtılması düşük erime noktası özel toz 100 mL sistem su (yani, dolaşımdaki su sisteminde yetişkin zebra balığı korumak için kullanılan su)22 veya E3 su23, su getirerek Kaynama noktası bir mikrodalga ve şiddetle karıştırma için.</li>
		<li>Kaynar kadar % 2 düşük erime noktası özel hisse senedi mikrodalga. 6-cm Petri kabına kapağı üzerine özel 3.5-4.0 mL dökün. Böylece devam etmeden önce dokunmak sıcak özel soğur kadar bekleyin.</li>
		<li>Daha sonra (Bu adımda anestezi değil) tek bir larva özel yerleştirin. Böylece dik, diseksiyon iğne (Şekil 1C), konumu ve larva yönünü ayarlama tutmak larva uygun konumlandırma sağlamak için özel katılaşır kadar. Not: Larva iken özel katılaşır çevresinde yüzerek devam edecektir.</li>
		<li>Larva konumlandırılmış, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme.</li>
		<li>5 mL tricaine çözeltisi (1 x çalışma konsantrasyonu % 0,4) özel dökün. Not: Hareketleri larva tarafından lazer Ablasyon sırasında önlemek için larvalar ablasyon işlemi imzalat tutulması gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir iki fotonlu lazer mikroskobu sisteminde beyazlatma işlevini kullanarak larva ablate.<ol>
<li>Bir iki fotonlu lazer tarama mikroskop altında özel katıştırılmış larva yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın.</li>
		<li>Görüntü alma yazılımı başlatmak ve lazer (Şekil 1D) açmak için "Lazer" sekmesinde "On" düğmesini tıklatın. "Modu-kilitli için." "Meşgul" değiştirmek için lazer "durum" bekleyin</li>
		<li>880 lazer dalga boyu "Kanallar" sekmesinde ayarlanan nm (maksimum güç: Yaklaşık 2300 mW) EGFP ablasyon ya da 800 nm (maksimum güç: yaklaşık 2.600 mW) GCaMP ablasyon için.</li>
		<li>20 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin. "Yerleştirme" sekmesini tıklatın, "GFP" optik yolları değiştirmek ve floresan göz tarafından doğrudan görüntülemek için.</li>
		<li>Zebra balığı larva beyin görüntüleme merkezinde bulun; sonra iki fotonlu mikroskobu geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın.</li>
		<li>'Önce ablasyon' koşulu bir kayıt olarak, bir z-yığın görüntü 20 X objektif lens ile hızlı tarama-(ısı-zarar görmemesi için) hızda al. Daha sonra önce ve sonra ablasyon deneyler (Şekil 2A) çekilen görüntüleri karşılaştırın. "Z-yığın" z-yığın seçeneği seçin ve sonra larva beyin ventral tarafta odaklanarak alt sınırı (tıklayın "ayarla ilk" düğmesi") ve üst sınırı ("Son Set"düğmesini tıklatın) sekmesini genişletmek odaklanan sonra z fiş almak için tıklatın dorsal çoğu yüzey beyin. O zaman, z-yığın resim alma çalıştırmak için "Başlat Experiment" düğmesini tıklatın.</li>
		<li>63 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin.</li>
		<li>Epi-floresan mikroskopi geçiş, görünümü merkezinde göz tarafından ablated için hücreleri bulun, sonra tarama mikroskobu lazer geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın için "Yerleştirme" sekmesini tıklatın.</li>
	</ol></li>
	<li>"Satın alma modu" sekmesinde, "Çerçeve boyutu" 256 x 256 ayarlayın. "Canlı"'yı tıklatın ve nöronlar ilgi gözlemlemek.</li>
	<li>En arka taraftan başlayarak, ablated için hücreleri odakta olan bir odak düzlemi bulmak.</li>
	<li>Küçük, dairesel bir alan "Bölgeler" işlevini kullanarak yaklaşık üçte hücrenin boyutu çapı üzerinde her neuron ilgi (ROI) bir bölge olarak işaretleyin.</li>
	<li>Bir lazer Işınma Zamanı yaklaşık 200 µs/piksel veya 200 µs/0,5 µm için karşılık gelen 13,93 s/256 x 256 piksel (134.42 µm x 134.42 µm), için tarama hızını ayarlar. Ayrıca, 4 tekrar ayarla (' yineleme döngüsü: 4'). Böylece yeterli ablasyon elde alternatif olarak, yineleme ve tarama hızı optimize edin.</li>
	<li>Örnek (öncesi ve sonrası ablasyon) ve '(ROIs ayarlamak için) bölgeleri' veya eşdeğer işlevleri kullanılan yazılım (Şekil 1D) görüntüye ablasyon, 'saat serisi (2 döngüleri)' ile birlikte 'Bleaching' işlevi gerçekleştirir.</li>
	<li>(Önce ablasyon) ilk görüntü ve zaman serisi ikinci resimde (sonra ablasyon) karşılaştırarak döngüsü, beyazlatma, floresan (Şekil 2B) arka plan düzeyinde gözlenen için hedeflenen hücreleri azalır, sonra emin.</li>
	<li>Floresans ablasyon sonra hala varsa, yineleme sayısını artırmak.</li>
	<li>Daha sonra odak düzlemi biraz daha derin (yani, ventral yan doğru) hareket ve nerede un ablated hücreleri görünür sonraki odak düzlemi seçin.</li>
	<li>Ağartma işlevi (yukarıda adım 1.9) açıklandığı gibi yapar. İlgi sinirsel yapısındaki tüm hücreleri ablated kadar bu adımları yineleyin.</li>
	<li>Ablated için sinirsel yapıları kapsayan tüm odak uçaklar gittikten sonra kaldırıldı floresan için hücreleri denetleyin. Bazı hücreler hala nedeniyle yetersiz ablasyon floresan olmak bulunursa, lazer-onları tekrar açıklandığı gibi ışınlatayım.</li>
	<li>Larva özel lazer ile sonra kurtarılan gerekiyorsa, bu larva zarar verebilir çünkü dışında özel güç çalışmayın. Bunun yerine, dikkatle özel larva çevresinde küçük kesim dik onun vücut yüzeyine yapın. Daha sonra anestezik etkisi geçiyor zaman özel dışında kendi yüzmeyi larva için bekleyin.</li>
	<li>Ablasyon için sonraki larva geçin veya denetim başka bir nüfus davranış soruşturma altında ilişki kurmadan nöronların kullanarak deneyler yapmak. Not: Burada, kontrol, UAS:EGFP nöronlarda olfaktör ampul olarak; gSAIzGFFM119B larva lazer ablated-(Şekil 2A, sağ) açıklanan aynı iletişim kuralını kullanarak.</li>
	<li>Birkaç saat veya Ca görüntüleme (Bölüm 2) veya davranış kayıt (Bölüm 3) devam etmeden önce kurtarma için 1 gün izin. Bu kurtarma sırada, larva sağlık (yani, normal spontan yüzme, ablated alan, vbetrafında belirgin hiçbir ısı hasarı) denetleyin ve herhangi bir kötü sağlık belirtileri gösteren larva kaldırın.</li>
</ol>2. kalsiyum görüntüleme Pretetto ablated zebra balığı larva av uyarılmış nöronal etkinliklerini kaydetmek için
<ol><li>Kayıt odası hazırlamak için güvenli-mühür hibridizasyon odası conta yapıştırıcı yüzü cama bakacak şekilde bir cam slayt üzerinde koymak ve en iyi mühür kaldırın. Not: Bu 9 mm jant çapında ve derinlik (Şekil 3A) 0.8 mm bir küçük kayıt odası oluşturur.</li>
	<li>Daha sonra bir naylon mesh yerleştirin (açılış boyutu: 32 µm) kesip alt var bir 50 mL tüp üzerinde. Kap kafes Tube (Şekil 3B) bağlamak için kullanın.</li>
	<li>Paramecia (av larva için görsel uyarıcı kullanılacak olan) hazırlayın. Not: Terliksi Hayvan Kültür (adım 2.3.1 ve 2.3.2) hazırlamak önceden.<ol>
<li>Paramecia tohum kültür ticari kaynakları veya akademik biyo-kaynak merkezleri24 önceden alabilirsiniz.</li>
		<li>Kültür autoclaved pirinç saman ve Pelet kuru bira mayası22 (Şekil 3C) içeren suda birkaç gün Terliksi Hayvan .</li>
		<li>Terliksi Hayvan kültür 2 elekler gittikçe dökün (150 µm diyafram ile bir başka bir 75 µm diyafram ile tarafından takip) enkaz kültür kaldırmak için.</li>
		<li>Paramecia akışı aracılığıyla önceki adımda bir naylon mesh (13-µm diyafram) toplamak.</li>
		<li>Paramecia bir sıkmak şişe sistemi su (Şekil 3D) kullanarak bir cam kabı içine naylon mesh üzerinde yeniden askıya alma.</li>
	</ol></li>
	<li>Kafes (Şekil 3B) (Şekil 3E) x 2 sistem suda yıkayın. Not: Bu adımın amacı da çalışmanın amacı gözlemlemek için görsel olarak nöronal aktivite tahrik olduğu gibi herhangi bir olası odorants ve Terliksi Hayvan kültür ortamı, içerdiği tastants kaldırmaktır.</li>
	<li>Zebra balığı larva tricaine çözüm anestezi için yerleştirin.</li>
	<li>Tek bir larva iken % 2 düşük erime noktası özel olarak bağlayın.<ol>
<li>İlk olarak, % 2 düşük erime noktası özel mikrodalga ve 1/10 birim konsantre tricaine x 10 için özel ekleme.</li>
		<li>Tricaine içeren özel bir damla kayıt odası (Şekil 3A) yerleştirin.</li>
		<li>Onayladıktan sonra özel çok sıcak değil, (Kimden adım 2.5) imzalat larva özel yüzeyi hafif bombeli görünüyor ki hemen aşırı herhangi bir özel kaldırma özel yerleştirin.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde larva dik bir diseksiyon iğnesi (Şekil 1C) gelecek şekilde yönlendirin. Not: Bu yordamları özel katılaşır önce birkaç saniye içinde tamamlanmalıdır.</li>
		<li>Larva şekilde alacak biçimde yerleştirildiğinden, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme. Sonra bir damla 1 x tricaine çözüm özel dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Zebra balığı larva başının etrafında özel kaldırmak ve cerrahi bir bıçak kullanarak yüzmeyi Terliksi Hayvan için yer açın. Bunu yapmak için ilk olarak, özel (Şekil 3F) içinde bir kaç küçük kesim yapmak. Sonra yavaşça odası üzerinde sistem su dökerek aşırı özel dikkatli bir şekilde çıkarın. Not: Bu adımda, tricaine yıkanması.</li>
	<li>Daha sonra bir amip görsel bir uyarıcı hizmet için kayıt odasında koymak. Not: Terliksi Hayvan zebra balığı larva Başkanı yüzer zaman nöronal yanıt (Şekil 3G) uyandırmak.</li>
	<li>Kayıt odası bir epi-floresan mikroskop altında bir bilimsel CMOS Kamera (Şekil 3H) ile donatılmış ve bir 2.5 X objektif lens (Şekil 3ben) seçin.</li>
	<li>GCaMP floresan sinyallerini hızlandırılmış kayıtları toplamak.<ol>
<li>Donanımlı kamera görüntü satın alma uygulamasını başlatın.</li>
		<li>"Sıra bölmesi" ve "Sabit Disk kaydı" üstünde belgili tanımlık cam seçin. Tarama ayarları bölümünde, "çerçeve istenen sayısı" 900 ya da herhangi bir diğer toplam çerçeve numarasına ayarlayın. Not: Varsa, bir modül ile hızlandırılmış kayıt yazılımı kullanır (burada, "Sabit Disk kayıt") sağlayan bir sabit disk üzerine veri verimli kaydetme.</li>
		<li>"Yakalama" Bölmesi'nde, pozlama süresi 2 x 30-ms (yani, 33,3 fps) ve Binning 2 olarak ayarlamak.</li>
		<li>GCaMP benzer uyarma/emisyon spectra GFP için olduğu gibi dokunmatik panel kontrol mikroskobunun GFP için ayarla bir filtre seçin.</li>
		<li>"Live" içinde belgili tanımlık fotoğraf makinesi görünümünü ve odak (Şekil 4A), larva bulun ve sonra "Live durdurmak"'ı tıklatın ve "Başlat" düğmesine tıklayın için yakalama Bölmesi'ni tıklatın. Film .cxd veya satın alma durumu ile ilgili bilgiler başka bir biçimde kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonra kayıtları, hızlandırılmış film Fiji25özgür yazılım kullanarak beyin yapısında ayarlayın yatırım getirisi için Ortalama piksel değerlerini elde ederek GCaMP6s floresan sinyallerini (Ca sinyalleri) analiz. Not: Fiji olduğunu birçok yararlı tapa-içinde ile a yorum-in ImageJ'ın önceden yüklenmiş ve .cxd biçimi görüntü dosyaları ile Bio-oluşum-ebilmek okumak eklentisi.</li>
	<li>Larva biraz kayıt sırasında taşırsanız, Fiji'de TurboReg eklenti26 çalıştırarak görüntü kaydı gerçekleştirmek. Menüden, 'Eklentiler', 'Kayıt' ve 'TurboReg' seçin.</li>
	<li>Nasıl çalışma amacı göre verileri çözümlemek için göz önünde bulundurun. Bir örnek aşağıdadır.<ol>
<li>F/F0 (floresan yoğunluğu tarafından floresan yoğunluğu istirahat veya herhangi bir Ca geçici gerçekleştirilmeden önce bölünmüş her zaman) aşağıdaki gibi hesaplar:</li>
		<li>Ayarla ROIs Pretetto veya ROI Yöneticisi'ni kullanarak ILH: menüde, "Analiz"Araçlar,""ROI Yöneticisi"," seçin ve "Ekle" (Şekil 4A) ROIs listesinde.</li>
		<li>ROIs için Ortalama piksel değerlerini hesaplamak (i.e., floresans yoğunluklarını GCaMP6s in) ROI Yöneticisi panelde seçerek: "Daha fazla," "Çok ölçü" ve "Tamam." Sonuçları bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.</li>
		<li>Sinyalleri gürültülü olarak, sinyalleri 11 saat-elektronik tablo verilerini işleyen bir Web uygulaması kullanarak puan (hareketli ortalama) için Ortalama.</li>
		<li>F (zamanla yoğunluklarda floresan) F0 tarafından bölmek (floresan yoğunluğu bazal düzeyinde) normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplamak için. Veri görselleştirme, örneği değiştikçe normalleştirilmiş GCaMP6s floresan yoğunluğu Pretetto ve ILH renk kodlu ve Terliksi Hayvan yörüngeler (Şekil 4B - D) eşleştirilmiş.</li>
	</ol></li>
</ol>3. lazer ablasyon aşağıdaki davranış sonuçları değerlendirilmesi
<ol><li>Bir video kamera ile donatılmış bir stereoscope oluşan bir davranış kayıt sistemi ayarlayın. Bir fotoğraf makinesi bir uygun görüntü alma yazılımı ile ticari veya özel yapım (Şekil 5A) kullanın.</li>
	<li>Aydınlatma koşulu Terliksi Hayvan görüntü işleme tarafından tespit edilebilir en iyi duruma. Örneğin, bir yüzük beyaz LED ışık bir ile (Şekil 5B) kullanılmalıdır. Not: Mesafe ve açısını, LED örnek (yani, karanlık arka planda parlak veya parlak arka planda karanlık) ve vardır, bu nedenle, başarılı görüntü işleme için kritik görünümünü etkiler. Rondela (Şekil 5C) en iyi yüksekliğini belirler.</li>
	<li>(Bölüm 1'de açıklanan lazer ablasyon deneme kurtarılan) bir zebra balığı larva (hangi bir cam slayt için bağlı olduğu) bir davranış kayıt odası kaldırıldı orijinal en iyi mühür ile (Şekil 5D) yerleştirin.</li>
	<li>50 paramecia Kültür (adım 2.3.5) toplamak bir micropipette kullanarak ve kayıt odasına koyun.</li>
	<li>Bir kapak notu kayıt odası üstüne yerleştirin. Küçük bir damla su ile ilgili kapak formu hava odasında tanıtımı önlemek için kayıt odası su yüzeyinde yerleştirmeden önce koymak. Not: Bu adımda, biraz su paramecia ile kayıt odasından taşma. Paramecia kayıt odasında kalan sayısı yaklaşık 30-40 olacak.</li>
	<li>(Bir larva ve parameciaiçeren) kayıt odası aydınlatma sistemi (Şekil 5D) yerleştirin.</li>
	<li>11 dk (6600 çerçeveler) için 10 kare/sn, hızlandırılmış kaydını Başlat seçimini yapın.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Davranış için test edildi her larva için lazer ablasyon (yani, devamsızlık veya önemli ölçüde azaltılmış sayısı, floresan hücreleri etkinliğini doğrulamak için floresan mikroskopi tarafından lazer ablated alanlarda floresans gözlemlemek Lazer ışınlanmış alan). Not: Işınlama sonra bile, floresan bazı hücreler hala daha sonra Gal4 gen ekspresyonu ablasyon27sonra Ayrıştırılan hücrelerdeki başlangıçlı nedeniyle görülebilmektedir.</li>
	<li>Larva'nın davranışı, tekdüzelik arka planda eksikliği telafi etmek için kaydettikten sonra her kare piksel piksel bölünmesi Fiji ortalama bir görüntü yerine getirilir: 'Süreç 'Görüntü hesap makinesi',' tıklayın ' işlemi: bölmek ', ' 32-bit (float) sonuç ', ve ' Tamam '. Ortalama bir resim yapmak, 'Resim', 'Yığar', 'Z-projesi', 'Ortalama yoğunluğu' ve 'OK' (Şekil 5E, F)'ı tıklatın.</li>
	<li>Paramecia sayısı 'Analiz 'Parçacıklar analiz',' ı tıklatarak odasında yaptı sayısı tüm paramecia, kapsayan bir alan aralığı ayarını 'Gösteri: maskeler' onay kutusunu kontrol ve 'Tamam' tıklatın. 'Show: maskeler' seçeneği ayıklanan paramecia görüntüyle (Şekil 5G), parçacıklar (paramecia) her kare sayısı listesini sağlar.</li>
	<li>Paramecia sol kayıt odasında sayısı zaman içinde arsa. Paramecia sayısı tahminleri gürültülü olduğu için hareketli ortalama 600 kare (1 dk) elektronik tablo bir aralıktaki her noktasında yapmak tavsiye.</li>
</ol>

<ol><li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+whole+picture%3A+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li>
<li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li>
<li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li>
<li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li>
<li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li>
<li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence%3A+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86(2013).</li>
<li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015(2016).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li>
<li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878(2014).</li>
<li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit%27s+Functional+Adaptations+for+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li>
<li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li>
<li>Ewert, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642675027">Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029(2017).</li>
<li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>National BioResource Project Paramecium. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en">http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-%2C+neuroD+%28nrd%29-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar raporlanacak hiçbir çıkar çatışması var.

İki fotonlu lazer özellikle bireysel nöronlar ablate için mükemmel bir uzaysal çözünürlük olmasına rağmen ısı nedeniyle beyin dokusu üzerinde istenmeyen herhangi bir zarar vermemek için çok dikkatli alınmalıdır. Ablasyon deney konusunda en önemli adım lazer ile en uygun miktarda tespit etmektir. Yetersiz ışınlama nöronlar öldürmek başarısız olur. Çok fazla ışınlama istenmeyen etkileri neden olur çevreleyen doku ısı-hasar olacak. Lazer ile (ROIs, yinelemeler ve tarama hızı alanları) optimum aralığı dar gibi görünüyor. Bir...

Nasıl davranış beyinde nöronal aktivite doğar anlamak için bu davranışı üretimi söz konusu sinir devreleri tanımlamak gereklidir. Küçük, şeffaf beyinleri geniş bir alanda hücresel çözünürlükte nöronal aktivite araştırmak olanak sağlar çünkü beyin fonksiyonu eğitim davranışı ile ilişkili larva aşamasında, zebra balığı ideal bir hayvan modeli sağlar. davranış1gözlem sırasında beyin. Görüntüleme belirli nöronlar nöronal faaliyete GCaMP2gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum (Ca) göstergeleri (turk) icadı sayesinde mümkün olmuştur. GCaMP transgenik zebra balığı işlevsel sinir devre davranışı ile hayvanlar3davranışlar içinde Ca görüntüleme yaparak ilişkilendirmek için yararlı olması için kanıtlanmış.
CA görüntüleme nöronal aktivite ve davranışı arasındaki bağıntıları kanıtlamanın, nedensellik, göstermek için nöronal aktivite ve onun consequence(s) davranışı üzerinde test bastırılması iken önemli adımlar. Bunu sağlamanın çeşitli yolları vardır: belirli sinir devreleri4, nörotoksinler belirli nöronlar5,6, halorhodopsin7gibi optogenetic araçların kullanımını ifade değiştirir genetik mutasyonun kullanın ve Lazer ablasyon hedeflenen nöronlar8,9. Lazer ablasyon belirli nöronlar nispeten az sayıda etkinliğinde ortadan kaldırılması için özellikle uygundur. Geri dönüşü olmayan sinir hücreleri öldürmek tarafından nöronal aktivite kaldırılması davranış sonuçları değerlendirilmesi kolaylaştırır.
Zebra balığı larva safhasında gözlenen bir ilginç av yakalama (Şekil 1A) davranıştır. Bu görsel olarak destekli, hedefe yönelik davranış olumlu bir deneysel sistem görme keskinliği10, visuomotor dönüştürme11,12,13, görsel algı ve tanınması için çalışma sağlar. nesneleri14,15,16,17,18ve karar verme19. Nasıl yırtıcı yırtıcı ve AVI algılama av nasıl yol açar tarafından davranış yakalamak neuroethology20merkezi bir soru olmuştur kabul edilmektedir. Bu yazıda, Pretetto çekirdeğinde projeksiyonları tarafından kurulan pretecto-hipotalamik devre rolü ele (çekirdek pretectalis superficialis pars magnocellularis, bundan sonra sadece Pretetto kaydetti) için ILH. Lazer-ablasyon Pretetto, av yakalama etkinliğini azaltmak ve nöronal visual av algı21ile ilişkili ILH etkinliğinde kaldırılması gösterilmiştir. Burada, yerine getirmek için kullanılan iletişim kuralları lazer ablasyon ve onun etkisi Ca2 + görüntüleme ve davranış kayıt içinde zebra balığı larva açıklanmıştır kullanarak test.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agaroz</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>düşük erime sıcaklıklı agaroz</td></tr><tr><td>6 cm petri kabı</td><td>FALCON</td><td>Ürün#:351007</td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon iğnesi</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. No. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>iki fotonlu lazer tarama mikroskobu</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X objektif lens</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>bir epi-floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Konfokal mikroskoplar için görüntü elde etme yazılımı</td></tr><tr><td>Güvenli Contalı Hibridizasyon Odası Contası, 8 odacıklı, 9 mm çap x 0,8 mm derinlik</td><td>Moleküler Problar</td><td>Katalog # S-24732</td><td>Ca görüntülemede kayıt odası olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Görüntüleme Odaları</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Görüntüleme Odaları PCI-A-2.5</td><td>Davranışsal kayıt odası olarak kullanılır</td></tr><tr><td>cerrahi bıçak</td><td>MANI</td><td>Oftalmik bıçak MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>modeli: C11440-22CU</td><td>bilimsel bir CMOS kamera</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>görüntü acuisition yazılımı</td></tr><tr><td>Sabit Disk Kayıt modülü</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Film dosyalarını kısa sürede bir sabit disk sürücüsüne kaydetmeyi sağlayan bir yazılım modülü</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>stereoskop</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td> için objektif lens<td>Ürün No. GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS kamera</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ kamera</td><td>XIMEA</td><td>Ürün No. MQ042RG-CM</td><td>CMOS kamera</td></tr><tr><td>bir halka LED ışık</td><td>CCS</td><td>Model: LDR2-100SW2-LA</td><td>Beyaz LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naylon örgü 32 ve mikro; m</td><td>Tokyo Ekran</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Naylon örgü 13 ve mikro; m</td><td>Tokyo Ekran</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Metal seive 150 mikron diyafram açıklığı</td><td>Tokyo Ekran</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metal seive 75 mikron diyafram açıklığı</td><td>Tokyo Ekran</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Gıda & Sağlık Hizmetleri, Ltd. Şti.</td><td></td><td>kuru bira mayası</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td>, Mai-Tai HP Spectra <td>Physics'i programlamak için entegre bir geliştirme ortamı</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td></td><td>iki fotonlu lazer&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Bir subpopulation davranış nöronların rolü tanımlamak için faaliyete yaşayan hayvanlarda engelleme sonuçlarını test etmek esastır. Ne zaman sinir hücreleri seçerek floresan problar ile etiketlenir lazer ablasyon nöronların bu amaç için etkili bir yöntemdir. Bu da çalışmanın, bir subpopulation iki fotonlu mikroskop kullanarak ve onun işlevsel ve davranışsal sonuçları test nöronların ablating lazer protokollerde açıklanmıştır. Bu çalışmada, zebra balığı larva'av yakalama davranışı bir çalışma modeli kullanılır. Pretecto-hipotalamik devre davranış bulaşıcı görsel olarak tahrik av altında yatan olduğu bilinmektedir. Zebra balığı Pretetto lazer ablated ve hipotalamus (ILH; pretectal projeksiyon hedef) alt lob nöronal aktivite incelenmiştir. Av yakalama davranışı pretectal ablasyon sonra da test edildi.

Belirli nöronlar genetik olarak EGFP ya da GCaMP6s Ifade Gal4 satırlarında tahrik, etiketlenmiş. Gal4 hattı gSAIzGFFM119B bir çekirdek pretectal alanında (magnocellular yüzeysel pretectal çekirdeği), hem de bir subpopulation olfaktör ampul nöronların etiketlemek için kullanıldı. Başka bir Gal4 satır, hspGFFDMC76A, ILH etiketlemek için kullanıldı. Biz lazer-pretectal nöronlar bilateral ablated (resim 2A sol paneli) ve aynı zamanda nöronların o...

Burada, zebra balığı larvaları üzerinden bir iki fotonlu lazer nöronların genetik olarak etiketlenmiş bir subpopulation ablate için bir protokol mevcut.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Bu deneyin genel amacı, belirli nöronların lazer ablasyonunun devre aktivitesi ve davranışı üzerindeki etkisini test etmektir. Bu deneysel teknikle, davranışın altında yatan bir devrede nöronların gerekliliğini inceleyebiliriz. Bu yöntem, avın nasıl algılandığı ve avın yakalanma davranışının sinirsel aktivite tarafından nasıl üretildiği gibi davranış ve sinirbilim alanındaki temel sorularımızı yanıtlamaya yardımcı olabilir.Bu tekniğin ana avantajı, bu nöronların genetik etiketlenmesi ve ayrıca lazerin yüksek uzamsal çözünürlüğü nedeniyle nöronların spesifik olarak kesilebilmesidir. Larvaları yükselttikten ve metin protokolüne göre% 2 düşük erime noktalı agaroza monte ettikten sonra, agaroz gömülü larvaları iki fotonlu lazer tarama mikroskobunun altına yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın. Görüntü alma yazılımını açın ve lazeri açmak için lazer sekmesinin altındaki açma düğmesine tıklayın.Lazerin durumunun meşgulden kilitli moda geçmesini bekleyin. Kanallar sekmesinde, lazerin dalga boyunu EGFP ablasyonu için 880 nanometre veya GCaMP ablasyonu için 800 nanometre olarak ayarlayın. Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 20X öznel lensi seçin.Ardından, bul sekmesine tıklayın, optik yolları değiştirmek için GFP'ye tıklayın ve floresanı doğrudan gözle görüntüleyin. Zebra balığı larva beynini görüş alanında ortalayın, ardından iki foton mikroskobuna geri dönmek ve lazer gücünü ve kazancını ayarlamak için edinme sekmesine tıklayın. Ablasyon öncesi koşulun bir kaydı olarak, Z yığını seçeneğini seçmek için Z yığınına tıklayın.Ardından, larva beyninin ventral ucuna odaklandıktan sonra, alt limiti ayarlamak için önce ayarla düğmesine tıklayın ve beynin en sırt yüzeyine odaklandıktan sonra, üst limiti ayarlamak için son ayarla düğmesine tıklayın. Son olarak, Z yığını görüntü alımını çalıştırmak için denemeyi başlat düğmesine tıklayın. Ardından, lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 63X öznel lensi seçin.Ardından, epifloresan mikroskobuna geçmek için bul sekmesine tıklayın. Gözle kesilecek hücreleri ortalayın, ardından lazer tarama mikroskobuna geri dönmek için edinme sekmesine tıklayın. Alım modu sekmesinde, çerçeve boyutunu 256 x 256 olarak ayarlayın.Canlı yayına tıklayın ve ilgilendiğiniz nöronları gözlemleyin. Daha sonra, dorsal en taraftan başlayarak, ablasyon yapılacak hücrelerin odakta olduğu bir odak düzlemi bulun. Bölgeler fonksiyonunu kullanarak, her nöronda hücre boyutunun çapının yaklaşık 1/3'ü kadar küçük dairesel bir alanı ROI olarak işaretleyin.Tarama hızını 256 x 256 piksel başına 13,9 saniye olarak ayarlayın, bu da piksel başına yaklaşık 200 mikrosaniye veya yarım mikron başına 200 mikrosaniye lazer bekleme süresine karşılık gelir. Ayrıca, yineleme döngüsünü dört tekrara ayarlayın. Zaman serisini ve ağartma işlevlerini yürütmek için denemeyi başlat'a tıklayın.Hedeflenen hücrelerdeki floresansın gittiğinden emin olmak için ablasyondan önceki görüntüyü zaman serisi döngüsündeki ablasyondan sonraki görüntüyle karşılaştırın. Ardından, odak düzlemini biraz daha derine hareket ettirin ve ablasyona uğramamış hücrelerin göründüğü bir sonraki odak düzlemini seçin. Ağartma işlevini az önce gösterildiği gibi gerçekleştirin ve ilgilenilen nöral yapıdaki tüm hücreler kesilene kadar işlemi tekrarlayın.Ablasyondan sonra, hücrelerde floresan kaldırılıp kaldırılmadığını kontrol edin ve gerekirse lazer ışınlamasını tekrarlayın. Işınlamayı takiben larvaların geri kazanılması gerekir. Larvaların etrafındaki agarozda dikkatlice küçük dikey kesimler yapın.Ardından, anestezik etkisini yitirdiğinde balığın agarozdan kendi kendine yüzerek çıkmasını bekleyin. Paramecia'yı kültürledikten ve metin protokolüne göre bir zebra balığı larvasını uyuşturduktan sonra, larvaları %2 düşük erime noktalı agarozun içine yerleştirin ve agarozun yüzeyi hafif dışbükey görünecek şekilde fazla agarozu hemen çıkarın. Bir diseksiyon iğnesi kullanarak larvaları hızlı bir şekilde dik pozisyonda yönlendirin.Daha sonra, paramesyumun yüzmesi için yer açan zebra balığı kafasının etrafındaki agarozu çıkarmak için cerrahi bir bıçak kullanarak agarozda birkaç küçük kesik yapın. Sistem suyunu hazneye hafifçe dökerek kalan agarozu dikkatlice çıkarın. Ardından, görsel bir uyaran olarak hizmet etmesi için kayıt odasına bir paramesyum koyun.Ardından kayıt odasını bilimsel bir CMOS kamera ile donatılmış bir epifloresan mikroskobunun altına yerleştirin ve 2.5X objektif lens seçin. Donanımlı kamera için görüntü alma uygulamasını başlatın. Sıra bölmesine tıklayın ve bölmede sabit disk kaydı'nı seçin.Tarama ayarı bölümünde, kare sayısını 900 veya istenen başka bir toplam kare sayısına ayarlayın. Yakalama bölmesinde, pozlama süresini 30 milisaniye olarak ayarlayın ve gruplamayı ikiye iki olarak ayarlayın. Kamera görünümünde larvaları bulmak ve odaklanmak için yakalama bölmesinde canlı'ya tıklayın ve ardından canlı durdur'a tıklayın ve başlat düğmesine tıklayın.Filmi cxd formatında kaydedin ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Davranışsal kayıt sistemini kurduktan ve metin protokolüne göre bir larvayı bir kayıt odasına yerleştirdikten sonra, 50 paramecia toplamak için bir mikro pipet kullanın ve bunları kayıt odasına yerleştirin. Kayıt haznesinin üstüne bir kapak fişi yerleştirmek için, hazneye hava girmesini önlemek için kayıt odasının su yüzeyine yerleştirmeden önce kapak fişinin üzerine küçük bir damla su damlatın.Kayıt odasını aydınlatma sistemine yerleştirin. Ardından, 10 dakika boyunca saniyede 11 kare hızında hızlandırılmış kaydı başlatın. Son olarak, metin protokolüne göre analiz yapın.Pretektal bölgedeki çekirdekleri ve koku soğanı nöronlarının bir alt popülasyonunu etiketleyen Gal4 hattı ile yapılan bu deneyde. Pretektal nöronlar bilateral olarak lazerle ablasyon yapıldı. Koku alma nöronları kontrol olarak ablasyon yapıldı.Sonuçlar, iki foton lazerin, bitişik nöritleri etkilenmeden bırakırken hedeflenen hücreleri ablate edebildiğini göstermektedir. Bu deneyde, aksonlarını ipsilateral olarak ILH'ye doğru yansıtan pretektal nöronların fonksiyonel bağlantısı araştırıldı. Hem pretektum hem de ILH, avın proksimal varlığında nöronal aktivite gösterdi, bu da her iki nöronal aktivitenin de görsel olarak yönlendirildiğini düşündürdü.Kalsiyum görüntüleme ayrıca pretektumdaki nöronal aktiviteyi ve pretektal nöron ablasyonlu larvalardaki ILH'yi gözlemlemek için kullanıldı. Lazerle ablasyon yapılan sol pretektum rezidüel veya hiç nöronal aktivite göstermedi. Ek olarak, ipsilateral ILH, önemli ölçüde yer değiştirmiş nöronal aktivite sergiledi, bu da ILH'nin ana girdisinin ipsilateral pretektumdan geldiğini düşündürdü.Buna karşılık, lazer ablasyonlu pretektumun diğer tarafındaki ILH, ipsilateral pretektumdaki nöronal aktivite ile karşılaştırılabilir nöronal aktivite gösterdi, bu da sağ ILH'nin sağ pretektumdan girdi aldığını düşündürür. Bir kez ustalaştıktan sonra, her zebra balığı larvası için yaklaşık bir saat içinde lazer ablasyon yapılabilir. Bu prosedürü denerken, lazerin ısı hasarından kaçınarak, uygun lazer ışınlaması ile yalnızca hedeflenen nöronları ablate etmeyi unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, bu nöronların bilişsel işlevlerde veya motor işlevlerde nasıl yer aldığı gibi ek soruları yanıtlamak için ön beyin veya arka beyin gibi diğer beyin bölgelerindeki nöronların ablasyonu gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, davranışsal sinirbilim alanındaki araştırmacıların zebra balığı modellerinde fonksiyonel sinir devrelerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı larvalarının beynindeki nöronları özel olarak lazerle nasıl ablate edeceğinizi ve işlevsel ve davranışsal sonuçları nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.Lazerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü hazırlarken her zaman üreticinin talimatlarına uyun.

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Bu videoda av yakalama testi anlatılmaktadır. Video, belirli nöronların lazer ablasyonundan sonra zebra balığı larvalarının av yakalama davranışını inceleme yöntemini tartışıyor.

Av Yakalama Deneyi: Zebra Balığı Larvalarının Av Yakalama Davranışını İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, iki foton lazer aksotomi kullanarak ve yaralanmadan aksonal iyileşmeyi gözlemleyerek zebra balığı embriyolarında aksonları yaralama yöntemini açıklamaktadır.

İki Fotonlu Lazer Aksotomi: Zebra Balığı Embriyolarında Aksonları Yaralamak ve Aksonal İyileşmeyi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu video, floresan kalsiyum indikatör komplekslerini eksprese eden nöronları ile kalsiyum indikatör tabanlı floresan görüntüleme kullanarak transgenik zebra balığı larvalarında görsel av tespitini inceleme yöntemini göstermektedir.

Transgenik Zebra Balığı Larvasında Av Tarafından Uyarılan Nöronal Aktivitenin İncelenmesi

Source: Morsch, M.,  vd. al., Konvansiyonel UV Lazer Konfokal Mikroskopi Kullanarak Hücre Stresini ve Ölümünü Tetikleme. J. Vis. Exp. (2017) Bu videoda, transgenik zebra balıklarında tek tek nöronları hassas bir şekilde hedeflemek ve incelemek için yüksek yoğunluklu UV lazer ablasyon tekniğini keşfediyoruz. Yaralanma ve iyileşmenin hücresel dinamiklerini vurgulayarak nöronal tepkilerin nasıl hazırlanacağını, hareketsiz hale getirileceğini ve görselleştirileceğini gösteriyoruz.

Konfokal Mikroskop Kullanılarak Zebra Balığı Larvasında Seçici Tek Nöron Lazer Ablasyonu

Source: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Bu videoda, agarozla hareketsiz hale getirilmiş zebra balığı larvalarında floresan nöronların seçici olarak yok edilmesini sağlayan iki fotonlu bir lazer ablasyon prosedürü gösterilmektedir. İşlemden önce ve sonra...

Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Burada, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Davranan Yetişkin Zebra Balıklarında Ön Beyin Aktivitesinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi

Bu protokol, zebra balığı larvalarında gerçekleştirilen ve kemik rejenerasyonunu ve ablasyona karşı bağışıklık tepkisinin etkilerini incelemek için bir model görevi gören iki fotonlu bir lazer ablasyon yaklaşımını tanımlar.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Öğrenin, iki fotonlu lazerle zebra balığı larvalarında genetik olarak işaretlenmiş nöronları ablasyon yaparak devre aktivitesi ve davranış üzerindeki etkileri nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, nöral devrelerin işlevsel rollerini analiz etmek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma (Video) | JoVE Journal

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Daha fazla video keşfet