İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

Bu prosedürün genel olarak, sonuçta fonksiyonel CFTR çalışmaları için bir test olarak kullanılabilecek insan burun hücresi sferoidleri oluşturmaktır. Bu yöntem, kistik fibroz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin bireysel bir deneğin ex vivo model sisteminde CFTR'yi değiştiren ilaçlara verdiği yanıtı değerlendirmek gibi. Bu tekniğin ana avantajı, küçük bir burun hücresi örneğinden nispeten hızlı bir zaman diliminde çok sayıda sferoidin üretilmesi ve kapsamlı testlere izin vermesidir.

Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan teknisyenler olan Lauren Strecker ve Jessica Moncivaiz olacak. İnsan Nazal Epitel veya HNE hücrelerini metin protokolüne göre besleyici fibroblastlar üzerinde işledikten ve genişlettikten sonra, önceden hazırlanmış genleşme ortamını, farklılaşma ortamını,% 0.1 Tripsin EDTA çözeltisini ve steril PBS'yi 30 dakika boyunca oda sıcaklığına getirin. Daha sonra kapları temizlemek için %70 etanol kullanın ve temiz bir biyogüvenlik kabinine aktarın.

Biyogüvenlik kabininde, ortamı HNE kültüründen aspire etmek ve atmak için bir vakum hattına bağlı bir Pasteur pipeti kullanın. Daha sonra temiz bir serolojik pipetle, tamponu ekleyerek, döndürerek ve aspire ederek bulaşığı yıkamak için beş mililitre PBS kullanın. Kültüre beş mililitre% 0.1 Tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca% 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre geri koyun.

Daha sonra dört ila 10X'te ters çevrilmiş bir mikroskop altında, hücrelerin tabaktan ayrıldığını, yuvarlaklaştığını ve yüzdüğünü kontrol edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için kültür kabının yan tarafına hafifçe vurun ve gerekirse, çoğu hücre ayrılana kadar kabı beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, tabağa beş mililitre genleşme ortamı ekleyin ve tüm sıvıyı etiketli steril 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın.

Hücreler üç tur tripsinizasyondan sonra kültür kabına yapışık kalırsa, kalan hücreleri nazikçe serbest bırakmak için steril bir hücre kazıyıcı kullanın ve beş mililitre genleşme ortamı ile sıyırıcıyı ve kabı yıkayın ve içeriği aynı etiketli konik tüpte toplayın. Tüpü beş dakika boyunca dört santigrat derecede 360 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini yeniden süspanse etmek için bir mililitre genleşme ortamı kullanın.

Ardından hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Bodrum membran matrisini üreticinin talimatlarına göre buz üzerinde çözdürün. Matrisin mililitresi başına 500.000 hücrelik bir nihai konsantrasyon için uygun sayıda diferansiyel olarak tripsinlenmiş geçiş hücresini ayırın.

Dört oyuklu bir plaka için 200.000 hücre kullanın ve bunları 1.5 mililitrelik bir tüpe toplayın. Daha sonra, hücre karışımını beş dakika boyunca 360 defadan fazla olmayan bir sıcaklıkta santrifüjleyin. Daha sonra bir mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı tamamen ve dikkatlice aspire edin ve atın.

Aktif olarak kullanmadığınız zamanlarda hücre tüpünü buz üzerinde tutun. Hücrelere planlanan kuyucuk başına 100 mikrolitre bazal membran matrisi eklemek için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Hava kabarcıklarının girmesini önlemek için pipet ucunu tamamen boşaltmazken, hücreleri dikkatli ve kapsamlı bir şekilde yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Matrisin katılaşmasını önlemek için hızlı hareket edin. Dört oyuklu bir IVF kültür plakasının her bir oyuğuna 100 mililitrelik matris alikotları tohumlamak için, distali 200 mikrolitrelik bir pipet ucundan üç ila dört milimetre kesmek için temiz bir makas kullanın. Her bir kuyucuğun ortasına 100 mikrolitrelik bir hücre matris karışımı damlasını dikkatlice ve yavaşça pipetleyin, damlanın küresel kaldığından ve kuyunun kenarlarına temas etmediğinden emin olun.

Plakayı katılaşana kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Ardından, matris düşüşünü bozmamaya dikkat ederek her bir oyuğa 500 mikrolitre farklılaşma ortamını dikkatlice pipetleyin. Ortamın sadece damlayı kapladığından emin olun ve gerekirse daha fazlasını ekleyin.

HNE sferoidlerini kültürlemek için, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, sferoidleri yok edecek matristen kaçınırken tüm ortamı kuyudan nazikçe aspire edin. Daha sonra yeni bir mililitrelik pipet ucuyla ve matrise dokunmaktan veya rahatsız etmekten kaçınırken, matrisin etrafındaki kuyuya nazikçe 500 mikrolitre farklılaştırma ortamı ekleyin. Sferoidleri inkübe etmeye devam edin, farklılaşma ortamını az önce gösterildiği gibi haftada üç kez değiştirin.

20X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında, küresel morfolojiyi günlük olarak değerlendirin. Sferoidler, kaplamadan sonraki üç ila beş gün içinde oluşmalı ve yaklaşık 10 gün içinde olgunluğa ulaşmalıdır. HNE'ler kültür kabına yapışmalı ve tohumlamadan sonraki 72 saat içinde küçük adalar oluşturmalıdır.

Bir haftada iyi ve kötü ada oluşumu örnekleri burada gösterilmektedir. Adalar, 15 ila 30 gün boyunca yemeği kaplayacak şekilde genişlemelidir. Kültürün ilk üç ila dört günü içinde, matrikste küçük kistik yapılar oluşmaya başlamalı ve yaklaşık 10 gün içinde olgunlaşmalıdır.

Tarif edilen yoğunlukta kaplanırsa, başarılı kültürler matris damlası başına 50 ila 100 sferoid içerecektir. Lümenler, vahşi tip CFTR'de olduğu gibi nispeten açık olabilir veya CF sferoidlerinde olduğu gibi hücresel kalıntı ve mukus ile dolu olabilir. Spheroidlerin luminal alanını tanımlamak için maskeleme bu iki panelde gösterilmiştir.

Burada kötü oluşmuş başarısız sferoid kültürlerin örnekleri gösterilmektedir. Fonksiyonel tahlillerden elde edilen bu grafiklerde gösterildiği gibi, vahşi tip CFTR'li deneklerden alınan sferoidler, uyarıldığında bir saatten fazla şişmeli ve CFTR inhibitörü inh-172 varlığında uyarılırsa daha az şişmeli veya küçülmelidir. F508del-CFTR için homozigot bir denekten alınan sferoidler, CFTR modülatörleri VX809 ve VX770 ile farmakolojik olarak düzeltildiğinde artan şişme ile çok az büzülmeli veya daha az büzülmelidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, nazal hücre sferoidlerinin tohumlanması, uygun şekilde yapılırsa 15 ila 20 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numune kontaminasyon riskini en aza indirmek ve kendi sağlığınıza yönelik herhangi bir riskten kaçınmak için biyogüvenlik kabini içinde temiz işletim prosedürlerini sürdürmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre morfolojisi ve bileşimi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için fiksasyon, boyama ve mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, CFTR fonksiyonunun kişiselleştirilmiş bir tahlili olarak kullanılabilecek birincil insan burun hücresi sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Birincil insan dokuları ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.