Name: Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Öğrenin, tebufenozid ile transgen ifadesini HEK 293 hücrelerinde hassas şekilde kontrol etmeyi. Bu yöntem, hücre ve moleküler biyolojide gen düzenleme çalışmaları için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar S-İ Choi (Chonnam National University) değerli yorum ve bizim el yazması ayrıntılı okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Chungnam Ulusal Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>Bir uygun restriksiyon enzimi tanıma sitesi (veya site) pEUI(+) MCS içinde seçin ve istenilen yönde (şekil 1) faiz gene subclone. Not: EGFP veya bayrak epitope öğesini ankyrin tekrar etki alanı 13A (ANKRD13A) transgene T4 DNA polimeraz bir sıra ve ligasyonu yöntem19klonlama bağımsız olarak kullanarak pEUI(+) vektör EcoRI sitedeki subcloned.</li>
	<li>37 ° C'de 1 h için EcoRI ile pEUI(+) linearize Mix 50 ng/µL olan pEUI(+) ile 40 ng/µL PCR güçlendirilmiş EGFP veya ANKRD13A, doğrusallaştırılmış ve T4 DNA polimeraz (1 U) önce 10 dakika süreyle buzda kuluçka (RT) oda sıcaklığında 1 dk ile reaksiyon karışıma doğrudan 100 µL eklemek 10 µL tepki DH10B yetkili hücreleri aşağıdaki dönüştürme için denemeler yapın. Not: her ne kadar birkaç restriksiyon enzimi tanıma sitesi pEUI(+) (şekil 1B) MCS eklenmiş, hedef gen EcoRI siteye subcloning tüp ligasyonu bağımsız klonlama teknolojisi19,20kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Sıralama tarafından INSERT doğrulayın ve sonra transfection için uygun olan bir DNA arıtma kit kullanarak DNA arındırmak.</li>
</ol>2. geçici Transfection ve Teb tedavi
<ol><li>% 5-10 fetal sığır serum (FBS) ve antibiyotik (100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin) ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 5 mL taze pasajlı HEK293 hücreleri içeren dört hücre kültür yemekleri (60 mm çapında) hazırlamak. Bundan sonra "hücre kültür orta" veya sadece "kültür orta" FBS ve antibiyotik ile DMEM temsil eder. 37 ° C'de HEK293 hücreleri korumak</li>
	<li>1 µg saf DNA'ın % 50-60 yoğunluk transfection reaktif 3 µL kullanarak, HEK293 hücre içine transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 200 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin. Transfection için iki tabak kullanın ve diğer denetimleri tedavi edilmezse bırakayım.</li>
	<li>Transfection 12-24 saat sonra Teb (son konsantrasyonları, 0.2 - 10 µmol) birine transfected örnekleri ve sigara transfected denetimleri ekleyin. Diğer iki örnek deneysel kontrolleri tedavi edilmezse bırakın. Not: Teb hisse senedi çözüm (50 mM Dimetil sülfoksit içinde çözünmüş) hücre kültür orta, DMEM veya fosfat tamponlu tuz (PBS) deneysel parametrelere bağlı olarak kültürlü hücrelere eklemeden önce uygun bir konsantrasyon, seyreltilmiş. Ancak, sulu çözelti içinde Teb düşük çözünürlük nedeniyle, orta TEB'in yüksek bir konsantrasyon ile ana bir karışım hazırlama kaçının; Bunun yerine, taze orta Teb istenen konsantrasyon içeren tam hücre kültür orta yerine.</li>
	<li>Teb-tedavi ve tedavi edilmezse hücreler için 12-48 h 37 ° C'de yetiştirmek</li>
	<li>EGFP kullanarak eklerseniz, EGFP ifade floresan mikroskop ( Şekil 2) altında analiz. Aksi halde, bir immunoblotting tahlil için hücreleri hasat.<ol>
<li>İmmunoblotting tahlil için buz gibi PBS iki kez hücrelerle durulama ve sonra onları bir hücre kazıyıcı kullanılarak kazımak.</li>
		<li>Hücreleri kazık için spin hasat 21.000 x g (RT) 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde aşağı.</li>
		<li>PBS tamamen discarding sonra buz gibi memeli protein ayıklama reaktif 0.5 mL ekleyin (M-başı), proteaz inhibitörü (100 proteaz inhibitörü kokteyl x 5 µL), 60 mm tabak içinde hücreler kültürlü Eğer Pelet için ile birlikte.</li>
		<li>Pipetting birkaç tur hücrelerle yeniden askıya alma ve askıya alınan hücreler (RT) 18-25 ° C'de 15 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücre lysate 21.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin</li>
		<li>Sulu süpernatant temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın.</li>
		<li>İmmunoblotting, aşağıdaki standart iletişim kuralları ile uygun antikorlar tarafından süpernatant analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. nesil istikrarlı HEK293 hücre hatları ile pEUI(+) Gene Switch genomik entegrasyonu
<ol><li>5-10 µg transgene ile saf pEUI(+), 15-30 µL transfection reaktif kullanarak % 50-60 birleşmesi bir 90 mm çapında hücre kültür çanak içinde olan HEK293 hücrelere transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 500 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin.</li>
	<li>Transfection sonra büyümeye ve puromisindir-direnç gen ürünleri için 24-48 h 37 ° C'de (puromisindir) olmadan seçici olmayan kültür orta altında hızlı transfectants izin ver</li>
	<li>Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür orta atarak sonra transfectants Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile durulayın, 1 mL % 0.25 tripsin/ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Tripsin/EDTA sonra Şoklama Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek, hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri</li>
	<li>Transfectants 50 ml Önceden ısıtılmış kültür orta (37 ° C) ve transfer 10 mL hücrelerin içine 90 mm taze hücre kültür yemekler yeniden askıya alma. % 50-60 confluency puromisindir tedavi öncesi kadar 37 ° C'de hücreler kültür (genel olarak, bu yaklaşık 24-48 h alır).</li>
	<li>Hücre kültür 3 µg/mL puromisindir ile 3-4 hafta boyunca takıma orta 37 ° C'de transfectants yetiştirmek. Seçim döneminde seçimi basınç korumak için 2-3 günde puromisindir (3 µg/mL) içeren hücre kültür orta değiştirin. Hücreleri tamamen Konfluent olduğunda, puromisindir içeren kültür orta ile 3.3-3.4, adımda prosedürleri aşağıdaki bölüp. Kalan hücreleri kültür ortamında gerekli değildir Eğer atmak. Not: Puromisindir seçimi koşullar deneysel olarak belirli hücre tipleri için oluşturulmuş olmalıdır. Hücre kültürü ortamında 3 µg/mL puromisindir kullanılan; Bu hücre ölümü içinde sigara transfected HEK293 ikna etmek için yeterliydi.</li>
	<li>Hücre klonlama bir silindir kullanarak bireysel kolonilerden hasat ve üreticinin yönergeleri izleyin.<ol>
<li>Hücre kültür orta atın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) yüzen hücreleri kaldırmak için PBS ile plaka durulayın.</li>
		<li>Steril forseps kullanarak, klonlama silindir üzerinde bireysel kolonileri ayarlayın.</li>
		<li>%0.35 tripsin/EDTA 0.2 mL her silindir için ekleyin.</li>
		<li>Kadar hücreleri müstakil ve silindir için Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının birkaç damla eklemek için 1 dk 37 ° C'de çanak kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri her silindir 6-şey plaka bireysel wells kültür orta 2 mL ve 1 µg/mL puromisindir her iyi ile aktarın. Not: hücreleri Konfluent olduğunda, kültürünü büyütmek. Şimdi clone(s) gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre kültürü 1 µg/mL ile puromisindir takıma orta bireysel klonlar korumak.</li>
	<li>Bireysel kolonileri transgene ile immunoblotting ifade düzeyini analiz ederek onların duyarlılık için Teb tedaviye (son konsantrasyonu, 10 µM) 24 h Test yanıt için Teb klonların sınayarak doğrulayın. İstenen bir klonu (veya klonları) seçin. Teb tedavi ve tedavi edilmezse bir örnek 12-48 h 37 ° C'de için kültür ortamında transgene indüksiyon düzeyini analiz daha önce yetiştirmek. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 yordamlarda takip yoluyla ölçülebilir.</li>
</ol>4. Teb tükenmesi
<ol><li>Teb uyaranlara Teb-Alerjik orta ile Teb içeren hücre kültür orta değiştirerek gidermek. Not: Bu ilk hücreleri yeni bir kültür tabak üzerine reseeding olmadan büyüme ortamı değiştirin önerilir. Artık Teb plastik yemek için tutunacak görünür ve transgene güçlü arka plan ifadesidir temin. Hücreleri yeni bir kültür plaka üzerinde reseeding daha önce birkaç kez ile Kültür orta veya PBS hasat hücreleri durulayın.<ol>
<li>Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür ortamı içeren Teb atarak sonra iki kez Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile Teb teşvik hücreleri durulama, 1 mL % 0.25 tripsin/EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Teb-Alerjik Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek tripsin/EDTA Şoklama sonra hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri</li>
		<li>Önceden ısıtılmış Teb-Alerjik kültür orta (37 ° C) ve transfer 5 mL hücrelerin içine üç 60 mm taze hücre kültür yemekler 50 mL hücrelerde yeniden askıya alma. Sırasıyla 24, 48 ve 72 s 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
		<li>Hücreleri farklı zaman noktalarda hasat ve immunoblotting kullanarak transgene ifade düzeyini ölçmek. Not: Bu deneysel koşullarda belirlenemeyen yaklaşık 3 gün sonrası kültür Teb-Alerjik kültürel orta (şekil 3) hücrelerinin transgene ifade oldu. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 göre tarafından ölçülebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li>
<li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li>
<li>Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuzuki%2C+Y+%22Viral+Gene+Therapy%22">Viral Gene Therapy</a>. Xu, K. , InTech. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system">http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system</a> 285-309 (2011).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP%2FmTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR%3A+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29(2012).</li>
<li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+uses+of+mifepristone+%28MFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li>
<li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+mifepristone%3A+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li>
<li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li>
<li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam+Horm%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li>
<li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li>
<li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor%3A+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression%2C+and+reduced+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367(2016).</li>
<li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li>
<li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-inducible%2C+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li>
<li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li>
<li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N%27-benzoyl-N-%28tert-butyl%29benzohydrazide%3A+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li>
<li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li>
<li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide%2C+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li>
<li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li>
<li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149(2014).</li>
<li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+for+Gene+Therapy%3A+Translational+and+Clinical+Outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li>
<li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li>
<li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li>
</ol>

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

Bir ikili gen ifade anahtarı kullanmanın en büyük dezavantajı aynı anda iki ayrı plazmid (sürücü ve efektör) hedef hücreye teslim etmek ihtiyacıdır. Bu eşitsiz dağılımı Plazmid ve tutarsız bir yanıt sonucu indükleyicileri1,2,3geçmek için yol açabilir. İki-vektör sisteminin başka bir eksiklik en az iki el antibiyotik seçimi taahhüdü hücre satırları tanımlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, tek bir birim oluşan bir gen-indükl...

Tam olarak hücre kültürü ve hayvan modellerinde başarı1,2,3değişen derecelerde transgene ifade düzenlemek yeteneklerini için birkaç farklı gen anahtar incelemiş bulunuyoruz. Potansiyel gen anahtar sistemleri de dahil olmak üzere birkaç sıkı kriterleri karşılamak: hassas yönlü ifade transgene, dozaj ve zaman bağımlı kavramaları indükleyicileri, düzenleyicinin önemsiz leakiness, transgene reversibility etkinleştirme uyarıcı kaldırma ve uyarıcı toksisite düzeyleri hücre satırları ve laboratuvar hayvanları1,2,3için tolere edilebilir. Birkaç küçük molekül indükleyicileri, tetrasiklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10da dahil olmak üzere istismar, ve ecdysone11,12,13,14. Genel olarak, bu sistemler, iki ya da üç ayrı ifade birimleri içeren en az iki plazmid gerektirir, bir ya da iki tanesi transkripsiyon etkinlik kazanmak için bir küçük molekül uyarıcı bağlar bir düzenleyici öğesi (uyarıcı plazmid) oluşturmak; ve başka bir plazmid (efektör plazmid) uyarıcı bağlı yasal öğe erişim sağlar düzenleyici bir DNA bölge kontrol altında transgene içeren. En büyük dezavantajı ikili sistemdeki hedef hücre içine iki vektörlerin (uyarıcı ve efektör) giriş eşlik eden gerektirmesidir. Geçici transgene ifade denemelerinde iki plazmid aynı anda transfection kaçınılmaz bir nüfus tek başına uyarıcı ya da efektör ile transfected veya unequally co transfected hücre üretir. Ayrıca, ikili sistem istikrarlı hücre hatları, zaman alan ve zahmetli olan kurmak için antibiyotik seçimi en az iki tur gerektirir. Bu nedenle, tüm bileşenleri birleştirerek transgene ifade için gerekli ve yönetmelik tek bir vektör içine tek bir hücredeki tüm gerekli öğeleri eşlik eden ifade garanti ve transgene ifade Yönetmeliği için izin vermek ideal olacaktır Küçük molekül indükleyicileri ile tedavi yoluyla.
İkili gen anahtarları eksikliklerin üstesinden gelmek için biz son zamanlarda bir tekil gen anahtar, bir Drosophila melanogaster EcR tabanlı gen indüklenebilir sistem15kullanılarak geliştirilmiş. Sırayla DNA düzenleyici elemanlarının3,11EcR bağlama indükler EcR/ultraspiracle (USP) heterodimerdir için bağlandığında ecdysone gen ekspresyonu aracılık eder. Omurgalı retinoid X reseptör (RXR), böcek USP, bir ortholog bir etkin transkripsiyon aktivatör16oluşturmak için EcR acemi. Böylece, omurgalı hücreleri veya doku transgene hedeflenen ifadesi için EcR ve RXR aynı anda ecdysone veya onun agonistler tarafından daha önce uyarılmış ortak ifade olması gerekir. Heterodimeric özelliği EcR tabanlı gen anahtarının endojen RXR düzeyi, Padidam ve arktarafından etkilenmiş olabilir beri. EcR DNA'ya bağlanıcı ve harekete geçirmek etki alanları kapaklı GAL4 DNA'ya bağlanıcı ile herpes simpleks virüs protein vmw65 yerine (VP16) etkinleştirme etki alanları erimiş olan o zaman endojen RXR tepkisiz oldu ve bir homodimer oluşan EcR ligand bağlayıcı etki Transkripsiyon etkinliği17kazanmak için. EcR tabanlı gen anahtar en az VP16 harekete geçirmek etki alanı olan bir homodimer oluşmuş ve ecdysone agonist, Teb16yokluğunda sitozol lokalize GvEcR ile birlikte oluşan bir chimeric protein oluşturmak yoluyla daha da geliştirildi, 18. Teb için bağlama tarafından GvEcR onun hücre altı yerelleştirme sitozol en az organizatörü kombine ile on bir tandem Zebra balığı E1b oluşan bir karma organizatörü ters yönde harekete geçirmek dizileri (UASs) başlatmak için tekrar tanımak için çekirdek değişti Transkripsiyon hedef gene16.
Daha önce raporlanmış EcR tabanlı gen basitleştirmek için16,18geçer, uyarıcı transgene ifade için tüm gerekli öğeleri ile donatılmış ve daha sonra belirlenen bir tek vektör ikili sistemin özelliklerini kombine Yeni oluşturulan vektör pEUI(+) (GenBank üyelik numarası: KP123436, şekil 1A)15. GvEcR sürücü (bundan sonra sürücü) yanıt efektör on tandem birden çok klonlama sitesi (MCS) tarafından takip E1b en az organizatörü yanındaki UAS tekrarlar, EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII tanıma dizileri ile (şekil 1B) oluşur. Buna ek olarak, seçimi kolaylaştırmak için transfected hücreleri, bir SV40 organizatörü tahrik puromisindir N-asetil-transferaz (PAC) gen istikrarlı hücre satır (şekil 1) korumak için sürücü ve efektör bölgeler arasında yerleştirildi.
Biz transgene ifade pEUI(+) kullanarak geçici ve istikrarlı modülasyon için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir ecdysone agonist TEB'in başarılı kullanımı için ayrıntılı yönergeler sağlar.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>Patent lisansı TransLab Inc.'e devredildi.</td></tr><tr><td>Gen-Kusur Transfeksiyon Reaktifi</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozid</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Klonlama silindiri</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı</td><td>SPL yaşam bilimleri</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>fare BAYRAK M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa tübulin antikoru</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Klonlama silindiri</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Memeli Proteini Ekstraksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Proteaz inhibitörü Horoz. III</td><td>T & Ben</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

bir ecdysone reseptör tabanlı tekil gene anahtarı transgene sağlamlık, reversibility ve ihmal edilebilir leakiness kasıtlı ifade

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Hassas kontrol transgene ifade biyolojik ve klinik çalışmalarda tercih edilir. Ancak, şu anda istihdam gen anahtarları ikili özelliği iki tedavi edici ifade ünite transferi aynı anda tek bir hücreye gerektirdiğinden, gen tedavisi için sisteminin pratik uygulama sınırlıdır. Transgene ifade sistemi basitleştirmek için tek bir vektör transgene ifade modüllerde eksiksiz bir dizi kapsayan pEUI(+) olarak belirlenmiş bir gen anahtarı oluşturulur. GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanını oluşan ve değiştirilmiş EcR (GvEcR), en az bir VP16 harekete geçirmek etki GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı, hem de değiştirilmiş Drosophila ecdysone reseptör (EcR), ile erimiş yeni geliştirilen tekil gen anahtarı son derece olduğunu kimyasal bir uyarıcı bir saat ve doz bağımlı şekilde yönetimi için duyarlı. PEUI(+) vektör transgene ifade Biyolojik araştırma ve önceden klinik çalışmalar kontrolünü geliştirmek için potansiyel olarak güçlü bir araçtır. Burada, detaylı bir iletişim kuralı modülasyonu pEUI(+) vektör tebufenozide (Teb) tedavi ile kullanarak bir geçici ve istikrarlı transgene ifade için mevcut. Ayrıca, kimyasal bir uyarıcı olarak Teb kullanımı için önemli bir yönerge paylaşıyoruz.

Tekil gen GvEcR tabanlı anahtar şekil 1Aile tasvir edilir. PEUI(+) vektör Teb ile tedavi tarafından düzenlenmiş transgene ifade için optimize edildi. PEUI(+) efektör bölgesinin bir 10xUAS ve EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII restriksiyon enzimi tanıma siteleri içeren bir MCS tarafından en az organizatörü takip bir E1b oluşmaktadır. Bir SV40 Poli(a) sinyal MCS (şekil 1B) eklendi. PAC gen puromisindir direnç tanımak p...

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Bu deneyin genel amacı, kimyasal indükleyici tebufenozidin uygulanmasıyla transgen ekspresyonunu modüle etmektir. Bu yöntem, hücre ve moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin ilgilenilen bir genin ekspresyonunu istenen bir zamanda istenen bir güçle uyarmanız gerektiğinde. Bu tekniğin temel avantajı, transgen ekspresyonu için gerekli tüm elementlerin tek bir vektör içinde birleştirilmesiyle, transgen ekspresyonunun kimyasal indükleyici tebufenozidin uygulanmasıyla uyarılabilmesidir.Metin protokolüne göre EGFP veya ANKRD13A transgenleri alt klonladıktan sonra,% beş ila% 10 FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre DMEM'de taze geçişli HEK 293 hücreleri içeren dört hücre kültürü kabı hazırlayın, bu bundan sonra kültür ortamı olarak anılacaktır. Hücreleri 37 santigrat derecede tutun. Hücreler %50 ila %60 yoğunluğa ulaştığında, DNA'yı içeren 200 mikrolitre seyrelticiye üç mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin.Reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, karışımı HEK 293 hücrelerine ekleyin. Transfeksiyon için iki tabak kullanın ve diğer ikisini kontrol olarak tedavi edilmeden bırakın. Hücreleri 12 ila 24 saat bo

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Özellikler için Fenotipik varyasyon cis-düzenleyici element (CRE) dizileri kontrol eden gen ekspresyonu mutasyonlar sonucu. Drosophila melanogaster kullanmak için türetilmiş yöntemler kantitatif değişiklikte ya da doğal olarak meydana gelen CRE türevleri aracılı gen ekspresyonu mekansal ve zamansal kalıplarının seviyelerini karşılaştırmak.

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis</emTransgenik>-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster</em

Kaynak: Berens, C. ve diğerleri. Bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal ile girişimini incelemek için indüklenebilir bir ifade sistemi uygulamak. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bakteriyel efektör protein CaeB'nin konak apoptotik kaskadını nerede bozduğunu belirlemek için indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Tetrasiklin-tepkili bir sistemle CaeB-eksprese eden hücrelerin transfekte edilmesi, pro-apoptotik gen ekspresyonunu indüke etmek ve zincir içindeki...

İndüklenebilir bir gen ifade sisteminin bakteriyel efektör proteini ifade eden hücrelere aktarılması

Bu video, bir fare modelinde tetrasiklin veya Tet-On gen ekspresyon sistemini göstermektedir. Bir tetrasiklin türevi olan doksisiklin varlığında, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör proteinden oluşan Tet-On sistemi aktive olur ve ilgilenilen geni eksprese eder.

İndüklenebilir Tet-On Düzenlenebilir Sistem Tabanlı In Vivo: Fare Modelinde Hedef Gen Transkripsiyon Aktivasyonu için Tetrasiklin Kaynaklı Bir Gen Ekspresyon Sistemi

Bu protokol soydaş GFP gazetecilere ve flow sitometri aracılığı GFP ifade uyarmak için atfs yeteneği ölçümü ile yapay transkripsiyon faktörleri (atfs) hızlı inşası için deneysel bir prosedür açıklanmaktadır.

Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Öğrenin, tebufenozid ile transgen ifadesini HEK 293 hücrelerinde hassas şekilde kontrol etmeyi. Bu yöntem, hücre ve moleküler biyolojide gen düzenleme çalışmaları için güçlü bir araç sunar.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade (Video) | JoVE Journal

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Daha fazla video keşfet