Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Bu deneyin genel amacı, kimyasal indükleyici tebufenozidin uygulanmasıyla transgen ekspresyonunu modüle etmektir. Bu yöntem, hücre ve moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin ilgilenilen bir genin ekspresyonunu istenen bir zamanda istenen bir güçle uyarmanız gerektiğinde. Bu tekniğin temel avantajı, transgen ekspresyonu için gerekli tüm elementlerin tek bir vektör içinde birleştirilmesiyle, transgen ekspresyonunun kimyasal indükleyici tebufenozidin uygulanmasıyla uyarılabilmesidir.

Metin protokolüne göre EGFP veya ANKRD13A transgenleri alt klonladıktan sonra,% beş ila% 10 FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre DMEM'de taze geçişli HEK 293 hücreleri içeren dört hücre kültürü kabı hazırlayın, bu bundan sonra kültür ortamı olarak anılacaktır. Hücreleri 37 santigrat derecede tutun. Hücreler %50 ila %60 yoğunluğa ulaştığında, DNA'yı içeren 200 mikrolitre seyrelticiye üç mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin.

Reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, karışımı HEK 293 hücrelerine ekleyin. Transfeksiyon için iki tabak kullanın ve diğer ikisini kontrol olarak tedavi edilmeden bırakın. Hücreleri 12 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, transfekte edilmiş örneklerden birine ve transfekte edilmemiş kontrollerden birine Teb ekleyin. Diğer iki örneği deneysel kontroller olarak ele alınmadan bırakın. Plakaları 12 ila 48 saat inkübe edin.

EGFP ekini kullanıyorsanız, EGFP ekspresyonunu floresan mikroskobu altında analiz edin. Aksi takdirde, immünoblotlama için hücreleri hasat etmek için, hücreleri iki kez durulamak için buz gibi soğuk PBS kullanın. Ardından, bunları plakadan çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, tüpleri iki dakika boyunca 21.000 kez g ve 18 ila 25 santigrat derecede döndürün. Daha sonra, PBS'yi attıktan sonra, pelete 0.5 mililitre buz gibi soğuk memeli protein ekstraksiyon reaktifi veya M-PER ve proteaz inhibitörü ekleyin. Hücreleri birkaç tur pipetleme ile yeniden süspanse edin.

Ardından, hücre süspansiyonunu 18 ila 25 santigrat derecede ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücre lizatını 10 dakika boyunca 21.000 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Daha sonra, sulu süpernatanı 1.5 mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve uygun antikorlarla immünoblotlama yaparak analiz edin.

Teb uyaranlarını söndürmek için, Teb içeren kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve hücreleri iki kez durulamak için önceden ısıtılmış PBS kullanın. Daha sonra, bir mililitre% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin ve hücreleri bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelere 10 mililitre önceden ısıtılmış, Teb içermeyen kültür ortamı ekleyin ve bunları hasat etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri iki dakika boyunca 21.000 kez g ve 18 ila 25 santigrat derecede döndürün. Hücreleri 50 mililitre önceden ısıtılmış, Teb içermeyen kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücrelerin beş mililitresini üç adet 60 milimetrelik taze hücre kültürü kabına aktarın.

Hücreleri sırasıyla 24, 48 ve 72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, hücreleri farklı zaman noktalarında toplayın ve immünoblotlama kullanarak transgenin ekspresyon seviyelerini ölçün. pEUI-plus-EGFP'nin aktivitesini ve sızıntısını değerlendiren bu deneyde, sahte vektör transfektanları, Teb tedavisinden bağımsız olarak floresan sinyali göstermedi.

Bununla birlikte, pEUI-plus-EGFP transfektanları, artan Teb miktarına giderek duyarlı hale geldi. Daha da önemlisi, Teb ile muamele edilmeyen pEUI-plus-EGFP transfektanları, herhangi bir saptanabilir EGFP sinyali ortaya çıkarmadı. pEUI-plus'ın Teb'e yanıt verebilirliğini daha fazla doğrulamak için FLAG etiketli ANKRD13A kullanıldı.

Anti-FLAG antikorları kullanılarak bu western blot'ta gösterildiği gibi, transfekte HEK 293 hücreleri, Teb ile 24 saatlik bir tedaviyi takiben güçlü ANKRD13A ekspresyonu sergiledi. Ek olarak, Teb'in tükenmesi, pEUI-plus gen anahtarının tersine çevrilebilirliğini gösterdi, çünkü Teb olmadan kültürlenen hücrelerde ANKRD13A artık tespit edilemedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, neredeyse tüm deneyi mikropsuz koşullar altında gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, iki farklı transgeni diferansiyel olarak eksprese etmek için Tet-On veya Tet-Off sistemi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların moleküler fizyolojiyi hücresel düzeyde keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, istenen bir zamanda istenen güçte transgen ekspresyonunu indüklemek amacıyla pEUI-plus gen anahtar vektörünün nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Tebufenozid ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.