Name: Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin embriyo mikroenjeksiyon yöntemiyle Western Corn Rootworm genomunu CRISPR/Cas9 ile düzenlemeyi. Bu teknik, zararlı direnç mekanizmalarını anlamak için fonksiyonel genomik çalışmalara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Monsanto Mısır Rootworm bilgi araştırma programı hibe tarafından desteklenen, numara AG/1005 (için MDL ve YC) ve başlangıç fonlar MDL için NCSU verin. FC hibe Monsanto'nun Mısır Rootworm bilgi araştırma programı (AG/1005) ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (MDL) sayı MCB-1244772 verin. Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin. FC ve MDL gebe ve deneyler tasarlanmış; FC, PW ve SP deneyler yapılır; FC ve MDL sonuçları analiz; ve FC, NG ve MDL el yazması yazdı. Biz Teresa O'Leary, William Klobasa ve Stephanie Gorski WCR eleme konusunda uzman onların yardım için teşekkür ederim. Ayrıca Dr. Wade Fransızca (USDA-ARS, Kuzey Merkez tarımsal araştırma laboratuvarı, Brookings, SD) laboratuar koloniler ve yetiştirme protokolleri sağlayarak kurmak için yumurta gönderiler için teşekkür ediyoruz.

1. koloni düzeyi WCR yetişkin yetiştirme
<ol><li>WCR yetişkin yeterli miktarda elde etmek (500-1000) üzerinden güvenilir bir şirket veya Araştırma Laboratuvarı ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) ve 30 cm3 kafese koyun. Not: Bir sigara diapausing yük kullanımı önerilir.</li>
	<li>WCR yapay diyet üreticisinin protokolüne hazırlamak ve 1 cm kalınlığında kat 38 oz konteyner içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek). Karıştırma sonra kullanılmayan diyet 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Yetişkin diyet (10-15 g) ile Petri kabına (100 x 15 mm) 30 cm3 kafesin içine koymak. Yemek düşük veya kuru olduğunda daha fazla diyet ekleyin.</li>
	<li>Bir şişesi (300 mL) su, bir pamuk rulo (6 "x 3/8"), hizmet etmek için tutmak için kullanılan bir pamuk topağı ile kaplı ile bir su kaynağı olarak koymak. Bu azaldığında değişmek belgili tanımlık su.</li>
	<li>% 60 nem ile 26 ° C'de WCR korumak ve bir 14:10 ışık döngüsü kuluçka yetiştirme bir böcek.</li>
</ol>2. embriyo toplama ve hizalama
<ol><li>Bir yumurta toplama Odası %1 agar suda bir steril 100 x 15 mm2 ' Petri kabına kullanarak olun. Agar katılaşır sonra 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Yeni koydu yumurta toplamak için filtre kağıdı, tülbent (her kesim boyutu için) 4 kat (şekil 1A) agar yüzeyinde ardından tek bir katman yer. Not: Tülbent, yıkanmış çamaşır suyu ve autoclaved, kaldıktan sonra yeniden kullanılabilir ancak ilk kullanım için bunun gerekli değildir. Filtre kağıdı yeniden ve steril gerekmez.</li>
	<li>Yumurta toplama plaka (son iş günü) olabildiğince kadar geç saatte WCR kafesin içine yerleştirin ve bir folyo çadır ile kaplayın. Gece bırakın. Not: ışıklar saat 12 (14 h) gecikmeler yumurta için döşeme 10 saatleri arasında açık olması, böylece mikroenjeksiyon için genç yumurta toplama toplama odası gece geç saatlerde kafesin içine yerleştirmek laboratuvar personeli gerek kalmadan kolaylaştırmak.</li>
	<li>Yumurta toplama Odası 8 veya 9'da kaldırmak</li>
	<li>Forseps tülbent 1 kat kadar bir zaman ve yerde bir ölçek (500 mL) su almak için kullanın. Yıkayın tülbent kapalı yumurta hafifçe karıştırarak (şekil 1B ve 1 C).</li>
	<li>Bir ampul pipet yumurta başka bir kabı (500 mL) su için aktarmak için kullanın. 2-3 x yumurta temizlemek için yineleyin.</li>
	<li>Ampul pipet su etkilenmişimdir miktarını en aza indirerek yumurta filtre kağıdı (şekil 1 d) üzerine aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Siyah filtre kağıdı bir cam slayt ve kaset olarak geniş şeritler halinde kesin sıkıca emin olmak için slayda kağıt düz (şekil 2A) bırakır. Not: Siyah filtre kağıdı yansıyan ışık miktarını azaltarak mikroskop altında görünürlüğünü artırmak yardımcı olur.</li>
	<li>Toksik olmayan yapıştırıcı uygulamak ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) için filtre kağıdı ince çizgileri (şekil 2B) içinde. Tutkal satırları içinde tutkal boyalı yumurta almamak için bir yumurta çapı daha ince tut.</li>
	<li>İnce fırça yavaşça WCR Yumurtaları teker teker tutkal hattına onların filtre kağıdı taşımak için kullanın. Kurumadan uyuşmuşhalde yumurtlamak deneyin ve her yumurta arasında en az bir yumurta'nın uzak dur.</li>
	<li>Enjeksiyon verimliliği maksimize etmek yanında duvar ilanı yumurta birkaç satırlık bir filtre kağıdı slayt (şekil 3).</li>
	<li>Sonra tüm yumurta üzerinde filtre kağıdı koyulur, tüm tutkal mikroenjeksiyon önce kurur kadar bekleyin. Not: en eski embriyo fazla 19 h eski olması germline dönüştürme ve düzenleme CRISPR/Cas9-aracılı genom, tüm embriyoların öğle vakti (12 üzerinde) enjekte et. Ancak, RNAi için olduğunu hiçbir zaman sınırlama WCR içinde dsRNA hücreler arasında hareket edebilir çünkü. Aslında, RNAi için yaşlanma embriyolar daha iyi sağkalım oranları neden olabilir.</li>
</ol>3. hazırlık plazmid DNA'lar ve enjeksiyon iğneler
<ol><li>Endotoksin-Alerjik bir ticari kullanarak yüksek kaliteli supercoiled plazmid DNA hazırlamak ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) kit.</li>
	<li>Enjeksiyon çözüm hazırlamak için her plazmid konsantrasyonu kontrol ve yardımcı plazmid (250 ng/µL son konsantrasyonu), donör plazmid (750 ng/µL son konsantrasyonu) ve fenol red arabellek (% 20 son konsantrasyonu) birleştirir. Girdap kısaca çözüm ve iğne yapışmasına neden parçacıklar çökelti maksimum hızda 3 dk santrifüj.</li>
	<li>Borosilikat cam iğneler (doz 1 mm, kimlik 0,58 mm, 10 cm uzunluk) çekin bir yanan/kahverengi türü micropipette çektirmenin kullanarak. Güvenli depolama için çift taraflı yapışkan bant Petri kabına veya diğer açık kapsayıcıda çekti iğne falan batmazdı. Not: micropipette çektirme sistemi için kullanılan ayarları vardı: ısı 335, FIL = = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Is bir mikro-yükleyici kullanarak enjeksiyon iğne ipucu ( Tablo malzemelerigörmek) için damlalıklı 0.5 - 1.0 µL aşağı konik sonuna yakın iğne içinde. Oluşursa kabarcıklar iğneyi ucundan kaldır.</li>
	<li>Enjeksiyon iğne iğne bağı yerleştirin.</li>
	<li>İğne ucu hafifçe forseps güzel bir ikili ile kırma, ya da hafifçe dokunmadan/coverslip veya cam slayt üzerindeki sürükleyerek açın. Not: Hala dışarı çıkmasını enjeksiyon karışım verir en küçük açılması için hedeftir (daha küçük açıklıklar genellikle daha yüksek enjeksiyon basıncı gerektirir). Onlar zaten açık olduğundan eğimli iğneler bu adımı gerekmez.</li>
</ol>4. mikroenjeksiyon ve enjeksiyon sonrası bakım
<ol><li>İyi bir fırça kullanarak, dikkatli bir şekilde steril su ile 1-3 yumurta yüzeyine ıslak, iğne yerleştirin ve çözüm enjekte. Yüzey kurumadan her yumurta enjekte et. Görünüm için kırmızı renk yumurta içinde az miktarda enjeksiyon sırasında başarılı mikroenjeksiyon belirtmek için bak. Ezmek veya bak hasarlı, boş veya aksi takdirde enjekte cant herhangi bir yumurta kaldırın. Not: enjeksiyon basıncı iğne delik boyutu bağlı olarak değişir, 10-13 psi iyi bir başlangıç noktası olsa da.</li>
	<li>Tüm yumurta enjekte sonra filtre kağıdı cam slayttan kaldırın.</li>
	<li>(Yukarıda açıklanmıştır) %1 agar çanak yüzeyi filtre kağıdı yerleştirin.</li>
	<li>Plastik parafin film çanak mühür ve 12 gün boyunca kuluçka yetiştirme 26 ° C böcek koymak için kullanın. Not: Parafin film Çapraz kontaminasyon küf yemekleri arasında engellenmesine yardımcı olur. Ancak, küf ve bakterilerin büyüme önlemek için başka bir tedavi enjekte embriyo yaşama azaltmak olabilir.</li>
</ol>5. Kültür ve embriyoların çıkım
<ol><li>Embriyo 12 gün sonrası enjeksiyon yeni yumurtadan larva için kontrol edin ve her gün önümüzdeki 2 hafta boyunca devam edin.</li>
	<li>Larvalar, Filiz Mısır ve toprak bir yetiştirme kutusu için iyi bir fırça kullanarak aktarın. Not: Kalıp agar tabak içinde büyümek, ama larva hala çoğu durumda yumurtadan. Larva hepsini yakalamak için dikkatli bir şekilde kalıp içinde arayın. Bazı larvaların çanak kapağı için hareket olabilir ve yoğunlaşma içinde sıkışıp.</li>
	<li>Larva yetiştirme yöntemleri25standart WCR takip 26 ° C'de arka.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

WCR mikroenjeksiyon RNAi amacıyla dsRNAs ile bildirilen9olmasına rağmen bu precellular WCR embriyo, germline dönüştürme yürütmek için kritik bir işlem microinjecting için en iyi yöntemler kurmak için ilk protokoldür ve/veya CRISPR/Cas9 genom içinde bu tür düzenleme. Dönüşüm verimliliği olduğu gibi WCR embriyo başarılı mikroenjeksiyon birçok etkene bağlıdır. Aşağıda açıklanan bazı önemli konuları bu böceğin germline dönüştürme için bu iletişim kuralını kullanan sonucu etkileyen vardır.
<p class...

Batı Mısır rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, önemli bir böcekten Mısır1var. İlginçtir, denetim üstesinden gelmek için WCR görünür onlar sadece fizyolojik olarak aynı zamanda davranışsal2,3,4,5, uyum bu yana en Tarım zararlıları daha hızlı ölçer 6. son on yıl içinde RNA müdahale (RNAi), güçlü bir işlevsel genomik araç, WCR7,8için potansiyel bir kontrol yöntemi olarak incelenmiş ve gen fonksiyon9eğitim için bir araç olarak da kullanılmıştır. RNAi sık mikroenjeksiyon çift iplikçikli RNA (dsRNA) diğer türler tarafından gerçekleştirilir, ancak, RNAi enjeksiyon tabanlı WCR içinde nadir iken. Aslında, RNAi yolu ile mikroenjeksiyon dsRNA in WCR9içine sadece bir kaç rapor ediliyor. WCR bile annem11' e dsRNA besleyerek embriyonik etkileri çalışma izin dsRNA7,10, için gen devirme yolu ile yenmesi yüksek düzeyde elde edebilirsiniz nedenidir. Bu yöntem WCR fonksiyonel genomik analiz yoluyla RNAi için mükemmel bir konu yapar iken, bu türlerin embriyonik mikroenjeksiyon yöntemleri geliştirmedek ilerlemeyi yavaşladı.
RNAi güç rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, tüm genler eşit RNAi için yanıt. Bu değişkenliği daha zor bir işlevsel genomik tahlil sonuçlarını yorumlama yapabilirsiniz. Ayrıca, RNAi geçici ve kalıtsal mutasyonlar oluşturmaz. Öte yandan, germline dönüştürme, başka bir işlevsel genomik aracı, kalıtsal mutasyonlar ile işaretli olan öğesinin içine ekleme genom12,13oluşturabilirsiniz. Bu uzun vadeli genetik çalışmalarda kullanılmak mutant suşları oluşturmak için mükemmel bir araç germline dönüştürme yapar. Dönüştürme bir mutant genom14' e gen işlevsel bir kopyasını sunarak bir mutasyon kurtarmak için de kullanılabilir. Ayrıca, germline dönüştürme moleküler genetik teknikleri çok çeşitli taşıdır. Nakavt ve/veya gen işlevi tahlisiye yanı sıra, germline dönüştürme artırıcı bindirme15, gen bindirme16, Ektopik ifade Gal4 tabanlı17ve genom-wide mutagenesis18için kullanılabilir.
Daha yakın zamanlarda, sofistike genom düzenleme sağlayan araçlar geliştirilmiştir. Bu araçlar transkripsiyon Activator-Like efektör enzimler (TALEN) CRISPR/Cas9-nükleaz sistemi19,20içerir. Bu yeni araçların çift iplikçikli DNA ara hemen hemen her yerde hemen hemen tüm genom içinde ikna yeteneği araştırmacılar sundukları avantajdır. Bir kez bağlı, bu tatili katalizler hangi bir mühendislik yapı huzurunda homoloji yönetmen onarım veya silme veya ekleme hedeflenen gen tanıtmak katılmadan, homolog olmayan iki ucundan aracılığıyla onarılabilir yerine tüm genler veya genetik bölgeleri21,22. Ancak, bu yöntemlerin çok genç embriyo içine DNA, RNA ve/veya protein mikroenjeksiyon gerektirir.
Önemlisi, RNAi, nükleik asitler ve protein germline için kullanılan için kullanılan dsRNAs aksine dönüştürme ve genom düzenleme kolayca hücre zarlarında geçemez. Bu nedenle, mikroenjeksiyon plazmid DNA'lar, mRNA'ların ve/veya proteinler (böcek embriyo cellularizes önceYani ) sinsisyal blastoderm aşamasında yer almalıdır. Bu kritik bir faktör enjeksiyonları zamanlamasını yapar. Örneğin, Drosophila melanogasteriçinde embriyo12yumurta sonra iki saat içinde enjekte edilir gerekir. Bu nedenle, başarılı embriyonik mikroenjeksiyon Protokolü gelişimi için WCR yanı sıra precellular embriyo yeterli miktarda toplamak için en iyi yöntem dişi yumurta döşenmesi için en iyi koşulları dikkate almanız gerekir.
Toplamak ve precellular WCR embriyo microinjecting yöntemleri geliştirmek, WCR Biyoloji üzerinde ayı için moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede getirmek için bir çaba gerektirir. Burada WCR araştırmada dönüşüm tabanlı teknikleri kullanmak başkalarına yardım etmek için ayrıntılı talimatlar, ipuçları ve püf noktaları, birlikte sağlamak. İşlevsel genomik çalışmalarda kullanılmak için WCR transgenik teknolojileri uzanan ek olarak bu teknikler de bunda ekonomik açıdan önemli test edilecek gen sürücü23,24 gibi güçlü yeni haşere kontrol stratejileri sağlar haşere.

<table><tbody><tr><td>Kalitatif Filtre Kağıdı (Siyah)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Yumurta mikroenjeksiyonu için</td></tr><tr><td>1 oz Kaplar&nbsp;</td><td>Anny'nin Plastik Sofra Takımı</td><td>ASET101</td><td>Yumurta kabı</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Tip II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>WCR yumurtlama tabağı için Yüzey</td></tr><tr><td>Tüy Ağırlığı Forseps&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Larva ve pupaların işlenmesi&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Normal-Çamaşır Suyu1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Mısır ve bulaşıkları yıkayın</td></tr><tr><td>Trucker'ın Favorisi Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>WCR Mikroenjeksiyon Sistemini beslemek için Mısır</td></tr><tr><td>(Ev yapımı)</td><td>NA</td><td>Parçalar ve talimatlar istek üzerine temin edilebilir</td><td>Enjeksiyon basıncını kontrol eder (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer'in Toksik Olmayan Yapıştırıcısı</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Yumurtaları filtre kağıdına yapıştırın</td></tr><tr><td>epTIPS Mikro Yükleyici Uçları</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Doldurma iğnesi yükleme uçları</td></tr><tr><td>Falcon Doku Kültürü Kapları</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Filizlenen mısır /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Kantitatif Dereceli Filtre Kağıdı Daireleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Yumurtlama için agar kabı yapımı / 9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Bulaşıkları yıkayın</td></tr><tr><td>Düz Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Mikroenjeksiyon için filtre kağıdı ve yumurtaları tutma</td></tr><tr><td>Batı Mısır Kök kurdu Polen İkamesi Olmadan</td><td>Sınır Tarım Bilimleri&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR yetişkin yapay diyet</td></tr><tr><td>Pamuk Topları, Büyük</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Şişeyi kapatın</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Küçük Ampul Transfer Pipetleri</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Yumurtaları toplayın ve aktarın</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Floresan Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>WCR taraması</td></tr><tr><td>Floresan Stereomikroskop için DsRed Filtre Seti</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Uyarma filtresi: 510-560 nm, emisyon filtresi: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP filtresi</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Uyarma filtresi: 440 ve ndash; 520 nm, emisyon filtresi: 510 nm</td></tr><tr><td>Yetişkin koloni için BugDorm</td><td>MegaView Bilim</td><td>DP1000_5P</td><td>Kafesi</td></tr><tr><td>Minyatür Boya Fırçası</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Mikromanipülatör ve iğne tutucu</td></tr><tr><td>Mikroskop XY Aşaması</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Mikroskop aşaması (stereoskop ile kullanım için uyarlanmıştır)</td></tr><tr><td>Sınıf 90 Tülbent</td><td>Online Kumaş Mağazası</td><td>CHEE90</td><td>Yumurta bırakma için</td></tr><tr><td>Plastik parafin filmi&nbsp;</td><td>Pechiney Plastik Ambalaj</td><td>PM-996</td><td>Mikroenjeksiyon sonrası agar kabını kapatın / Rulo boyutu 4 inç x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival İnkübatör</td><td>Percival & nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR yetiştirme odası (böcek yetiştirme kuluçka makinesi)</td></tr><tr><td>Dar Ağızlı Erlenmeyer Şişeleri</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Yetişkin koloni için su kabı&nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Düşük Form Beherler</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Yumurta yıkama için</td></tr><tr><td>Örgülü Pamuk Ruloları</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Yetişkin koloni için su temininde kullanım&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Kapları (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Diyet plakaları için</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Mikroenjeksiyon tamponu</td></tr><tr><td>Lazer Tabanlı Mikropipiette Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-2000/G</td><td>İğne çektirme/Isı = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Üst Toprak</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Cron yetiştiriciliği</td></tr> <tr><td>için toprakReloc Zippit 2 Mil Fermuarlı Çanta</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Plastik Şirketi</td><td>48342</td><td>Mikroenjeksiyon sonrası torba agar kabı / 5x7</td></tr><tr><td>Petri Kapları (100x15m)</td> <td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Yumurtlama için agar kabı yapma / 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Kaplar</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR tek çift çiftleşme odası&nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Kaplar</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Larva yetiştirme kutusu/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Mikrodalgada Yarı Saydam Plastik Şarküteri Kabı</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Larva yetiştirme kutusu/16 oz</td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon Kapsamı&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>XY aşaması ile donatılmış mikroenjeksiyon kapsamı</td></tr><tr><td>Standart Cam Kılcal Damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B100F-4</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>iğneleri Yetişkin Batı Mısır Kök kurtları</td><td>Kuzey Merkezi Tarım Araştırma Laboratuvarı</td><td>Diyapaz olmayan suş</td><td>Dr. Bryan Wade'den talep French'in laboratuvarı</td></tr><tr><td>Plazmid DNA Midi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Enjeksiyona hazır plazmit DNA'larının saflaştırılması</td></tr></tbody></table>

western mısır rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon germline dönüştürme veya crispr/cas9 genom düzenleme

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Batı Mısır rootworm (WCR) Mısır önemli bir böcek ve haşere Yönetim Stratejileri için hızla adapte kabiliyetini için bilinen. RNA müdahale (RNAi) WCR biyoloji okuyan için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamıştır rağmen kendi sınırlamaları vardır. Özellikle, RNAi kendisi geçici (Yani tam yol ilişkili fenotip uzun vadeli Mendel miras), ve hedef gen DNA dizisi bilerek gerektirir. Fenotip ilgi kötü korunmuş veya bile roman genler tarafından kontrol edilir eğer yararlı hedefler belirlenmesi zor olabilir çünkü ikinci imkansız olmasa sınırlama. Bu nedenle, dizi WCR'ın genomik araç kutusundaki araç istikrarlı mutant suşları oluşturmak ve WCR genom dizisi bağımsız çalışmaları etkinleştirmek için kullanılabilir yöntemleri geliştirme tarafından genişletilip. Burada, biz toplamak ve nükleik asitler ile precellular WCR embriyo microinject için kullanılan yöntemleri ayrıntılı. Burada açıklanan protokoller transgenik WCR yaratılması hedefleniyor iken, CRISPR/Cas9-genom düzenleme de embriyo enjekte çözüm bileşimi olmanın tek farkı ile aynı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu iletişim kuralı geliştirilirken önemli bir göz mikroenjeksiyon esnasında embriyonik gelişim aşaması oldu. Özellikle, DNA'lar mikroenjeksiyon embriyonik cellularization önce germline dönüştürme gerektirir. Bunun nedeni DNA'lar kolayca hücre zarlarında geçemez. Dechorionation WCR embriyo aslında tüm koruyucu membran embriyonun bütünlüğünü için sorumlu erir çünkü nükleer bir leke kullanarak WCR embriyonik gelişim aşamalarında görselleştirmek için girişimleri başarısız oldu. Ancak, bu satı...

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bu Mikroenjeksiyon protokolünün genel amacı, Batı Mısır Kök kurdu genomunu değiştirmektir. Bu yöntem, Batı Mısır Kök kurdu biyolojisi ve BT Toxin ve RANI gibi haşere kontrol yöntemlerinin hızlı bir şekilde üstesinden gelme yetenekleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, Batı Mısır Kök Kurtlarının yanı sıra, Güney ve Kuzey Kök Kurtları gibi benzer türlere de uygulanabilir.Bu yöntem için ilk olarak 90'lı yıllarda Western Corn Rootworm'da enjeksiyon bazlı RANI konusunda yardım etmem istendiğinde aklıma geldi. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir. Çünkü laboratuvarda Batı Mısır Kök Kurtları yetiştirmek emek yoğundur.Ve mevcut teknolojiyi kullanarak hayatta kalma oranları düşük kalmaktadır. Güvenilir bir şirketten veya araştırma laboratuvarından 500 ila 1.000 diyapoz etmeyen kök kurdu yetişkini edinin. Ve onları 30 santimetreküp kafeslerde barındırın.Standart kök kurdu yapay diyetini yaklaşık bir santimetre derinliğinde gıda saklama kaplarında saklayın. Kullanılmayan diyet iki aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Kök kurdunu beslemek için, 10 ila 15 gram diyetle 100 santimetre Petri kabı yükleyin.Her kök kurdu kafesine bir tabak yiyecek yükleyin. Ve tedarik azaldığında veya diyet kuruduğunda yenileyin. Ayrıca, su kaynağı olarak hizmet etmek için her kafeste bir pamuk topuyla kaplı 300 mililitrelik bir su deposu bulundurun.Suyu azaldığında değiştirin. Kafesli kök kurdunu bir böcek yetiştirme kuluçka makinesinde %60 nem ve 14/10 ışık döngüsü ile 26 santigrat derecede tutun. Işıkları günün ilerleyen saatlerinde, örneğin gece yarısı gibi kapatın, böylece yumurtalar sabah çalışma saatlerinden önce bırakılır.İlk önce embriyoları toplayın. Yumurta toplama yüzeyi için, 30 mililitre% 1 agar ve su ile 100 milimetrelik bir Petri kabı yükleyin. Ardından, agarın üzerine tek kat filtre kağıdı ve ardından dört kat tülbent bezi yerleştirin.Her katman boyutuna göre kesilmelidir. Daha sonra, mümkün olduğunca geç bir saatte, yumurta toplama plakasını kök kurdu kafesine yerleştirin ve üzerini bir folyo çadırla örtün. Ardından ertesi sabah yumurta toplama haznesini çıkarın.Bir seferde bir kat tülbent almak için forseps kullanın ve su dolu 500 mililitrelik behere yerleştirin. Yumurtaları tülbentten suda döndürerek yıkayın. Ardından, yumurtaları yıkama adımı olarak başka bir su kabına aktarmak için bir ampul pipeti kullanın.Bu şekilde iki veya üç yıkama yapın. Daha sonra temizlenmiş yumurtaları mümkün olduğunca az su ile filtre kağıdına koyun. Ardından, kontrastı artırmak için bir parça siyah filtre kağıdını slayta düz bir şekilde bantlayarak bir slayt hazırlayın.Ardından, yumurtaları sabitlemek için kullanılacak kağıdın üzerine ince çizgiler halinde toksik olmayan yapıştırıcı sürün. Yapıştırıcıyı bir yumurtanın çevresinin altında tutun. Yapıştırıcı ıslakken, yumurtaları tutkal hattına yerleştirmek için ince bir fırça kullanın.Her yumurta arasında en az bir yumurta mesafesi bırakın. Slayt başına birden fazla yumurta satırı hazırlayın. Yumurtalar şimdi 30 dakika içinde enjekte edilmelidir.Şimdi, yardımcı plazmit, donör plazmidi ve fenol kırmızı tamponunu birleştirin. Endotoksin içermeyen bir ticari kit ile yapılmış yüksek kaliteli, süper sarmal plazmitler kullanın. Fortex kısaca karıştırmak için.Ve sonra partikülleri maksimum hızda üç dakika boyunca döndürün. Daha sonra, borosilikat cam iğneleri 0,5 ila 1 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi ile geri çekti. Herhangi bir kabarcık oluşursa, bunları çıkardığınızdan emin olun.Ardından, enjeksiyon iğnesini mikromanipülatöre takın. Şimdi, gerekirse, mikroskop altında, ince bir forseps çifti kullanarak veya ucu bir cam bariyere hafifçe dokundurarak mühürlü iğne ucunu nazikçe kırın. Enjeksiyon çözeltisini serbest bırakan mümkün olan en küçük açıklığı yapmaya çalışın.Kök kurdu yumurtalarını enjekte etmeden önce, hazırlanmış bir ila üç yumurtanın yüzeyini steril suyla dikkatlice ıslatmak için ince bir boya fırçası kullanın. Daha sonra ıslatılmış embriyoları enjekte edin. İğneyi yavaşça embriyonun ortasına yerleştirin ve küçük bir miktar çözelti enjekte edin.10 ila 13 psi basınç kullanarak başlayın ve basıncı gerektiği gibi ayarlayın. Kuru embriyolar belirgin bir yuvarlak şekle sahiptir, her embriyoyu suyla önceden ıslatarak şeklini değiştirecek ve yumurta kabuğunu yumuşatacak, böylece iğnenin kolayca nüfuz etmesini sağlayacaktır. Başarılı bir şekilde enjekte edilen bir embriyo az miktarda kırmızı renge sahip olacaktır.Bir yumurta hasar görmüşse, tuhaf görünüyorsa veya enjekte edilemiyorsa, ezin veya slayttan çıkarın. Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, üzerindeki yumurtaların bulunduğu filtre kağıdını %1'lik bir agar kabına alın. Ardından, çanağı parafin film ile kapatın ve larvalar yumurtadan çıkana kadar 26 santigrat derecede inkübe edin.Enjeksiyondan 12 gün sonra, önümüzdeki iki hafta boyunca her gün larvaları kontrol etmeye başlayın. Larvaları ince bir fırça kullanarak standart koşullar altında yetiştirmek için filizlenmiş mısır ve toprak içeren bir yetiştirme kutusuna aktarın. Kök kurdunun germ hattı transformasyonu, plazmit taşıyan bir transpozaz ile plazmid taşıyan bir transpozonun hücre öncesi embriyolara birlikte enjekte edilmesiyle denendi.Hayatta kalan 26 kişide, donör eleman yerleştirmeyi taramak için her EFP ifadesi kullanıldı. Torasent döller tespit edilmesine rağmen, kök kurdu embriyolarının yoğun ışık kaynağı ile taranmasının ölümcül olduğu kanıtlanmıştır. Germ hattı dönüşümünün bir sonraki turu, Drosophila melanogaster'den yapısal olarak aktif bir promotör tarafından yönlendirilen kırmızı bir floresan protein geni kullandı.Hayatta kalma oranları iyileşti, ancak sadece bir DS kırmızı pozitif larva kaydedildi. Daha sonra, embriyolar tek başına tampon ile veya yardımcı ve toresan olarak işaretlenmiş donör DNA plazmitleri ile mikroenjekte edildi. Tek başına plazmitler veya tampon ile enjekte edildiğinde yumurtadan çıkan benzer bir embriyo oranı.Ve ilginç bir şekilde, enjekte edilmemiş embriyoların sadece yarısı yumurtadan çıktı. Bu, embriyoları enjeksiyon için manipüle etmenin ölümcüllüğünü, enjeksiyonu gerçekleştirmek kadar yüksek hale getirdi. Bu videoyu izledikten sonra, Western Corn Rootwall embriyolarının nasıl mikro enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik kullanılarak saatte iki ila üç yüz embriyo enjekte edilebilir. Bu yöntem, Drosophila melanogaster'in germ hattı dönüşümü için geliştirilen ve diğer birçok türe uygulanabilir şablonlar olarak hizmet eden tekniklere borçludur. Bu prosedürü takiben, Western Corn Rootwall'un genomunda hedeflenen mutasyonları yapmak için CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Genom fonksiyonu ile ilgili belirli soruları cevaplamak için.

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.

Gonad Mikroenjeksiyonu: C. elegans'ın Germ Hattına Doğrudan Bileşik Verme Yöntemi

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Burada, Nasonia vitripennis'te etkili pupal ve yetişkin enjeksiyonları için yöntemleri embriyo mikroenjeksiyonuna erişilebilir alternatifler olarak tanımlıyoruz ve RNA paraziti (RNAi) yoluyla RNA susturma veya CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi yoluyla gen nakavt kullanarak ilgi genlerinin fonksiyonel analizini sağlıyoruz.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Burada, CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenlemesi yoluyla genomlarını değiştirmek veya germline dönüşümü yoluyla işaretli transpoze edilebilir elementlerin eklenmesi amacıyla hücre öncesi mısır planthopper embriyolarının toplanması ve mikroenjekte edilmesi için protokoller bulunmaktadır.

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Öğrenin embriyo mikroenjeksiyon yöntemiyle Western Corn Rootworm genomunu CRISPR/Cas9 ile düzenlemeyi. Bu teknik, zararlı direnç mekanizmalarını anlamak için fonksiyonel genomik çalışmalara olanak tanır.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme (Video) | JoVE Journal

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Daha fazla video keşfet