Name: Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Keşfedin, fisyon mayasında rpt4+ genini hedefleyerek heterokromatin kararsızlığına neden olan mutasyonları taramak için rastgele mutagenez yöntemini. Bu teknik, temel genleri incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje için destek finansman temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı ve ICT (2016R1A2B2006354) tarafından desteklenen NMK) tarafından sağlandı.

1. medya hazırlanması
<ol><li>Maya Özü Takviyeler ile (Evet), Evet adenin (Evet düşük Ade), Pombe Glutamat orta (PMG12) ve PMG adenin (PMG-Ade) Tablo 1' de açıklandığı gibi bileşenleri karıştırarak hazırlayın. Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade plakaları, aynı bileşenleri hakkına sahiptir, ancak adenin ikinci gelen atlanır.<ol>
<li>Aşağıdaki tuz (50 x) hisse senedi kullanın: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl,4 ' te distile su böylece 2 g/L Na2. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Aşağıdaki vitamini kullanmak (1, 000 x) hisse senedi: 1 g/L pantothenate, 10 g/L nikotinik asit, 10 g/L inositol, 10 mg/L biotin distile su içinde. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Aşağıdaki maden kullanın (10, 000 x) hisse senedi: 5 g/L Borik asit, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0.4 g/M CuSO4·5H2O , 10 g/L sitrik asit distile su içinde. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın Not: Evet sıvı orta agar ihmal olarak yapılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otoklav orta ve 60 ° C 200 rpm hızında bir heyecan çizgiyle karıştırma sırasında aşağıda için serin.</li>
	<li>Evet + G418 (geneticin) plakalar için 1 mL/L G418 hisse senedi çözüm Evet Orta olarak ekleyin.<ol>
<li>Aşağıdaki G418 kullanın (1, 000 x) hisse senedi: 100 mg/mL G418 distile su içinde. Filtre sterilize 0,22-µm gözenek boyutu filtre, 1,5 mL santrifüj tüpleri ve mağaza aliquot-20 ° C'de kullanma</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başka bir 5-10 dk ve aliquot için medya içine 90 mm Petri yemekler (1 litre kabaca 40 Petri yemekler için orta aliquots. ilave edin Plakayı 4 ° C'de depolayın</li>
</ol>2. klonlama rpt4 + ve onun 5' / 3' UTRs
<ol><li>PCR astar p1 ve p2 ile gerçekleştirmek (şekil 1A) fisyon kullanarak şablonu olarak toplam hacmi 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim reaksiyon arabellek x 1), genomik DNA (gDNA) Maya ve Tablo 2 ' de açıklanan tepki döngüleri uygulama yükseltmek 3,315 Bankası rpt4 + ve onun 5' / 3' UTRs oluşan çift (bp) parçası. Bir arıtma seti13 (şekil 1A) üretici tarafından belirtilen şekilde kullanarak PCR ürünü arındırmak.</li>
	<li>PBlueScript KS(-) vektör14 ve 16-18 için bir su banyosunda 37 ° C'de rpt4 + ile onun 5' / 3' UTRs BamH1 ve Xho1 ile 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim, 1 x sindirim arabellek) toplam hacmine içeren güçlendirilmiş DNA parçası sindirmek h (şekil 1B).</li>
	<li>Jel arındırmak sindirilir vektör (% 1.2 özel jel) ve DNA eklemek TAE-esaslı özel Jel Elektroforez (100 V, 1 h) gerçekleştirme, DNA bantları istenilen boyutlarda bilincin ve jel ekstraksiyon kiti15ile DNA izole.</li>
	<li>Vektör ve DNA ekle 50-100 ng vektörünün DNA ' sını içeren 20 µL ligasyonu tepki gerçekleştirerek T4 DNA ligaz kullanarak ligate bir ~ Ekle DNA, 400 U T4 DNA ligaz ve 1 tüp ligasyonu arabellek x 3 kat molar fazlalığı. Bu karışım için 16-18 h 18 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Isı şok 70 için uygulayarak ve birleştirilmiş DNA E. coli DH5α 100 µL dönüştürmek 42 ° C'de s 1 mL LB ekleyin ve kurtarma için 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Santrifüjü (13,800 x g) gerçekleştirmek, tüm dönüştürülmüş E. coli LB-Ampisilin (LA) Tabaklarda hücreleri ve 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya süpernatant, plaka atın.</li>
	<li>4-8 kolonileri kürdan ile almak ve gece 3 mL LA orta 37 ° C'de büyür.</li>
	<li>Üreticinin protokole göre kullanılan bir plazmid arıtma kiti ile16 plazmid ayırmak ve izole plazmid, 5 U her restriksiyon enzimi (BamH1 ve / 5 µL ile analitik restriksiyon enzimi sindirim gerçekleştirmek Xho1) ve 1 x kısıtlama arabellek. 37 ° C 3 h. aday plazmid sıralama tarafından klonlama Onayla için bir su banyosunda tepki karisimin kuluçkaya.</li>
</ol>3. giriş sessiz mutasyon (Xho1 kısıtlama Site)
<ol><li>Aksi takdirde tamamlayıcı sırayla istenen mutasyon içeren 33-bp astar (p3 ve p4) çifti Tasarla.</li>
	<li>Yüksek sadakat polimeraz17 ile (şekil 1 c) toplam hacmi çok 25 µL PCR gerçekleştirmek (10 ng klonlanmış plazmid, 10 pmol astar mix, 2 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL) Bisiklete binme parametrelerini kullanarak listelenen Tablo 3' te.</li>
	<li>Ben bir su 37 ° C'de 20 µL (20 U enzim, 1 x sindirim arabellek) toplam hacmine 1 s banyo Dpnile şablon plazmid sindirmek.</li>
	<li>Dönüşümü, yaymak, ayırma ve adımları 2.5-2.7 açıklandığı gibi sessiz mutasyon içeren Plazmid dizi. Not: Sessiz mutasyon aynı zamanda birden fazla DNA parçalarının tek tepki18katılmak için izin veren bir klonlama yöntemi kullanarak tanıttı olabilir.</li>
</ol>4. rasgele Mutagenesis rpt4 + hataya PCR tarafından
<ol><li>Hataya PCR, plazmid sessiz mutasyon (Xho1 sitesi) ile kullanarak gerçekleştirmek şablonu, astar p5 ve p6, toplam hacmi 50 µL (Adım 4.1.1, 10 pmol astar mix, 2.5 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL tanımlanmış şablon miktarı) olarak , ve yüksek bir hata üretmek için tasarlanmış özel bir polimeraz oranı19 (şekil 1 d). PCR Tablo 2' de açıklandığı gibi gerçekleştirin.<ol>
<li>4-5 µg şablon plazmid, mutasyon sıklığı 1 bp/KB (kilobaz) kontrol etmek için kullanın. Not: Bir yüksek konsantrasyon (> 500 ng/µL) bir mini hazırlık seti20kullanarak elde edilebilir, plazmid gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel Elektroforez, PCR ürünü 2670 BP (% 1.2 özel jel) onaylamak için kullanın. Jel 2.5 adımda anlatıldığı gibi bu PCR ürünü arındırmak.</li>
</ol>5. füzyon PCR parçaları (KAN, 3' UTR) hazırlanması
<ol><li>PFA6a-KANMX621 şablonu, astar p7 ve p8 kullanarak PCR gerçekleştirmek ve koşulları işaretleyici (KAN) parçası elde etmek için Tablo 4'te listelenmiş. Jel 2.5 (şekil 1E) adımda anlatıldığı gibi elde edilen 1.480-bp parçası arındırmak.<ol>
<li>Hedef için mutasyon ve kodlayıcı bölge onun bitişik gen gen kodonu fazla 500 tarafından ayrılmış Eğer kontrol kan basıncı. Bu bölgede 500'den az olduğunda endojen Sonlandırıcı kullanılamaz bp; daha doğrusu, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanılmalıdır. ADH Sonlandırıcı kullanmak için gereken protokol değişiklikleri Tablo 5' te sunulmaktadır. Not: PFA6a-3HA-KANMX6 plazmid mevcuttur, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanıldığında bu değişiklikler yalnızca geçerli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR klonlanmış rpt4 +ile gerçekleştirmek-vektör olarak şablon ve astar p9 ve toplam hacmi 50 µL p10 içeren (20 ng klonlanmış plazmid, 10 pmol astar mix, 2 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL), Tablo 6' da sunulan koşul kullanma. Jel (şekil 1E) elde edilen 506-bp 3' UTR parçası arındırmak.</li>
</ol>6. nesil Fusion PCR (şekil 1E) dönüşümü yapı
<ol><li>3 parçaları (mutagenized rpt4 +, KAN ve 3' UTR) 50 ng/µL, hazır olun.</li>
	<li>PCR üç parçaları astar p11 ve p12, kullanarak tablo 7'de açıklandığı gibi füzyon gerçekleştirin. (Fusion PCR için bir değişiklik orijinal protokolü22protokoldür.) Önemli 4,398-bp PCR ürünü arındırmak.<ol>
<li>Rpt4 +kullanın: KAN:3'UTR parçaları 1 oranında: 3:1 en iyi sonuçlar için. Not: INSERT DNA'ın toplam tutarı 500 geçmemelidir ng. Önerilen miktarı rpt4 +: KAN:3'UTR 50 ng:150 ng:50 ng olduğunu. Diğer üç mutasyona uğramış her Bankası tüm olası birleşimlerini için hesap olacaktır Maya kolonileri az sayıda 1,600 x 3 = 4800 bu yüzden yaklaşık 1,6 kb, mutagenized bölgesidir koloniler. Bir dönüştürme tepki genellikle 400-500 kolonileri verimleri çünkü değer en az 10 reaksiyonlar füzyon PCR oluşturmak gereklidir. 10 kat yalnızca tepki tutarı (Yani, PCR tüpleri sayısı) artırarak bu ihtiyacı karşılanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. fisyon mayası elektroporasyon (şekil 1F) tarafından dönüşümün
<ol><li>Maya Evet orta doygunluk için 10 ml den fazla 16 h için kuluçka tarafından aşılamak.</li>
	<li>600 optik bir yoğunluk hücrelere seyreltik nm (OD600) 0,2 200 ml Evet orta ve 30 ° C'de 5-6 h, OD600 için sallayarak ile kuluçkaya = 0,6 - 0,8.</li>
	<li>OD600 hücrelere konsantre = 30, dört 50 mL konik tüpler için dağıtmak ve chill buz 10 dk için.</li>
	<li>4 ° C'de 3 dk aralıklarla 1.050 x g de gerçekleştirerek hücreleri hasat Tüpler ve 10 electro-cuvettes Buza koyun. 7.3-7,8 adımları buz üzerinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Süpernatant atın ve 1, 2 M sorbitol 15 mL ekleyin. Hücreleri resuspend tüplere hafifçe sallayın.</li>
	<li>Hücreleri vasıl 1050 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi</li>
	<li>7.4 ve 7,5 adımları yineleyin. Süpernatant atmak. 1, 2 M sorbitol 500 µL her tüp eklemek, hücreleri resuspend ve bir 15 ml konik tüp içinde hücrelerin tümünü toplamak.</li>
	<li>1, 2 M sorbitol eklemek 2.4 mL (OD600 = 0.2 mL başına 10). Tüp buz üzerinde tutun.</li>
	<li>200 µL (onlar tam olarak askıya emin olun) sorbitol askıya hücre eklemek için füzyon PCR içeren bir EP tüp oluşturun, iyice karıştırın ve örnek bir elektro-küvet için transfer.</li>
	<li>Electroporate aşağıdaki seçenekleri içeren hücreleri: Mantarlar, ShS (2.00kV, 1 darbe).</li>
	<li>Her elektro-küvet için 800 µL toplam hacmi 1.2 M sorbitol 600 µL ekleyin ve sonra hücreleri dört Evet plakaları (200 µL/plaka) yayıldı. On elektro-cuvettes 40'a Evet plakaları dağıtmak olacaktır.</li>
	<li>Plakayı 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Evet + G418 için yineleme kaplama gerçekleştirmek ve tabak 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.</li>
</ol>8. seçimi, Heterochromatin kararsız hale mutantlar ve yanlış pozitif olarak kontrol
<ol><li>Her Evet + G418 plaka için yineleme kaplama Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade (Hayır Ade) plakalar için gerçekleştirin. Bazı Evet-Ade plakaları kolonileri kırmızı rengi (şekil 1G) göstermek kadar yineleme tabak 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Evet-Ade ve PMG-Ade plakaları ve pembe veya beyaz Evet-Ade plaka üzerinde göstermek ve ayrıca PMG-Ade plaka üzerinde büyümeye seçme hücreleri karşılaştırın. Yanlış pozitif (KAN kaset genom başka bir yerindeki bir sigara hedef sitede entegre yansıtanmesela ) oldukları gibi kolonileri PMG-Ade, büyüme olmadan seçin.</li>
	<li>Her koloni yaklaşık 1 x 105 hücreleri seçin ve 2,5 mg/mL zymolyase 100 T en az 30 dk. kullanım 1 µL PCR (şekil 1 H) koloni için başlangıç şablon olarak gerçekleştirmek için bu çözüm için 37 ° C'de içeren SPZ çözüm 10 µL kuluçkaya.<ol>
<li>SPZ (50 mL) 2 M sorbitol 30 mL, 1 M Na2HPO44,05 mL, 0.95 mL NaH2PO4 ve 15 mL distile su (son pH, 7,5) karıştırılarak olun. Örnekleri (5 mL) zymolyase ile desteklenmiş ve 500 µL aliquots-20 ° c kadar kullanmak saklanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonuçlarını + koloni PCR görselleştirmek için Jel Elektroforez (% 1.2 özel jel, 180V, 20 dk) gerçekleştirin. Uygun Boyut grupları PCR sergi ve her reaksiyon ürünü Xhoile 5 µL sindirmek reaksiyonlar seçin ben (4 U enzim, 1 x sindirim tampon, 37 ° C su banyosu, 1 h) yanlış pozitif (Resim 1 H) ekran için.</li>
	<li>XhoI özetleri (% 1.2 özel jel, 180 V, 20 dk) görselleştirmek için Jel Elektroforez gerçekleştirin. PCR ürünleri XhoItarafından kesilir ve bunları Evet + G418 tabak (şekil 1I) yama kolonileri işaretleyin.</li>
	<li>GDNA füzyon Maya hücreleri izole ve PCR ürünleri23nın gerçekleştirin. Elde edilen sıra mutasyonlar (şekil 1I) tanımlamak için vahşi-tipi kol ile karşılaştırın.</li>
	<li>Doğrudan mutation(s) vahşi tipi hücrelere mutant hücreleri23PCR tarafından güçlendirilmiş füzyon yapıları ile dönüştürerek yeniden tanıtmak. Lekelenme fenotip yeni yapılan mutant hücrelerdeki (şekil 1J) onaylamak için kullanın.<ol>
<li>Füzyon dönüşümü yapı kolay güçlendirilmiş PCR tarafından astar p1 ve p10 ile genomik DNA mutant toplam hacmi 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim reaksiyon arabellek x 1), şablon olarak kullanarak ve Tablo 2 açıklanan tepki döngüleri uygulama . Yapı dönüşümü 7.1-7,13 adımları izleyerek yapılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+error-prone+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+shuffling+works%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How DNA shuffling works.</a> Science. 293 (5528), 237(2001).</li>
<li>Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+26S+Proteasome+subunit+RPT4a+regulates+ToLCNDV+transcription+and+activates+hypersensitive+response+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato.</a> Sci Rep. 6, 27078(2016).</li>
<li>Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sug1+modulates+yeast+transcription+activation+by+Cdc68%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68.</a> Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).</li>
<li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gal4+activation+domain+binds+Sug2+protein%2C+a+proteasome+component%2C+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro.</a> J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).</li>
<li>Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+mutants+that+alleviate+transcriptional+silencing+in+centromeric+flanking+repeats+and+disrupt+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation.</a> Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).</li>
<li>Grewal, S. I., Jia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin revisited.</a> Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForsburg%2C+SL+%22Forsburg+Lab+Recipes%3A+Fission+Yeast+Media%22">Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html">http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html</a> (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+PCR+Purification+Kit%22">QIAquick PCR Purification Kit</a>. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22pBlueScript+II+Vector%22">pBlueScript II Vector</a>. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&">http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&</a> (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+Gel+Extraction+Kit%22">QIAquick Gel Extraction Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QuickGene+SP+Kit+Plasmid+Kit+II+%28SP-PL2%29%22">QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2)</a>. , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2">https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PfuUltra+High-fidelity+DNA+Polymerase%22">PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</a>. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136">http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gibson+Assembly+Master+Mix%22">Gibson Assembly Master Mix</a>. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information">https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneMorph+II+Random+Mutagenesis+Kits%22">GeneMorph II Random Mutagenesis Kits</a>. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057">http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057</a> (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plasmid+Plus+Midi+Kit%22">Plasmid Plus Midi Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/">http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/</a> (1999).</li>
<li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li>
<li>Szewczyk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+PCR+and+gene+targeting+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).</li>
<li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNurse%2C+P+%22Fission+Yeast+Handbook%22">Fission Yeast Handbook</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx">https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx</a> (2000).</li>
<li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="https://peerj.com/preprints/3377/">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).</li>
<li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Rastgele mutagenesis hataya PCR ile belirli bir bölgede mutantların farklı bir havuz oluşturmak için güçlü bir araçtır. Bu teknik özellikle belirli bir koşulda bir proteinin işlevini değerlendirmek için arama çalışmaları için yararlıdır. Örneğin, biz burada kullanılan hataya PCR 19S proteasome alt birimi, Rpt4, heterochromatin bakım işlevini değerlendirmek için. Değişen tarafından bölge tarafından hataya PCR hedef ve tarama Koşulları ayarlama, faiz ve ekran için istenen fenotip genomik bölgesi hücreleri mutasyona başardı...

İleri genetik hangi araştırmacılar belirli bir fenotip görüntülemek doğal olarak meydana gelen mutantlar aramak ve genetik çözümlemesi klasik bir yöntemdir. Ters Genetik mutasyonlar faiz bir gen tanıtıldı ve fenotip inceledi. İkinci durumda, hedef gen rasgele mutagenesis kez daha sonra sıcaklık hassasiyeti gibi istenen fenotipleri için seçilir veya enzimatik aktivite değiştirilen mutant bir havuz oluşturmak için kullanılır. Rastgele mutagenesis, hataya PCR1de dahil olmak üzere elde etmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir; UV ışınlama2; kimyasal mutajen, etil methanesulfonate (EMS) veya Nitröz asit3gibi; Bu mutD5 4aşırı ifade gibi geçici mutator suşları kullanımı; ve DNA5karıştırma.
Burada, hangi biz hataya PCR için bir hedef gen mutasyona uğramış havuzları fisyon mayası oluşturmak için kullanmak için bir ters-genetik strateji tanımlarlar. Bir adından tahmin edebileceğiniz gibi bu yöntem kasten PCR sırasında hataları tanıtarak mutasyonlar oluşturur. Diğer mutagenesis yöntemlerinden farklı olarak, hataya PCR mutagenized için bölge tanımlamak kullanıcı sağlar. Bu çabaları ilgi bir protein/etki alanı işlevinin çalışması için özellikle faydalı kılmaktadır.
Bu rasgele mutagenesis yordamı göstermek için biz burada 19S proteasome alt birim kodlar, rpt4 +, örnek olarak kullanın. Rpt4 fisyon mayası6,7,8,9farklı organizmalarda proteolizis bağımsız işlevler için gösterilmiştir ve proteolizis bir üründe proteinler değiştirerek dolaylı etkilere neden düzeyleri. Biz bu nedenle, proteolizis bağımsız değişiklikler, proteasome heterochromatin Tarih işlevi araştırma amacı ile tetiklenen mutantlar tarandı.
Hataya PCR, astar bağlama konumu ayarlama tarafından herhangi bir gen bölgesine uygulanabilir. İstenen fenotipik değişikliği gösteren mutantlar ile uygun gazetecilere tespit edilebilir. Burada, eklenen bir ade6 + muhabir kullanılan Şeması 1 dış tekrar (otr) bölgesi10. Ade6 + muhabir vahşi Türü koşulunu susturdu Yani bünye heterochromatin bu bölge11, oluşturulur; Bu kırmızı kolonileri10tarafından belirtilir. Şeması, bünye heterochromatin oynattığını bir mutasyon hangi beyaz koloniler görüntülenir ade6 + muhabir ifade sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. Medya< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenin sülfat</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Urasil ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-histidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&boğa; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ftalat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>İnositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&boğa; 7H<alt>2</alt>O&nbsp;</td><td>HAZİRAN</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl<alt>2</alt> boğa; 4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum molibdat dihidrat</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-miyo-inositol</td><td>MP biyomedikaller</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenat</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr> <tr><td>(NH < altı > 4 ) 2 SO4 nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Biyobazik</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, genetik</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>2. Enzim reaksiyonları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Füzyon HS DNA Polimeraz</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>Bölgeye yönelik mutajenez</td></tr><tr><td>için GeneMorphII Rastgele mutajenez Kiti</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>Hataya meyilli PCR</td></tr><tr><td>Phusion için Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>Füzyon PCR</td></tr><tr><td>Ex Tak&nbsp; Genel</td><td>PCR</td>için DNA Polimeraz <td>Takara</td><td>RR001b</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3. Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kadife kare, siyah</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>Çoğaltma</td></tr> için <tr><td>Çoğaltma kaplama aracı</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>Çoğaltma</td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporatör</td><td>Biorad</td><td>1652100 için</td><td>Fisyon mayası dönüşümü için</td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küvetleri, 0,2 cm boşluk</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp;</td><td>Fisyon mayası dönüşümü için</td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>Füzyon PCR rampa reaksiyonu için&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fisyon mayası heterochromatin kararsız hale proteasome mutantlar seçmek için rasgele mutagenesis gene hedefli

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Bir hedef gen rasgele mutagenesis sık istenen fenotip verim mutasyonlar tanımlamak için kullanılır. Rastgele mutagenesis elde etmek için kullanılabilecek yöntemleri, hataya PCR mutantların farklı bir havuz oluşturmak için uygun ve verimli bir strateji olduğunu (i.e., mutasyona uğramış bir kütüphane). Hataya PCR yönteminin seçimi olduğunda bir araştırmacı genomik diğer bölgeler etkilenmemiş bırakarak bir genin kodlama bölge gibi önceden tanımlanmış bir bölge mutasyona istiyor. Mutant kütüphane tarafından hataya PCR güçlendirilmiş sonra uygun bir plazmid klonlanmış gerekir. Hataya PCR tarafından oluşturulan Kütüphane boyutu klonlama adım verimlilik ile sınırlıdır. Ancak, fisyon mayası, Schizosaccharomyces pombe, klonlama adım yüksek verimli tek adımlı füzyon dönüşüm yapıları oluşturmak için PCR kullanımı tarafından değiştirilebilir. İstenen fenotipleri mutantlar sonra uygun gazetecilere kullanarak seçilebilir. Burada, biz bir örnek, centromeric heterochromatin eklenen bir muhabir olarak alınmıştır ayrıntılı olarak, bu strateji tanımlarlar.

Şekil 1 ' de açıklanan yordamları izleyerek Edinsel Rpt4 mutantlar koloniler renklerinin değerlendirmek tarafından çözümlenebilir. Kolonilerin renkleri şeklinde ilermek cep numarasını Şekil 2' deki ilgili plakalar üzerine lekeli. Heterochromatin bölge eklenen ade6 + muhabir vahşi türü susturdu ve kırmızı kolonileri Evet-Ade tabak içinde gösterir. Bir kez heterochromatin dengeleri bozdu ve ade6 + muhabir ifade ed...

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Bu rastgele mutajenezin genel amacı, heterokromatini dengesizleştiren mutasyonları taramaktır. Bu yöntem, heterokromatinin oluşumunu ve bakımını düzenleyen faktörler gibi heterokromatin alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gen gerekli olsa bile, mutajenez için istenen bir geni spesifik olarak hedefleyebilmesidir.Başlamak için, bileşenleri bu tabloda gösterildiği gibi karıştırarak takviyeli maya özütü veya adeninsiz EVET, Pombe Glutamat Ortamı veya PMG ve adeninsiz PMG hazırlayın. Otoklavladıktan ve gerekirse G418'i ekledikten sonra, ortamı beş ila on dakika daha karıştırın. Ardından, ortamı 90 mililitrelik Petri kaplarına koyun ve plakaları dört santigrat derecede saklayın.Klonlanmış rpt4 pozitifini, beş asal ve üç asal UTR'si ve sessiz mutasyonunun yanı sıra p5 ve p6 primerleri ve yüksek bir hata oranı oluşturmak üzere tasarlanmış özel bir polimeraz kullanarak, toplam 50 mikrolitrelik bir hacimde hataya açık PCR gerçekleştirin. Bir dönüşüm-füzyon yapısı oluşturduktan sonra, metin protokolüne göre, on mililitre YES ortamını maya ile aşılayın ve doygunluğa kadar 16 saatten fazla inkübe edin. Hücreleri 0.2'lik bir OD600'e seyreltmek

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Burada, tomurcuklanan mayadaki kimyasal-genetik etkileşimleri tanımlamak için uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yaklaşım, maya moleküler biyolojisindeki temel teknikler üzerine inşa edilmiştir ve küçük ila orta ölçekli kimyasal koleksiyonlarının ve diğer ortam ortamlarının mekanik sorgulaması için çok uygundur.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Genetik olarak kodlanmış histon miniSOG mavi ışığa bağımlı bir şekilde genom kalıtsal mutasyonlara neden olur. Bu mutajenez yöntemi, hızlı, basit toksik kimyasalların serbest ve ileri genetik tarama ve transgen entegrasyonu için çok uygundur.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Saccharomyces cerevisiae'deki endojen konumlarında histon genlerinde mutasyon oluşturmak için bir strateji sunulmuştur.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Sıcaklığa duyarlı (ts) ölümcül mutantlar, temel işlevleri tanımlamak ve analiz etmek için değerli araçlardır. Burada, yüksek verimde ölümcül mutantları üretme ve sınıflandırma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Keşfedin, fisyon mayasında rpt4+ genini hedefleyerek heterokromatin kararsızlığına neden olan mutasyonları taramak için rastgele mutagenez yöntemini. Bu teknik, temel genleri incelemek için değerli bir araçtır.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Daha fazla video keşfet