Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama
August 3rd, 2018
Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.
Bu yöntem, prekanseröz klonların tespiti, tedaviyi takiben lösemi hastalarının prognostik değerlendirmesi ve kemik iliği donörlerinde potansiyel olarak patojenik mutasyonların tanımlanması gibi çeşitli araştırma alanlarındaki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürü benimle birlikte gösteren Spencer, laboratuvarda bir teknisyen. Bu video, 10.000'de bir hassasiyette klonal tek nükleotid varyantlarını ve küçük indelleri tespit etmek için Hata Düzeltmeli Dizileme Protokolünün Illumina kimyası ve ticari olarak mevcut gen panelleriyle nasıl birleştirileceğini açıklamaktadır.
Gerekli benzersiz moleküler tanımlayıcıları dahil etmek için özelleştirilmiş 16N i5 ve i7 adaptörleri PCR kullanır. İlk olarak, piyasada bulunan alternatiften daha yüksek sadakate sahip bir polimeraz kullanan Q5 Master Mix'i hazırlayın. Ardından, her reaksiyon için 37,5 mikrolitre Q5 Master Mix, benzersiz moleküler tanımlayıcılar olan altı mikrolitre beş mikromolar 16N i5 adaptörü ve altı mikrolitre i7 adaptörünü birleştirin.
Hedef çoğullama ise, ayrı örneklerde farklı i7 adaptörleri kullanın. Şimdi, aşağıdaki parametreleri kullanarak PCR'yi çalıştırın: 98 santigrat derecede otuz saniye, ardından 98 santigrat derecede on saniyelik dört ila altı döngü, 66 santigrat derecede otuz saniye ve 72 santigrat derecede otuz saniye. Reaksiyonu 72 santigrat derecede iki dakikalık bir uzatma ile bitirin ve dört santigrat derecede tutun.
Daha sonra, üzerlerinde yapmanız gereken her iki PCR döngüsü de büyük olasılıkla kullandığınız gen panelinin boyutuna bağlıdır, deneyimlerimize göre, gen panelinin yaklaşık 1500 farklı gene özgü oligo yolu varsa dört döngülü bir PCR yeterlidir, oysa yaklaşık beş ila 600 çift oligo içeren bir panel yaklaşık altı döngü PCR gerektirir. Daha sonra, manyetik boncuklar kullanarak PCR reaksiyonlarını temizleyin, her 75 mikrolitrelik PCR ürününe 56.25 mikrolitre manyetik boncuk çözeltisi ekleyin, ardından her reaksiyonu ayrı bir 1.5 mililitre düşük bağlayıcı tüpe aktarın, en az on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve beş dakika bekleyin. Ardından, karışımları manyetik bir tutucuya aktarın ve süpernatantların iki dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
Ardından, süpernatantları çıkarın ve atın. Daha sonra 200 mikrolitre% 70 etanol ekleyin, otuz saniye bekleyin ve ardından etanolü çıkarın. Bu etanol yıkama adımını bir kez tekrarlayın ve ardından boncukların beş dakika kurumasını bekleyin.
Son olarak, modifiye edilmiş kitaplıkları boncuklardan yirmi mikrolitre çift damıtılmış suda boşaltın. Ardından, manyetik boncukları eluentten ayırmak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. İlk olarak, ECS kütüphanelerinin önceki adımdan PCR şeritlerinde 1.000'de bir parçaya kadar on kat seri seyreltmelerini yapın.
Ardından, 1,5 mililitrelik bir tüpte bir Master Mix hazırlayın. Her reaksiyon için 10 mikrolitre ddPCR EvaGreen Mix, 0.2 mikrolitre P5 astar, 0.2 mikrolitre P7 astar ve 4.6 mikrolitre çift damıtılmış suyu birleştirin. Ardından, 15 mikrolitre EvaGreen Master Mix'i yeni bir tüp setine pipetleyin ve son olarak Master Mix'e bir ila 1.000 ECS temizlenmiş üründen beş mikrolitre ekleyin.
Ardından, damlacık üretecini kullanarak PCR damlacıkları yapın. İlk olarak, kaseti yükleyin, kasetin kuyusuna 70 mikrolitre damlacık üretim yağını pipetleyin, etiketli yağ ve 20 mikrolitre ddPCR reaksiyon karışımını iyi etiketlenmiş numuneye pipetleyin. Ardından, kaseti lastik bir contayla kapatın ve damlacık üretecine yükleyin ve devam etmek için tüm damlacık oluşumunu yapın.
Şimdi, çok kanallı bir pipet kullanarak, yavaşça, beş saniyeden fazla, her bir kaset kuyucuğundan alınan 45 mikrolitre damlacıkları yeni bir PCR plakasına yükleyin. Ardından, PCR plakasını bir alüminyum folyo ile kapatın. Şimdi, aşağıdaki koşulları kullanarak damlacıklardaki sinyali yükseltin: 95 santigrat derecede beş dakika, ardından 95 santigrat derecede otuz saniyelik 40 döngü ve 63 santigrat derecede bir dakika, ardından reaksiyonu beş dakika boyunca 90 santigrat dereceye yükseltmeden önce beş dakika boyunca dört santigrat dereceye soğutun, ve sonra dört santigrat derecede tutmak.
Ardından, ddPCR şablonu damlacık okuyucu makinesini hazırlayın. Mutlak miktar tayini ve QX200 ddPCR EvaGreen Supermix'in kullanımı için parametreleri seçin. Ardından, reaksiyonları damlacık okuyucudan geçirin.
ddPCR analizi tamamlandığında, her numuneye aynı bölücü eşikleri uygulayın. Ardından, her kitaplığı istenen sayıda moleküle normalleştirin. 25 mikrolitre Q5 Master Mix, iki mikrolitre bir mikromolar P5 primeri, iki mikrolitre bir mikromolar P7 primeri ve 21 mikrolitre normalleştirilmiş DNA kütüphanesinden oluşan 50 mikrolitrelik reaksiyonlar yaparak başlayın.
Ardından, aşağıdaki parametreleri kullanarak PCR'yi çalıştırın: 98 santigrat derecede 30 saniye, ardından 98 santigrat derecede 10 saniyelik 16 döngü, 66 santigrat derecede otuz saniye ve 72 santigrat derecede otuz saniye, ardından 72 santigrat derecede iki dakika ve dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, kütüphanelerdeki DNA konsantrasyonunu ölçün ve kütüphaneleri dizileme için eşit molar miktarlarda toplayın, kabaca dört nanomolar hedefleyin. Şimdi, Illumina sıralama platformunu kullanarak havuzlanmış ECS kitaplığını aşağıdaki sıralama ayarlarıyla sıralayın: iki kez 144 çift uçlu okuma, sekiz döngü dizin bir ve 16 döngü dizin iki.
GATA1'de mutasyonu olan bir hastanın DNA'sı, 0.19'luk orijinal VAF'de ticari genomik DNA'da seyreltildi. Açıklanan protokolü kullanarak, ECS'nin tek nükleotid varyantı için bir ila 10.000 seviyesine kadar kantitatif olduğu kanıtlandı. Daha sonra, yirmi sağlıklı bireyden alınan buffy coat örnekleri, 568 amplikondan oluşan ticari bir dizileme paneli kullanılarak analiz edildi.
Özetle, 0.0003 ila 0.1451 arasında değişen varyant alel fraksiyonları ile en az bir toplama zaman noktasının her iki kopyasında da 109 klonal somatik mutasyon mevcuttu.21 bilinen kozmik temsillere sahip mutasyonların her biri seçildi ve her biri dijital damlacık PCR kullanılarak doğrulandı. Protokolün hata düzeltilmiş ekspresyon seviyesini göstermek için, çeşitli kanserlerle ilişkili olduğu bilinen 415 genden oluşan özelleştirilmiş bir gen paneli, her bir genin en yaygın eksprese ekzonundan oluşturulmuş bir kütüphane üretmek için kullanıldı. Düşük bolluklu transkriptin ifade seviyesi, replikalar arasında yüksek oranda tekrarlanabilirdi.
Dijital damlacık PCR daha sonra değişen ifadelere sahip altı seçilmiş geni doğrulamak için kullanıldı. Bir karşılaştırma, genlerin ekspresyon seviyesinin, normalizasyona gerek kalmadan ECS protokolü tarafından doğru bir şekilde yakalandığını göstermektedir. Tekniğe hakim olduktan sonra bu teknik bir buçuk günde konforlu bir şekilde yapılabilir.
Zamanın büyük bir kısmı inkübasyon olacaktır ve manuel kullanım, araştırmacıların aynı anda kaç numune işlediğine bağlı olarak gereken toplam sürenin yaklaşık% 30-40'ını alır. Bu prosedürü denerken, aynı örnek için bir replikasyon sıralama kütüphanesine sahip olmak çok önemlidir. Bu, mutasyonun kendisi her iki replikasyonda da bağımsız olarak çekirdek ise, düşük frekanslı bir mutasyonun gerçek pozitif olduğuna dair size daha fazla güven verecektir.
Bu prosedürü takiben, düşük bolluklu transkript tespiti veya füzyon transkripti gibi soruları yanıtlamak için ECS RNA gibi diğer konular gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik öncelikle hematolojik maligniteler alanındaki araştırmacıların önünü açtı ve bu tekniği sağlıklı bireylerde pre-lösemik klonları araştırmak ve remisyonda olan lösemi hastalarında minimal rezidüel hastalığı tespit etmek için kullanıyoruz.
Genel Bakış
Bu makale, yeni nesil sekanslamanın (NGS) hata oranını azaltarak doğruluğunu artıran bir hata düzeltmeli sekanslama yöntemini tartışmaktadır. Teknik, çok düşük varyant alel fraksiyonlarında mutasyonların tespit edilmesine olanak tanır ve bu da onu çeşitli araştırma uygulamaları için değerli kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genomik
- Sekanlaştırma Teknolojileri
- Mutasyon Algılama
Arka Plan
- Yeni nesil sekanslama (NGS) yaklaşık %0,5–2,0 oranında yüksek bir hata oranına sahiptir.
- Hata düzeltmeli sekanslama yöntemleri bu hata oranını azaltabilir.
- Nadir mutasyonların tespiti onkoloji ve genetik gibi alanlarda kritik öneme sahiptir.
- Eşsiz moleküler tanımlayıcılar, doğru mutasyon algılaması için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Illumina kimyası kullanarak hata düzeltmeli sekanslama için bir protokol sunmak.
- Yöntemin klonal tek nükleotit varyantlarını tespit etmedeki hassasiyetini göstermek.
- Protokolün çeşitli araştırma bağlamlarındaki etkinliğini doğrulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek sadakat polimeraz içeren Q5 Master Mix'in hazırlanması.
- Özel adaptörler aracılığıyla eşsiz moleküler tanımlayıcıların kullanılması.
- Spesifik döngü parametreleriyle PCR amplifikasyonu.
- Mutasyonların miktarlandırılması ve doğrulanması için dijital damla PCR.
Ana Sonuçlar
- 0,0001 kadar düşük varyant alel fraksiyonlarında mutasyonların başarılı bir şekilde tespiti.
- Çeşitli örneklerde 109 klonal somatik mutasyonun tespiti.
- Dijitaller damla PCR kullanılarak mutasyonların doğrulanması.
- Hata düzeltmeli sekanslama yönteminin nicel doğruluğunun gösterilmesi.
Sonuçlar
- Hata düzeltmeli sekanslama, mutasyon algılama hassasiyetini önemli ölçüde artırır.
- Yöntem, genomik analiz için klinik ve araştırma ortamlarında uygulanabilir.
- Daha fazla çalışma, nadir genetik varyantları tespit etmede kullanımının genişletilebileceğini gösterebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Error-corrected sequencing (ECS) addresses a critical limitation in next-generation sequencing by reducing error rates to enable detection of mutations at variant allele fractions as low as 0.0001. This capability supports early detection of pre-leukemic clones and minimal residual disease monitoring in hematological malignancies, directly impacting therapeutic decision-making and patient stratification in oncology drug development. By providing quantitative, reproducible detection of rare clonal variants, ECS enhances predictive confidence in target validation and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting clonal somatic mutations at ultra-low frequencies, supporting biological de-risking of putative cancer targets.
- Operational Value: Provides quantitative variant allele fraction measurements that clarify pathway involvement and functional relevance of genetic alterations in disease models.
- Predictive Value: Improves confidence in target prioritization by distinguishing true low-frequency mutations from sequencing artifacts, reducing false-positive leads in target validation campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, error-corrected libraries compatible with Illumina sequencing, enabling scalable screening of large gene panels for somatic variant discovery.
- Quantitative Output: Delivers precise variant allele fraction data that supports assay standardization and cross-laboratory reproducibility in mutation detection workflows.
- Platform Reuse: Facilitates multiplexed sample processing via patient-specific indices, increasing throughput and reducing per-sample cost in large-scale genotyping efforts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to monitoring minimal residual disease in leukemia patients post-treatment, aligning with clinically relevant endpoints in preclinical efficacy studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mutation detection with preclinical validation through quantitative tracking of clonal dynamics over time.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing sensitive detection of emergent resistant clones during preclinical therapy studies.
Pipeline & Workflow Integration
ECS fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in hematologic malignancy models where clonal evolution informs therapeutic response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling sensitive detection of pre-leukemic clones in healthy donor samples, clarifying origins of malignancy.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative sequencing data with high reproducibility, facilitating reliable compound screening in genetically defined models.
- Analytics: Generates precise variant allele fraction measurements and digital droplet PCR-validated outputs that allow accurate comparison of mutant burden across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through monitoring of minimal residual disease, a key biomarker in leukemia therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping capability for longitudinal tracking of clonal dynamics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mutation detection, increasing confidence in genetic biomarkers and therapeutic targets.
- Operational Value: Standardizes library preparation with unique molecular identifiers, improving reproducibility and reducing batch effects in sequencing data.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by detecting resistance mutations at clinically relevant thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on sensitivity to detect emergent clonal variants in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular library preparation, PCR optimization, and digital droplet PCR validation for accurate rare variant detection.
- Depends on access to high-fidelity polymerases, magnetic bead purification systems, and droplet generation instrumentation for library processing.
- Necessitates cross-team standardization of index design and PCR cycle numbers based on gene panel complexity to ensure multiplexing compatibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to RNA sequencing or fusion transcript detection beyond DNA-based variant calling.
- Involves practical limitations related to input DNA quality and quantity, as low-yield samples may require increased PCR cycles that could introduce bias.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Incorporating i5 and i7 Adapters onto Error-corrected Sequencing Libraries
3:36
Quantifying the Libraries with QX200 Digital Droplet PCR (ddPCR)
6:14
Amplifying and Normalizing the Libraries for Sequencing
7:37
Results: Mutation-calling with Error-corrected Sequencing (ECS)
9:14
Conclusion
