Name: Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin hata düzeltilmiş DNA ve RNA dizileme yöntemini, Illumina platformu ile nadir mutasyonları tespit etmek için. Bu protokol kanser araştırmalarında ve minimal rezidüel hastalık izleminde yüksek hassasiyet sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Katılımcılar çocuk Onkoloji grubu AAML1531 çalışma ve hemşirelerin sağlık eğitim hasta numuneleri şeklinde katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (UM1 CA186107, RO1 CA49449 ve RO1 CA149445), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi (MC-II-2015-461) ve Eli Seth Matthews Lösemi Vakfı tarafından finanse edildi.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27546487">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484(2016).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1486">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz mutasyonlar farklı hastalıklarda düşük VAFs ile çalışmaya kolayca uygulanabilir sıralama hatası düzeltildi protokol paketi olan göstermek. Hata düzeltme, ham okuma seçeneğini etkinleştirin UMIs birleşme sıralama önce her molekül ile en önemli faktör olduğunu. Yöntem tanımlamak burada araştırmacılar için piyasada bulunan gen panelleri ve kendi kendine tasarlanmış gene özgü oligos özelleştirilmiş UMIs dahil etmek izin verir.
Standart NGS protokol nedeniyle sıralama hata oranı % 2'in altında VAF ile mutasyonlar algılanmasını önler ve bu NGS uygulama nadir türevleri algılanması çok önemli nerede çalışmalarda sınırlar. Standart NGS hata oranı engellemeyi tarafından ECS hassas bu ham çeşitleri tespiti sağlar. Örneğin, Bu mutasyonlar ilk (Bu nedenle düşük VAF sahip) ortaya çıkan zaman patojenik mutasyon tespiti hastalığı14,15erken müdahale bilgi vermeleri zorunludur. Lösemi araştırma, çok az kalıntı tespiti hastalığı (rezidüel lösemi hücreleri tedavi sonrası) risk stratifikasyon bilgilendirir ve tedavi seçenekleri ikili akış sitometrik değerlendirmeler cant bir şekilde bilgilendirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, ECS dolaşımdaki tümör nükleik asit algılamaya ve varlığı/olmaması için hem de birincil özellikleridir belirli mutasyonların varyant yük değerlendirmek tarafından solid tümör hastalarda metastatik potansiyeli değerlendirmek için geçerlidir tümör16.
Tablo 1' de gösterildiği gibi türevlerini aramak için konum özgü hata binom dağılımı tabanlı modeli kullanarak güç büyük ölçüde sıralı kitaplıkları sayısı gibi yanı sıra hata model oluşturmak için kullanılan sıralama derinliği bağlıdır. Hata modeli sağlamlık daha yüksek sayıda örnekleri ve daha fazla sıralama derinliği artar. Her örnek için bir hata profili oluşturmak için Ortalama hata düzeltilmiş örnek başına 3000 x okuma kapsamını ile en az 10 sıralı örnekleri kullanmak için tavsiye edilir. Pozisyon özel yaklaşım benzer MAGERI, ancak tüm altı farklı ikame türler için bir toplama hata oranı kullanarak yerine (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, her konumda bağımsız olarak her ikame modeli. Örneğin, bir hata oranı c > T belirli bir genomik pozisyonda başka bir konumdan farklı. Gibi bir sıralama vadede gözlenen temel ikame oranı çalıştırmak diğerinden farklı olabilir bizim yaklaşım bir sıralama toplu etkisi de dikkate alır. Bu nedenle özellikle farklı sıralama çalıştırır örnekleri model oluşturmak için havuza zaman her pozisyon için tüm yerine koyma türleri modellemek önemlidir.
Ne zaman bir ECS deney tasarımı önemli bir göz istediğiniz algılama eşik var. NGS çalışmaların onlar kolayca genler/hedefleri açısından faiz, algılama eşiği (sıralama derinliği tarafından dikte) ve sorgulanan sayisi ölçeklendirilebilir güzelliktir. Araştırmacılar 0,0001 bir algılama eşiği ile iki amplicons nadir mutasyonlar bulmak istiyorsanız, örneğin, onlar sonuna kadar 75 örnekleri 15 milyon okuma çıkarır MiSeq V2 Kimya'yı kullanarak çalışacak tek bir sıralama havuz (2 amplicons * 10.000 molekülleri * 10 okur hata düzeltme için * 75 örnekleri 15 milyon sıralama okuma =). Araştırmacılar, sıralama veya algılama eşik ayarlamak için çalıştırmak tek bir sıralama içinde havuza alınan örnek sayısına içine gidip moleküllerin bu sayı değişebilir. Çalışmalarımız, biz 0.0001 VAF (1:10, 000) ile bir algılama eşiği mutasyonlar bulmaya yönelik Illumina gen panelini kullanarak. Biz düzenli olarak 250 kullanmak yeterli molekülleri yukarıda belirtilen algılama eşik ulaşmak için yakalanır emin olmak için DNA başlatma ng. Araştırmacılar daha düşük miktarda DNA ile başlatmak için tercih (50 ng önerilir) istenen algılama sınırı ise > 0,001 VAF.
UMIs i5 dizinler eklenir gibi sıralama ayarları buna göre değiştirilmesi gerekir. Örneğin, 16 N UMIs kullandık ve sıralama ayarlarını 2 x 144 eşleştirilmiş son okuma, Dizin 1 8 döngüleri ve 16 döngüleri dizin 2 dizin 2 her zamanki 8 döngüleri karşı vardı. Dizin 2 döngüsü artış döngüsü okur için ayrılan toplam sayısı bir düşüş eşitlenmektedir. Araştırmacılar 12N UMIs10,17kullanmayı seçerseniz, dizin 2 12 döngüleri ayarlarının değiştirilmesi gerekir.
Bu UMI tabanlı sıralama yöntemi sıralama hatalarını düzeltmek için optimize edilmiştir. Suboptimal PCR jackpotting ile ilgili olan tüm amplifikasyon tabanlı yöntemi için bir sorun olduğunu kalır. Biz sonrası sıralama ve post-Biyoinformatik doğrulama ddPCR kullanarak gerçekleştirilen ve neredeyse herhangi bir yanlış pozitif PCR jackpotting nedeniyle tespit. Bununla birlikte, araştırmacılar düşük amplifikasyon hataları emin olmak için yüksek sadakat polimeraz kullanarak deneyler yapmak önerilir.

Biz yaş, mutajen ve somatik aberasyonları genom ve bu birikimi sonucunda hücre bölünmesi sırasında Stokastik hataları maruz altında yatan malign transformasyon, temel patogenezinde nöro-gelişimsel hastalıkları, pediyatrik bozuklukları ve normal yaşlanma1,2. Somatik mutasyon hastalık sürüş potansiyeli olan erken teşhis ve risk yönetimi3,4,5önemli tanılama ve prognostik biyolojik vardır. Fizyolojik clonogenesis daha iyi anlamak için hangi klinik bilgilendirmek ve kararları, doğru miktar ve bu mutasyonlar karakterizasyonu araştırma birincil önem taşımaktadır. Yeni nesil sıralama (NGS) Şu anda türdeş olmayan DNA örnekleri klonal mutasyonların incelemek için kullanılır; Ancak, NGS mutasyonlar, belirlenmesi için sınırlıdır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF) — nedeniyle 0.5-2.0 içsel hata oranını % sıralama platformları6,7,8. Sonuç olarak, takip eden ve prognostically önemli somatik değişik alt VAF adlı standart NGS kullanarak elde edilemez.
Son zamanlarda, hata oranı NGS8,9,10,11aşmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemleri kullanmak moleküler etiketleme, hata düzeltme sonra sıralama sağlar. Her molekül veya sıralama kitaplığı'genomik parça ile bir rasgele benzersiz moleküler tanımlayıcı (Bu molekül özgü UMI) etiketlenir. UMIs bir dizi randomize nükleotit (8-16 H) permütasyon tarafından inşa edilir. İkinci bir örnek özgü barkod Ayrıca birden fazla örnekleri çalıştırmak aynı NGS sıralama içine çoğullama sağlar iş akışı içine entegre edilmiştir. PCR güçlendirme tatlı öğesini Kütüphane üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra kütüphane sıralama için gönderilir. Kütüphane hazırlık sırasında bu hata rastgele genomik parçası PCR güçlendirme ve sıralama8sırasında tanıtılacaktır bekleniyor. Rasgele sıralama hatalarını kaldırmak için ham sıralama okuma UMI göre gruplandırılır. Sıralama yapılardan ise gerçek bir değişken sadakatle güçlendirilmiş ve aynı UMI paylaşan tüm okur sıralı konumunda aynı genomik Stokastik olması nedeniyle giriş, aynı UMI ile tüm okuma bulunması beklenen değil. Eserleri kaldırıldı bioinformatically vardır. Burada, biz üç yöntem, hata düzeltilmiş sıralama (Laboratuvar tek nükleotid türevleri (SNVs) ve küçük ekleme-silme (Indels) tanımlamak DNA ve RNA gen ifade aşağıdaki miktar kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş ECS) tarif NGS hata eşiği.
İlk yöntem nadir somatik olay araştırmacılar tarafından tasarlanmış gen belirli primerler kullanılarak aramak için bir yol anlatılmaktadır. Kütüphane hazırlık önce araştırmacılar faiz parçaları hedeflemek için astar tasarlamalısınız. Biz web-app Primer3 kullanılan (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). UMIs dahil edilmiştir bir kez bunlar olacak gibi Amplicons 200-250 BP polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için ideal, eşleştirilmiş uç okuma 150 bp eşleştirilmiş uç okuma ile örtüşen oluşturmak. Kullanılacak en uygun astar tasarım koşullar: en az astar boyutu = 19; En uygun astar boyutu = 25; Maksimum astar boyutu = 30; En az Tm = 64 ° C; Optimum Tm = 70 ° C; Maksimum Tm = 74 ° C; En fazla Tm farkı = 5 ° C; En az GC içerik = 45; Maksimum GC oranı = 80; Dönmek için sayı = 20; En fazla 3' sonunda istikrar = 100.
Yöntem 2'de, Illumina Kimya klonal SNVs ve küçük Indels gibi amplicons yüzlerce içerir ticari olarak mevcut Gen panellerini kullanarak 0.0001 VAF nadir için anket için ECS-DNA Protokolü birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Biz TruSight Myeloid sıralama paneli (Illumina) bizim deneme için kullanılan ve genişletilmiş bir masası çocuk miyeloid hastalıkları için ilgi ek genler dahil etmek için tasarlanmış. Bu paneller biz bu paneller için bağdaştırıcı stratejimiz ekledik böylece hata düzeltme, kolaylaştırmak moleküler benzersiz tanımlayıcıları (UMIs) teklif değil. ECS-meli iş herhangi bir farklı hastalıklar ile ilişkili genler için zenginleştirmek için tasarlanmış diğer paneller ile eşit derecede iyi. DNA izolasyon ve sonraki miktar doku veya örnek ilgi önerilir en az 500 için ng stok numune DNA. Biz düzenli olarak 250 kullanarak bir tek sıralama kitaplığı yapmak için mümkün olduğunca çok benzersiz genomik parçası olarak aşağı yakalamak için DNA'ın ng okur de-çoğaltma ve VAF hesaplama. Bir isteğe bağlı çoğaltma sıralama kitaplığı kalan 250 ile yapılan DNA'ın ng. Biz her zaman örnek başına iki Çoğalt kitaplık yapmak ve biz bağımsız olarak her iki çoğaltır gerçek pozitif olarak tespit olayları düşünün. Ayrıca değişken4,13arama doğruluğunu artırmak için genomik pozisyon özgü binom hata modeli uygulanır.
Son olarak, biz kapalı QIAseq hedef RNA panelleri (QIAGEN) kullanarak transkript miktar için RNA sıralama için ECS kaplin bir yöntem açıklanmaktadır. UMIs de-çoğaltma için gerekli ve hata düzeltme kitleri dahil ve araştırmacılar kitaplıkları üreticinin önerilerini takip yapabilirsiniz. Bioinformatically, araştırmacılar Protokolü bölümünde ayrıntılı olarak açıklanacaktır ECS-DNA için özetlenen boru hattı takip edebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Q5 Yüksek Sadakat Sıcak Başlangıç Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Leke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Özel Amplikon İndeks Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adaptör dizileri</td><td>Entegre DNA</td> <td>Teknolojileri-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra Uç Onarımı/dA-Kuyruk Modülü</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligasyon Modülü</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Üretim Yağı EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Dijital PCR Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96 Kuyulu Plakalar</td><td></td> QX200/QX100 Damlacık Jeneratörü için <td>Bio-Rad</td> 12001925 <td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuşları</td> Damlacık Jeneratörü <td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100 Damlacık Jeneratörü için DG8 Contaları</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizörü</td><td>Agilent Genomik</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Miyeloid Dizileme</td><td>Paneli Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Papyon 2</td><td>Johns Hopkins</td> <td>Üniversitesi-Özelleştirilmiş</td><td></td></tr> <tr><td>QIAseq Hedefli RNA Paneli</td><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi dna ve rna sıralama

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Geleneksel yeni nesil sıralama teknikleri (NGS) için bir on yıl içinde muazzam genomik karakterizasyonu için izin vermiş. Özellikle, NGS klonal mutasyonlar spektrum malignite çözümlemek için kullanılan. Yine de çok daha verimli geleneksel Sanger yöntemleri, nadir klonal ve subclonal mutasyonlarının ~0.5–2.0 oranında onun yüksek hata nedeniyle belirlenmesi ile NGS mücadele daha. Böylece, standart NGS algılaması olan mutasyonlar için bir sınırı vardır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF). Bilinen hastalık belirsizdir olmadan artık hastalık olduğunda mutasyonlar bu hastalarda nadir için klinik önemi ise lösemi için tedavi edilen hastaların önemli ölçüde sonuçlar iyileştirilmiştir < 0,0001 akış sitometresi tarafından. NGS artefactual bu arka plan azaltmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada hata düzeltilmiş DNA ve RNA sıralama (hata düzeltme için 16 bp rasgele dizindeki ve çoğullama için 8 bp hastaya özgü dizin ile bireysel moleküllerin etiketleme içerir ECS), için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim Yöntem algılamak ve varyant alleli kesirler (VAFs) iki büyüklük NGS algılama sınırı daha düşük ve 0.0001 VAF gibi nadir, klonal mutasyonlar izlemek.

Targeted Error-corrected sıralama ile DNA'ın, mutant hasta DNA ticari genomik DNA'sında sulandrarak prensibi deneyi bir kanıtı gerçekleştirdiniz. Hasta bir mutasyon GATA1 vardı (chrX:48650264, C &gt; G) orijinal VAF 0.19 ile. Şekil 1 ' de ECS 1:10,000 tek nükleotid varyant için bir seviye için nicel olduğunu ispat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Şekil 1: ECS 1:10,000 seviyeye nicel GATA1 SNV gösteren seyreltme dizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Biz de ECS-DNA güvenilir içinde yetişkin akut miyeloid lösemi (AML) sağlıklı yaşlı bireylerin4yerleştirilmiştir genlerinde klonal mutasyonlar nadir algılar gösterir. Biz 20 sağlıklı bireyler hemşirenin sağlık kabaca ~ 10 yıl arayla banked çalışmada buffy ceket örnekleri aldı. Biz bu örnekler üzerinde ECS-DNA paneli iletişim kuralı uygulanır. Bu deneme için Illumina TruSight Myeloid sıralama 568 amplicons (https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html gen listesi hakkında daha fazla bilgi) oluşan Panel uyarlanmış ve sıralı 20 bireylerin 80 kitaplıkları (2 koleksiyon farklı zaman noktalarda bağımsız birim zamanda başına 2 çoğaltır işaret ederek) 47,7 milyon eşleştirilmiş uç okuma ortalama ve ortalama 3.4 milyon hata düzeltilmiş oluşturulan Illumina NextSeq platformu kullanarak her kütüphane4için fikir birliği serileri. Kütüphane başına ortalama nükleotit kapsama yaklaşık 6.000 x (3.4 milyon 568 tarafından bölünmüş) yapıldı. Her örnek için bir pozisyon özgü hata profil aynı örnekten olmayan sıralı kitaplıklarını kullanma inşa. En az bir koleksiyon zaman noktası her iki çoğaltır içinde mevcut 109 klonal somatik mutasyon bulduk. Bu mutasyonlar VAF 0,0003-0.1451 değişen var. Biz bilinen kozmik temsilcilikleri ile 21 mutasyonlar seçili ve ddPCR kullanarak bir ya da iki koleksiyon zaman noktalarının tüm 21 mutasyonların doğrulanmış (n = 34, Şekil 2, Genç ve ark. 20164den uyarlanmıştır).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Şekil 2: ECS tarafından tanımlanan mutasyonlar ddPCR ile son derece uyumlu VAFs üzerinden doğrulanmadı. (n = 34, Genç ve ark. 20164modifiye). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
ECS-RNA protokolünü kullanarak hata düzeltilmiş ifade düzeyi ile ilgili çeşitli kanserler (QIAseq insan kanser Transcriptome Masası'ndan uyarlama) ve biz ile ilişkili olduğu bilinen 416 genler oluşur QIAseq kimya kullanarak bir gen panel özelleştirilmiş belirli bir gen ( ek malzeme 1gen listesinde) en sık ifade exon güçlendirilmiş. Biz Kütüphane ortalama 8.3 milyon okur verdi eşleştirilmiş uç biçiminde Illumina MiSeq platformu kullanarak kitaplıkları sıralı ve 0.417 milyon hata düzeltilmiş fikir birliği dizileri ortalama yakalamak başardı. Biz gösterdi ki düşük bereket transkript ifade düzeyini (&lt; 1.000 transkript sayısı 50 ng toplam RNA) çoğaltır arasında son derece tekrarlanabilir (veri noktası n = 300, Şekil 3). DdPCR (ifade değişen ölçüde altı seçili genler) doğrulanması bu genlerin ifade düzeyini doğru şekilde normalleştirme için gerek kalmadan ECS protokolü tarafından ele geçirilen gösterdi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Şekil 3: Top, transkript korelasyon sayar ECS-RNA tarafından aynı örnek çoğaltır arasında (n = 300). Alt, sayıları ECS tarafından tespit ddPCR tarafından doğrulanmadı transkript (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Bu yöntem, prekanseröz klonların tespiti, tedaviyi takiben lösemi hastalarının prognostik değerlendirmesi ve kemik iliği donörlerinde potansiyel olarak patojenik mutasyonların tanımlanması gibi çeşitli araştırma alanlarındaki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürü benimle birlikte gösteren Spencer, laboratuvarda bir teknisyen. Bu video, 10.000'de bir hassasiyette klonal tek nükleotid varyantlarını ve küçük indelleri tespit etmek için Hata Düzeltmeli Dizileme Protokolünün Illumina kimyası ve ticari olarak mevcut gen panelleriyle nasıl birleştirileceğini açıklamaktadır.Gerekli benzersiz moleküler tanımlayıcıları dahil etmek için özelleştirilmiş 16N i5 ve i7 adaptörleri PCR kullanır. İlk olarak, piyasada bulunan alternatiften daha yüksek sadakate sahip bir polimeraz kullanan Q5 Master Mix'i hazırlayın. Ardından, her reaksiyon için 37,5 mikrolitre Q5 Master Mix, benzersiz moleküler tanımlayıcılar olan altı mikrolitre beş mikromolar 16N i5 adaptörü ve altı mikrolitre i7 adaptörünü birleştirin.Hedef çoğullama ise, ayrı örneklerde farklı i7 adaptörleri kullanın. Şimdi, aşağıdaki parametreleri kullanarak PCR'yi çalıştırın: 98 santigrat derecede otuz saniye, ardından 98 santigrat derecede on saniyelik dört ila altı döngü, 66 santigrat derecede otuz saniye ve 72 santigrat derecede otuz saniye. Reaksiyonu 72 santigrat derecede iki dakikalık bir uzatma ile bitirin ve dört santigrat derecede tutun.Daha sonra, üzerlerinde yapmanız gereken her iki PCR döngüsü de büyük olasılıkla kullandığınız gen panelinin boyutuna bağlıdır, deneyimlerimize göre, gen panelinin yaklaşık 1500 farklı gene özgü oligo yolu varsa dört döngülü bir PCR yeterlidir, oysa yaklaşık beş ila 600 çift oligo içeren bir panel yaklaşık altı döngü PCR gerektirir. Daha sonra, manyetik boncuklar kullanarak PCR reaksiyonlarını temizleyin, her 75 mikrolitrelik PCR ürününe 56.25 mikrolitre manyetik boncuk çözeltisi ekleyin, ardından her reaksiyonu ayrı bir 1.5 mililitre düşük bağlayıcı tüpe aktarın, en az on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve beş dakika bekleyin. Ardından, karışımları manyetik bir tutucuya aktarın ve süpernatantların iki dakika boyunca temizlenmesine izin verin.Ardından, süpernatantları çıkarın ve atın. Daha sonra 200 mikrolitre% 70 etanol ekleyin, otuz saniye bekleyin ve ardından etanolü çıkarın. Bu etanol yıkama adımını bir kez tekrarlayın ve ardından boncukların beş dakika kurumasını bekleyin.Son olarak, modifiye edilmiş kitaplıkları boncuklardan yirmi mikrolitre çift damıtılmış suda boşaltın. Ardından, manyetik boncukları eluentten ayırmak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. İlk olarak, ECS kütüphanelerinin önceki adımdan PCR şeritlerinde 1.000'de bir parçaya kadar on kat seri seyreltmelerini yapın.Ardından, 1,5 mililitrelik bir tüpte bir Master Mix hazırlayın. Her reaksiyon için 10 mikrolitre ddPCR EvaGreen Mix, 0.2 mikrolitre P5 astar, 0.2 mikrolitre P7 astar ve 4.6 mikrolitre çift damıtılmış suyu birleştirin. Ardından, 15 mikrolitre EvaGreen Master Mix'i yeni bir tüp setine pipetleyin ve son olarak Master Mix'e bir ila 1.000 ECS temizlenmiş üründen beş mikrolitre ekleyin.Ardından, damlacık üretecini kullanarak PCR damlacıkları yapın. İlk olarak, kaseti yükleyin, kasetin kuyusuna 70 mikrolitre damlacık üretim yağını pipetleyin, etiketli yağ ve 20 mikrolitre ddPCR reaksiyon karışımını iyi etiketlenmiş numuneye pipetleyin. Ardından, kaseti lastik bir contayla kapatın ve damlacık üretecine yükleyin ve devam etmek için tüm damlacık oluşumunu yapın.Şimdi, çok kanallı bir pipet kullanarak, yavaşça, beş saniyeden fazla, her bir kaset kuyucuğundan alınan 45 mikrolitre damlacıkları yeni bir PCR plakasına yükleyin. Ardından, PCR plakasını bir alüminyum folyo ile kapatın. Şimdi, aşağıdaki koşulları kullanarak damlacıklardaki sinyali yükseltin: 95 santigrat derecede beş dakika, ardından 95 santigrat derecede otuz saniyelik 40 döngü ve 63 santigrat derecede bir dakika, ardından reaksiyonu beş dakika boyunca 90 santigrat dereceye yükseltmeden önce beş dakika boyunca dört santigrat dereceye soğutun, ve sonra dört santigrat derecede tutmak.Ardından, ddPCR şablonu damlacık okuyucu makinesini hazırlayın. Mutlak miktar tayini ve QX200 ddPCR EvaGreen Supermix'in kullanımı için parametreleri seçin. Ardından, reaksiyonları damlacık okuyucudan geçirin.ddPCR analizi tamamlandığında, her numuneye aynı bölücü eşikleri uygulayın. Ardından, her kitaplığı istenen sayıda moleküle normalleştirin. 25 mikrolitre Q5 Master Mix, iki mikrolitre bir mikromolar P5 primeri, iki mikrolitre bir mikromolar P7 primeri ve 21 mikrolitre normalleştirilmiş DNA kütüphanesinden oluşan 50 mikrolitrelik reaksiyonlar yaparak başlayın.Ardından, aşağıdaki parametreleri kullanarak PCR'yi çalıştırın: 98 santigrat derecede 30 saniye, ardından 98 santigrat derecede 10 saniyelik 16 döngü, 66 santigrat derecede otuz saniye ve 72 santigrat derecede otuz saniye, ardından 72 santigrat derecede iki dakika ve dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, kütüphanelerdeki DNA konsantrasyonunu ölçün ve kütüphaneleri dizileme için eşit molar miktarlarda toplayın, kabaca dört nanomolar hedefleyin. Şimdi, Illumina sıralama platformunu kullanarak havuzlanmış ECS kitaplığını aşağıdaki sıralama ayarlarıyla sıralayın: iki kez 144 çift uçlu okuma, sekiz döngü dizin bir ve 16 döngü dizin iki.GATA1'de mutasyonu olan bir hastanın DNA'sı, 0.19'luk orijinal VAF'de ticari genomik DNA'da seyreltildi. Açıklanan protokolü kullanarak, ECS'nin tek nükleotid varyantı için bir ila 10.000 seviyesine kadar kantitatif olduğu kanıtlandı. Daha sonra, yirmi sağlıklı bireyden alınan buffy coat örnekleri, 568 amplikondan oluşan ticari bir dizileme paneli kullanılarak analiz edildi.Özetle, 0.0003 ila 0.1451 arasında değişen varyant alel fraksiyonları ile en az bir toplama zaman noktasının her iki kopyasında da 109 klonal somatik mutasyon mevcuttu.21 bilinen kozmik temsillere sahip mutasyonların her biri seçildi ve her biri dijital damlacık PCR kullanılarak doğrulandı. Protokolün hata düzeltilmiş ekspresyon seviyesini göstermek için, çeşitli kanserlerle ilişkili olduğu bilinen 415 genden oluşan özelleştirilmiş bir gen paneli, her bir genin en yaygın eksprese ekzonundan oluşturulmuş bir kütüphane üretmek için kullanıldı. Düşük bolluklu transkriptin ifade seviyesi, replikalar arasında yüksek oranda tekrarlanabilirdi.Dijital damlacık PCR daha sonra değişen ifadelere sahip altı seçilmiş geni doğrulamak için kullanıldı. Bir karşılaştırma, genlerin ekspresyon seviyesinin, normalizasyona gerek kalmadan ECS protokolü tarafından doğru bir şekilde yakalandığını göstermektedir. Tekniğe hakim olduktan sonra bu teknik bir buçuk günde konforlu bir şekilde yapılabilir.Zamanın büyük bir kısmı inkübasyon olacaktır ve manuel kullanım, araştırmacıların aynı anda kaç numune işlediğine bağlı olarak gereken toplam sürenin yaklaşık% 30-40'ını alır. Bu prosedürü denerken, aynı örnek için bir replikasyon sıralama kütüphanesine sahip olmak çok önemlidir. Bu, mutasyonun kendisi her iki replikasyonda da bağımsız olarak çekirdek ise, düşük frekanslı bir mutasyonun gerçek pozitif olduğuna dair size daha fazla güven verecektir.Bu prosedürü takiben, düşük bolluklu transkript tespiti veya füzyon transkripti gibi soruları yanıtlamak için ECS RNA gibi diğer konular gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik öncelikle hematolojik maligniteler alanındaki araştırmacıların önünü açtı ve bu tekniği sağlıklı bireylerde pre-lösemik klonları araştırmak ve remisyonda olan lösemi hastalarında minimal rezidüel hastalığı tespit etmek için kullanıyoruz.

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER'da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

Bu video, nadir transkript varyantlarını tespit etmede yararlı olan dijital PCR tekniğinin bir varyasyonu olan çip tabanlı dijital PCR'yi göstermektedir. PCR reaksiyonu, her biri bağımsız bir reaksiyon olarak işlev gören bir nanoakışkan çipin odalarına bölünür. Güçlendirilmiş hedeflere sahip odalardan gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunede nadir transkript varyantlarının varlığını doğrular.

Nanoakışkan bir çip kullanarak nadir transkript varyantlarını tespit etmek için çip tabanlı dijital PCR

Vahşi tip blokaj PCR ve ardından doğrudan dizileme, çeşitli numune türlerinde düşük frekanslı somatik mutasyonlar için oldukça hassas bir tespit yöntemi sunar.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Burada, RNA örneklerinde genomik DNA (gDNA) kirlilik izleme için bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntem astar özel ribozomal DNA (rDNA) gen iç kopya etmek spacer bölge (ITS) için kullanır. Yöntem güvenilir ve hassas algılama DNA kirlenme çoğu Ökaryotlar ve prokaryotlar için uygundur.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

RNA düzenleme olaylarının genomik ölçekte hızlı tespiti ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zorlu olmaya devam etmektedir ve şu anda doğrudan RNA dizileme yöntemlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol, RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve taşınabilir bir yöntem olarak mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) kullanır.

RNA Düzenlemenin Hızlı Tespiti için Dizilemesiz Bir Yaklaşım

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Öğrenin hata düzeltilmiş DNA ve RNA dizileme yöntemini, Illumina platformu ile nadir mutasyonları tespit etmek için. Bu protokol kanser araştırmalarında ve minimal rezidüel hastalık izleminde yüksek hassasiyet sağlar.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Daha fazla video keşfet