Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, in vitro kültürlenmiş yetişkin Schistosoma japonicum ortamından hücre dışı vezikülleri izole etmektir. Bu yöntem, EV'yi in vitro kültür ortamında yetişkin Schistosoma japonicum'dan verimli bir şekilde izole edebilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücre dışı vezikülü kısa süreli in vitro kültür ortamından verimli bir şekilde izole edebilmesidir, bu da potansiyel olarak fizyolojik olmayan EV sekresyonuna neden olan stresi en aza indirebilir.

Gösteri, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Juntao Liu tarafından yapılacak. Parazitleri 500 mililitrelik bir beherde toplayın ve 200 mililitre ılık PBS kullanarak üç kez iyice ama nazikçe yıkayın. Yıkamaları kısa tutun ve parazitleri ayırmak için yerçekimi sedimantasyonunu kullanın.

Daha sonra, 90 milimetrelik tabaklara, tabak başına yaklaşık 200 solucan çifti tabağı. Çanakta, yerçekimi sedimantasyonu kullanarak parazitleri iki kez daha yıkayın. Bu yıkamalar için, pen-strep ile desteklenmiş ılık RPMI ortamı kullanın.

İkinci yıkamayı antibiyotiksiz 40 mililitre ortamla değiştirin. Daha sonra parazitleri iki saat boyunca% 5 karbondioksit altında% 37 santigrat derecede kültürleyin. İki saat sonra, ortamı plakalardan santrifüj tüplerine aktarın ve ardından yumurtaları ve solucan kalıntılarını dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.000 g'da toplayın.

Ardından, süpernatanı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, süpernatanı 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve filtrelenmiş çözeltiyi, 3.5 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimi olan bir diyaliz torbasına toplayın. Daha sonra, çözeltiyi% 8 PEG8000 çözelti kullanarak gece boyunca dört santigrat derecede diyalize edin.

Bu adım, hücre dışı veziküllerin verimini artırmak için önemlidir. Ertesi gün, diyalize edilmiş çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın ve toplam eksozom izolasyon reaktifinden 0.5 hacim ekleyin. Çözeltiyi homojen olana kadar karıştırın ve gece boyunca yaklaşık beş santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi sabah, karışımı yaklaşık beş santigrat derecede bir saat boyunca 15.000 g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve atın ve EV'lerin peletini iki mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Pelet muhtemelen görünmeyecektir.

Western blot analizi için, önce BCA tahlilinde olduğu gibi numunenin protein konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, 22,5 mikrolitre RIPA tamponunda 10 ila 20 mikrogram EV hazırlayın. Daha sonra, 7,5 mikrolitre 4X yükleme tamponu ekleyin ve karışımı beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın.

Isıl işlemden sonra, hücre dışı vezikül proteinlerini %12'lik bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayırın. Jeli çalıştırdıktan sonra, proteinler PVDF zarına aktarılır. Membranı anti-CD63 antikorları ile bir ila 1.000 seyreltmede araştırın.

Daha sonra, zarı bir ila 5.000 seyreltmede tavşan önleyici IgG-HRP ile muamele edin. Şimdi, zarı geliştirmek için bir ECL algılama reaktifi kullanın ve ardından bir kemilüminesans görüntüleme sisteminde analiz yapın. Beş mikrogram numuneyi bir polipropilen ultrasantrifüj tüpüne aktarmakla başlayın ve hacmi RPMI-1640 ortamı ile 12 mililitreye ayarlayın.

Ardından, numuneyi dört santigrat derecede 90 dakika boyunca 110.000 g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Ardından, pelete bir mililitre seyreltici C ekleyerek 2X hücre dışı vezikül süspansiyonu hazırlayın.

Peleti nazik pipetleme ile yeniden süspanse edin. Şimdi taze 2X boya çözeltisi hazırlayın. Bir mikrofüj tüpünde bir mililitre seyreltici C'ye iki mikrolitre PKH67 etanolik boya ekleyin ve iyice karıştırın.

Ardından, iki çözeltiyi karıştırarak ve karışımı oda sıcaklığında dört dakika inkübe ederek numuneyi boyayın. Ardından, dört mililitre FBS ekleyerek ve bir dakika daha bekleyerek lekelenmeyi durdurun. Ardından, hacmi 12 mililitreye ayarlamak için RPMI-1640 ortamı ekleyin ve lekeli vezikülleri izole etmek için süspansiyonu aşağı döndürün.

Süpernatanı çıkarın ve atın. Ardından, peletlenmiş PKH67 etiketli EV'leri 12 mililitre RPMI-1640 ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra santrifüjlemeyi tekrarlayın, ancak bu sefer vezikülleri bir mililitre PBS'de toplayın.

Alım tahlili için, altı oyuklu plakalarda memeli hücrelerinin gece boyunca kültürlerini hazırlayın. Ertesi sabah, her bir oyuğa beş mikrogram PKH67 etiketli vezikül ekleyin ve kültüre iki ila dört saat devam edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra, hücreleri 15 dakika boyunca sabitleyin, PBS ile iki kez yıkayın ve görüntülemeden önce DAPI ile boyayın. Karaciğer evresindeki şistozomlar, enfeksiyondan 28 gün sonra tavşanlardan toplandı. Hücre dışı veziküller daha sonra şistozom solucanlarından toplandı ve analiz edildi.

Malvern nanopartikül analizi ile belirlenen partikül boyutları, 100 ila 400 nanometre arasında değişiyordu ve nüfusun büyük kısmı 220 nanometreye yakındı. Transmisyon elektron mikroskobu, hücre dışı veziküllerin yuvarlak ve çapının 100 ila 200 nanometre arasında olduğunu ortaya çıkardı. Western blotlama analizi, izole edilen hücre dışı veziküllerin, tipik bir hücre dışı vezikül belirteci olan CD63 antikorları kullanılarak tanındığını gösterdi.

NCTC klonu 1469 hücreleri tarafından içselleştirilen PKH67 işaretli hücre dışı veziküllerin floresan mikroskobu, hücre dışı veziküllerin esas olarak alıcı hücrelerin sitoplazmasında dağıldığını gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, EV'nin in vitro kültür ortamında yetişkin Schistosoma japonicum'dan nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.