Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Bu prosedürün genel amacı, tek sarmallı oligonükleotid homolojisine yönlendirilmiş onarım şablonları ve CRISPR/Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak C.Elegans'ta genomik nokta mutasyonları oluşturmaktır. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıkla ilişkili genetik varyansın patolojik sonuçlarının belirlenmesi gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, genomik nokta mutasyonlarının hızlı bir şekilde üretilebilmesi, protein aşırı ekspresyonunun uyarılarından kaçınırken, endojen düzenleyici kontrol bağlamında genetik varyansın fonksiyonel çalışmasına izin vermesidir.

sgRNA hedef seçimini gerçekleştirmek için burada gösterilen web sayfasını açın. İstenen ilgilenilen düzenlemeyi çevreleyen yaklaşık 60 baz dizi çifti girin. Metin protokolüne göre C.Elegans genomunu ve protospacer bitişik motifini seçtikten sonra gönder'e tıklayın.

Sonuçlar sayfasında, ilgilenilen düzenlemeye en yakın en üst sıradaki hedef diziyi seçin. Alındıktan sonra, liyofilize sgRNA içeren tüpü oda sıcaklığında ve en az 12.000 g sıcaklıkta bir dakika boyunca santrifüjleyin. Tüpe 60 mikrolitre nükleaz içermeyen TE ekleyin ve 15 ila 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yeniden süspanse etmek için bir p200 pipeti kullanın.

Son konsantrasyon 50 mikromolar'dır. İlgilenilen mutasyonu, benzersiz bir çerçeve kısıtlama endonükleaz bölgesini, NGG PAM dizisi içindeki G'lerden birinin veya her ikisinin sessiz bir mutasyonunu ve ilk ve son mutasyonu çevreleyen 50 baz çifti beş asal ve üç asal homoloji kolunu içeren bir ssODN HDR şablonu tasarlayın. Alındıktan sonra, liyofilize ssODN içeren tüpü az önce gösterildiği gibi santrifüjleyin, ardından ssODN'yi 100 mikromolar nihai konsantrasyona nazikçe yeniden süspanse etmek için nükleaz içermeyen DD H20 kullanın.

Bir enjeksiyon karışımı hazırlamak için, burada gösterilen reaktifleri iki dakika boyunca maksimum hızda ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Listelenen sırayla, reaktifleri nükleaz içermeyen bir PCR tüpüne ekleyin. Ardından, içeriği nazikçe ve iyice karıştırmak için bir p20 pipeti kullanın.

Tüpü oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. Metin protokolüne göre P0 hayvanlarını enjekte ettikten sonra, OP50 tohumlu 35 milimetre NGM plakası üzerinde bir ila iki saat oda sıcaklığında iyileşmelerine izin verin. Daha sonra, bir platin tel solucan kazması kullanarak, tek enjekte edilmiş P0 hayvanlarını tek tek OP50 tohumlu 35 milimetre NGM plakalarına aktarın.

Enjeksiyondan iki gün sonra, farenkste mCherry'yi eksprese eden F1 dölünü içeren P0 plakalarını tanımlamak için bir floresan mikroskobu kullanın. En mCherry pozitif F0 hayvanlarını içeren üç P1 plakası seçin. Seçilen üç P0 plakasının her birinden, toplam 24 ila 36 mCherry pozitif F1 için sekiz ila 12 mCherry pozitif F1 hayvanına bir solucan penası kullanın.

Tek tek F1'lerin kendi kendine döllenmesine ve bir ila iki gün oda sıcaklığında yumurta bırakmasına izin verin. Bir ila iki günlük yumurtlamadan sonra, F1'leri yedi mikrolitre solucan lizis tamponu içeren ayrı PCR şerit tüp kapaklarına aktarmak için bir solucan penası kullanın. Hayvanları tüpün dibine getirmek için PCR tüplerini maksimum hızda ve oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyin.

Daha sonra tüpleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, aşağıdaki programı kullanarak donmuş solucanları bir termodöngüleyicide parçalayın. Ardından bu tabloda gösterildiği gibi bir PCR ana karışımı ayarlayın.

Temiz PCR tüplerine 21 mikrolitre PCR ana karışımı ekleyin, ardından dört mikrolitre solucan lizis tüpü ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, üreticinin yönergelerini izleyerek PCR programını çalıştırın. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA temizleme ve konsantre kiti kullanarak PCR reaksiyonlarını saflaştırın.

Daha sonra döndürme kolonuna 10 mikrolitre su ekleyerek DNA'yı seyreltin. Kısıtlama enzimi ana karışımını kurduktan sonra, temizlenmiş her PCR reaksiyonuna 10 mikrolitre ekleyin ve tüpleri bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra sindirilmiş PCR ürünlerini 120 voltta 1x TAE tamponu kullanarak %1,5'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın.

Enzimle sindirilmiş numuneleri, potansiyel düzenlenmiş hayvanları gösteren bantların varlığı açısından inceleyin. Potansiyel düzenlenmiş hayvanları belirledikten sonra, kalan üç mikrolitre solucan lizizini kullanın ve PCR'yi tekrarlayın. Ardından, bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak bandı ayırmadan ve çıkarmadan önce tamamlanan reaksiyonları hemen %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.

F1 astarını kullanarak, doğru şekilde düzenlenmiş hayvanları tanımlamak için Sanger sıralaması yapın. Son olarak, doğrulanmış heterozigot düzenlenmiş hayvanlardan, tek sekiz ila 12 F2 hayvandan homozigot hayvanlar elde etmek ve metin protokolüne göre genotipleme ve dizi doğrulaması yapmak. CRISPR / Cas9 RNP tabanlı yaklaşımın basitliğini, fizibilitesini ve verimliliğini göstermek için, C.Elegans sod-1 geni, solucan genomunda hastalıkla ilişkili insan G93a varyantını tanıtmak için hedeflendi.

Bu jel görüntüsü, 24 mCherry pozitif F1 hayvanları için genotipleme sonuçlarını göstermektedir. 10'u monoallik veya bialilik modifikasyon içeriyordu, 10'u vahşi tipti, üçü potansiyel indel'di ve biri PCR başarısızlığıydı. Floresan mCherry markörünün genom modifikasyonu için zenginleştirdiğini göstermek için, üç P0 plakasının her birinden sekiz mCherry negatif hayvan seçildi.

Sadece bir hayvan doğru şekilde modifiye edilirken, 23'ü vahşi tipti. Bu şekil, ssODN HDR şablonunda tasarlanan kesin nükleotid değişikliklerinin bu homozigot F1 hayvanının genomuna sadık bir şekilde dahil edildiğini gösteren tam uzunlukta jel ekstrakte edilmiş PCR ürününden alınan kromatogramı göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse dört ila beş gün içinde C.Elegans'ta genomik nokta mutasyonları oluşturmak ve tanımlamak için kullanılabilir.

Bu prosedürü denerken, RNaz içermeyen su, filtre, pipet uçları ve eldivenler dahil olmak üzere çekirdek içermeyen reaktifler ve teknikler kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen mutasyon ile ilişkili olabilecek fenotipleri araştırmak için hücresel, moleküler ve davranışsal testler yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kimerik tek kılavuz RNaz ve CRISPR / Cas9 ribonükleerproteinleri kullanarak C.Elegans'ta genomik nokta mutasyonlarının nasıl hassas bir şekilde oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.