Name: Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin C. elegans'ta CRISPR/Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak genomik nokta mutasyonları oluşturmayı. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili genetik varyasyonların fonksiyonel çalışmalarını hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması vardır.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi'nde kılavuz izledi. Ve ipuçları protokol boyunca pipet RNase free çözümleri kullanın. Çalışma alanı, Pipetler, tüpler ve santrifüj ( Malzeme tabloyabakın) Üretici yönergeleri izleyerek RNase dekontaminasyon çözüm ile temiz.
1. sgRNA hedef seçimi
<ol><li>Bir web tarayıcısı kullanarak Web sayfasını açın: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60 baz çifti (bp) istenen düzenleme ilgi kanat sırası giriş (Yani 30 bp 5' ve 3' istenen düzenleme).</li>
		<li>Caenorhabditis elegans genom açılan menüden seçin.</li>
		<li>Protospacer bitişik Motif seçin (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) açılan menüsünden.</li>
		<li>Gönder'i tıklatın. Sonuç sayfası faiz düzen için en yakın üst sırada hedef sırası seçin. Kanat 60 bp Giriş dizisi içinde hiçbir uygun hedef site varsa, en fazla 100 sorgu sırası genişletin bp (Yani 50 bp istenen her iki tarafında düzenleme).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kaynaktan, örneğin synthego, aşağıdaki özelliklere sahip bir 20-mer hedef sgRNA elde etmek: 3 nmol; modifikasyon yok.</li>
	<li>Aldıktan sonra liyofilize sgRNA tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Tüp TE nükleaz Ücretsiz 60 µL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı kullanarak 15 - 20 kez P200 pipet pipetting tarafından yeniden askıya. Son 50 µM bölgedir.</li>
</ol>2. homoloji-yönetmen onarım şablon tasarımı
<ol><li>Bir ssODN HDR şablonu içeren tasarım: 1) faiz mutasyon, 2) bir benzersiz çerçeve kısıtlama endonükleaz sitesi, birini veya her ikisini NGG PAM dizisi içinde Gs sessiz 3) bir mutasyon ve ilk ve son mutasyon kanat 4) 50 bp 5' 3' homoloji silah. (Şekil 1 c) 9 , 10.<ol>
<li>Mutasyon NGG PAM sırası mümkün değilse, 5-6 sgRNA-aracılı bölünme ssODN HDR şablonunun önlemek için sgRNA hedef tanıma dizisi içinde sessiz mutasyonlar tanıtmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kaynaktan, örneğin idtdna, bir "Ultramer DNA Oligonükleotid" aşağıdaki parametrelerle elde etmek: Ölçek: 4 nmol; Formülasyon: None; Arıtma: Standart Desalting.</li>
	<li>Aldıktan sonra liyofilize ssODN tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Yavaşça ssODN 100 µM son bir konsantrasyon için GKD nükleaz ücretsiz2içinde O 15 - 20 kere P200 pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma.</li>
</ol>3. tasarım Genotipleme astar
<ol><li>~ 400-700 bp PCR amplicon11oluşturmak için genom değişiklik kanat ayarla bir astar tasarım.</li>
	<li>PCR bisiklet koşullarını tek ve belirli amplicon11üretmek için en iyi duruma getirme.</li>
</ol>4. enjeksiyon karışım hazırlamak
<ol><li>Tablo 1 reaktifler 4 ° C'de 2 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Listelenen sırayla Tablo 1 reaktifler bir nükleaz ücretsiz PCR tüp ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça aşağı yukarı 10 kez P20 pipet ile pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika için enjeksiyon karışımı kuluçkaya.</li>
</ol>5. enjeksiyon Protokolü
<ol><li>Yük enjeksiyon micropipette yaklaşık yarısı enjeksiyon ile12karıştırın. Enjeksiyon iğne takunya ya da tatili halinde enjeksiyon mix kalan kaydedin.</li>
	<li>Yavaş yavaş akan çözüm12~ 20-30 psi üretir micropipette ipucu break. Not: Büyük çap ipuçları olumsuz hayvan sağlığını etkileyen ve F1 döl verim azaltın.</li>
	<li>10-15 genç enjekte yetişkin solucanlar her iki eşey kollarında mümkünse12. Eğer değilse, bir eşey kol içine enjeksiyon yeterlidir.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1-2 h için kurtarmak enjekte hayvanlar (P0) 35 mm OP50 numaralı seribaşı nematodunun büyüme medya (NGM) plaka üzerinde izin. Daha sonra bireysel OP50 numaralı seribaşı 35 mm NGM tabak Platin tel solucan kullanarak tek enjekte P0 hayvanlara12seç.</li>
</ol>6. ekran P0 plakaları ve tek mCherry(+) F1s
<ol><li>İki gün sonrası enjeksiyon, F1 döl mCherry floresan stereomicroscope kullanarak yutak olarak ifade içeren P0 plakaları tanımlamak (şekil 1 d, gün 2 - 3). En mCherry(+) F1 hayvanlar içeren üç P0 plakaları seçin.</li>
	<li>Her üç seçili P0 plakalar, 8-12 mCherry(+) F1 hayvanlar 24-36 mCherry(+) F1s bir solucan kullanarak toplam tek seçin (şekil 1 d, gün 2 - 3). Not: mCherry(-) hayvan-da var saydı P0 tabakları, ancak doğru bir şekilde belirlenmesi olasılığını hayvanlar çok düzenlenmiş (şekil 2A) daha düşük.</li>
	<li>Bireysel F1ler Self-fertilize ve oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca yumurtlamak izin verir.</li>
</ol>7. tek solucan PCR ve Genotipleme
<ol><li>1-2 gün sonra yumurta atma, F1s 7 µL solucan lizis bir solucan pick (Tablo 2, şekil 1 d, gün 4-5) kullanarak arabellek içeren bireysel PCR şerit tüp kapakları aktarın.</li>
	<li>Santrifüj PCR tüpleri tüp altına hayvan getirmek ve tüpler için 1 h-80 ° C'de dondurmak için oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda. Not: Worms-80 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
	<li>Aşağıdaki programı kullanarak bir thermocycler de donmuş solucan parçalayıcı: 4 ° C 60 ° C 60 dk, 15 dk, 95 ° C için tutun.</li>
	<li>Tablo 3' te gösterilen kurulum PCR mastermix.</li>
	<li>21 µL PCR mastermix temiz PCR tüpler içine ekleyin ve sonra adım 3 4 µL solucan lizis ekleyin. İyi bir pipet kullanarak mix ve ( Malzeme tabloyabakın) üreticileri yönergeleri izleyerek PCR programını çalıştırın.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek bir DNA temiz ve konsantre kit kullanarak PCR reaksiyonları arındırmak ( Malzeme tabloyabakın). DNA spin sütun 10 µL su ekleyerek elute.</li>
	<li>Tablo 4' te gösterildiği gibi set-up restriksiyon enzimi mastermix.</li>
	<li>Restriksiyon enzimi mastermix 10 µL temizlenmiş her PCR reaksiyon ekleyin ve 1-2 h 37 ° C13için kuluçkaya.</li>
	<li>Ayrı 120 V 1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek14kullanarak çalıştırmak % 1.5 özel jel PCR ürünleri sindirilir.</li>
</ol>8. kimlik ve sıra doğrulama düzenlenen hayvan
<ol><li>Potansiyel hayvanlar14 (şekil 1 d, 4-5 gün) düzenlenmiş belirtmek bantları varlığı için sindirilmiş enzim örnekleri inceleyin. Not: Grup boyutu ve/veya desenleri bantlama beklenmedik ve karmaşık restriksiyon enzimi sindirim nöbetleşe olarak gözlenen potansiyel Indel mutasyonlar tanımlamak için bir N2 denetimini yükleyin.</li>
	<li>Potansiyel düzenlenen hayvan belirlenmesi sonra solucan lizis kalan 3 µL kullanın ve PCR reaksiyon tekrarlayın. Temiz mi veya restriksiyon enzimi sindirmek PCR reaksiyon program tamamlandıktan sonra. PCR reaksiyon % 1'özel jel, ayrı olarak yüklemek ve bir jel ekstraksiyon kiti15 kullanarak Grup ayıklamak ( Malzeme tabloyabakın).</li>
	<li>Sanger sıra16 jel doğru düzenlenmiş hayvanlar (şekil 1A) tanımlamak için F1 astar kullanarak DNA elde Not: okuma içerir Heterozygote doruklarına vahşi türü varlığı nedeniyle overlaid ve alleli tasarlanmış.</li>
	<li>Homozigoz hayvanlar doğrulanmış heterozigoz düzenlenen hayvanlardan, tek 8-12 F2 hayvanlar almak ve 7-8 adımları gerçekleştirmek için.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient%2C+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests"> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5057/dna-gel-electrophoresis">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29171728">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li>
<li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22918486">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+%28and+Other+%26%2334%3BOmics%26%2334%3B%29+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &#34;Omics&#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li>
<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Biz üyeleri Beg laboratuvar bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Beg laboratuvar araştırma hibe tarafından NIH (R01 NS094678) ve Musküler Distrofi Derneği (MDA382300) A.A.B. için desteklenir

CRISPR-Cas9 sistemi tam olarak canlılar genom değiştirmek için güçlü ve etkili bir araçtır. Burada, biz o chimeric sgRNAs20 ssODN HDR şablonları etkinleştir ile yüksek verimli üretimi C. elegansgenomik noktası mutasyonların birleştiğinde göstermek. Önemlisi, biz floresan bir eş seçimi marker olarak kullanıldığında RNP teslim yüksek Düzenleme verimliliği üreten göstermek kolaylık ve güvenilirlik-in teknik vurgulayarak.
C. elegans genom mühendisliği için...

Son teknolojik gelişmeler kökten değiştirdi ve tam olarak mühendis genleri yeteneği hızlandırılmış. Özellikle, RNA güdümlü endonükleaz Çift Kişilik strand mola (DSB) faiz hedef sıra ikna etmek için Cas9 dayanan, CRISPR-Cas9 sistemi kapsamlı olarak doğru bir şekilde kullanılan model organizmalar çoğunluğu genom mühendisi kullanılmaya başlanmıştır Biyomedikal Araştırma1,2,3,4. Önemli ölçüde, CRISPR-Cas9 kullanımı bile zor türler C. elegans5gibi genom düzenleme kilidi. Türü ne olursa olsun, sistem düzenleme CRISPR-Cas9 dayalı genom ile nokta mutasyonlar üreten üç çekirdek bileşenleri üzerinde dayanır: 1) Cas9 endonükleaz, bir hedef sıra ve tasarlanmış 3) bir kullanıcı için Cas9 endonükleaz yönlendirir 2) bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) İstenen içeren homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonunu faiz2/ edit(s).
Hedefleme sgRNA ve Cas9 tanıtmak için kullanabileceğiniz çeşitli yöntemler vardır nükleaz plazmid, RNA ve viral alan teslim yöntemleri6dahil olmak üzere hücre içine. Son zamanlarda, pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) doğrudan teslim CRISPR Cas9 esaslı genom7düzenleme güçlü ve etkili bir araç ortaya çıkmıştır. Pre-complexed CRISPR-Cas9 RNPs doğrudan teslim Yani birkaç farklı avantajı vardır: 1) RNPs bypass hücresel transkripsiyon ihtiyacını ve çeviri, 2) RNPs hızla temizlenir, hangi-ebilmek artmak özgüllük için kullanılabilir zamanı azaltarak kapalı-hedef bölünme ve 3) RNPs non-yerli dizileri rasgele tümleştirme yoluyla ana bilgisayar genom içine giriş circumvents hiçbir yabancı DNA/RNA unsurları içerir. Birlikte, bu öznitelikler muhtemel hedef kapalı etkileri en aza indirerek CRISPR hedef olarak düzenleme kısa ömürlü bir patlama sağlar.
C. eleganssiteye özgü genomik değişiklikleri tanıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı sgRNA ve tek telli Oligonükleotid (ssODN) HDR şablon tasarımı, sgRNA-Cas9 RNP kompleks ve teslim ve düzgün düzenlenmiş hayvanlar kesin tanımlaması için bir Genotipleme strateji hedefleme içerir. Bu stratejiyi kullanarak, sadece istediğiniz siteye özgü değişiklikleri elde edilebilir, ama diğer non-spesifik Indel mutasyonlar da kurtarılabilir. Böylece, bizim strateji allelic dizisi tek bir strateji kullanarak mono allelic, BI allelic nerede nesil verir ve Indel mutantlar F1 üretimi oluşturulabilir.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego A.Ş.</td><td></td><td>kimerik sgRNA</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>sgRNA kiti EZ kiti</td><td></td>ile sağlanır</tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Synthego Inc.</td><td>sgRNA kiti ile sağlanır EZ kiti</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>ssODN HDR şablonu</td></tr><tr><td>Alt-R Sp HiFi Cas9 Nükleaz 3NLS</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1078728</td><td>Cas9 proteini</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mKiraz İşaretleyici Plazmid</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Temiz & Yoğunlaştırıcı</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Jel DNA Geri Kazanım Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Cam Borosilikat Cam Mikropipetler</td><td>Sutter Aletleri</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma Hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Dekontaminasyon Solüsyonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

bir hızlı ve genomik noktası mutantlar c. elegans kullanarak crispr/cas9 ribonucleoproteins üreten facile boru hattı

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Kümelenmiş düzenli olarak serpiştirilmiş palindromik tekrarlar (CRISPR) - CRISPR - protein prokaryotik edinilmiş bağışıklık savunma sistemi kesin ökaryotik genom mühendisliği için güçlü bir araç olarak ortak tercih 9 (Cas9) ilişkili. Burada, C. elegansgenomik noktası mutasyonların verimli ve hassas nesil chimeric tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNA) ve CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) kullanarak hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Biz bir boru hattı sgRNA hedef seçimi, homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonu tasarım, CRISPR-Cas9-RNP kompleks ve teslim ve doğru düzenlenmiş hayvanlar sağlam ve hızlı tanımlaması sağlar bir Genotipleme strateji tanımlamak. Yaklaşımımız sadece facile üretimi ve istenen genomik noktası tanımlaması mutant hayvanlar izin verir, ancak aynı zamanda diğer karmaşık Indel allelleri algılama yaklaşık 4-5 gün içinde yüksek verimliliği ve azaltılmış tarama iş yükü ile kolaylaştırır.

Mutasyonların insan süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ailesel amyotrofik lateral skleroz, felç ve ölüm17' ye kaçınılmaz götüren bir yıkıcı nörodejeneratif hastalık ~ 10- hesabı. İnsan SOD-%1 55 kimlik ve % 70 benzerlik C. elegans SOD-1 protein ile (şekil 1B) paylaşımı örümceklerle korunmuş bir proteindir. Basitlik, fizibilite ve CRISPR-Cas9 RNP dayalı yaklaşım verimliliğini göstermek için C. elegans çimen-1 gen h...

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Bu prosedürün genel amacı, tek sarmallı oligonükleotid homolojisine yönlendirilmiş onarım şablonları ve CRISPR/Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak C.Elegans'ta genomik nokta mutasyonları oluşturmaktır. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıkla ilişkili genetik varyansın patolojik sonuçlarının belirlenmesi gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, genomik nokta mutasyonlarının hızlı bir şekilde üretilebilmesi, protein aşırı ekspresyonunun uyarılarından kaçınırken, endojen düzenleyici kontrol bağlamında genetik varyansın fonksiyonel çalışmasına izin vermesidir.sgRNA hedef seçimini gerçekleştirmek için burada gösterilen web sayfasını açın. İstenen ilgilenilen düzenlemeyi çevreleyen yaklaşık 60 baz dizi çifti girin. Metin protokolüne göre C.Elegans genomunu ve protospacer bitişik motifini seçtikten sonra gönder'e tıklayın.Sonuçlar sayfasında, ilgilenilen düzenlemeye en yakın en üst sıradaki hedef diziyi seçin. Alındıktan sonra, liyofilize sgRNA içeren tüpü oda sıcaklığında ve en az 12.000 g sıcaklıkta bir dakika boyunca santrifüjleyin. Tüpe 60 mikrolitre nükleaz içermeyen TE ekleyin ve 15 ila 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yeniden süspanse etmek için bir p200 pipeti kullanın.Son konsantrasyon 50 mikromolar'dır. İlgilenilen mutasyonu, benzersiz bir çerçeve kısıtlama endonükleaz bölgesini, NGG PAM dizisi içindeki G'lerden birinin veya her ikisinin sessiz bir mutasyonunu ve ilk ve son mutasyonu çevreleyen 50 baz çifti beş asal ve üç asal homoloji kolunu içeren bir ssODN HDR şablonu tasarlayın. Alındıktan sonra, liyofilize ssODN içeren tüpü az önce gösterildiği gibi santrifüjleyin, ardından ssODN'yi 100 mikromolar nihai konsantrasyona nazikçe yeniden süspanse etmek için nükleaz içermeyen DD H20 kullanın.Bir enjeksiyon karışımı hazırlamak için, burada gösterilen reaktifleri iki dakika boyunca maksimum hızda ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Listelenen sırayla, reaktifleri nükleaz içermeyen bir PCR tüpüne ekleyin. Ardından, içeriği nazikçe ve iyice karıştırmak için bir p20 pipeti kullanın.Tüpü oda sıcaklığında on dakika inkübe edin. Metin protokolüne göre P0 hayvanlarını enjekte ettikten sonra, OP50 tohumlu 35 milimetre NGM plakası üzerinde bir ila iki saat oda sıcaklığında iyileşmelerine izin verin. Daha sonra, bir platin tel solucan kazması kullanarak, tek enjekte edilmiş P0 hayvanlarını tek tek OP50 tohumlu 35 milimetre NGM plakalarına aktarın.Enjeksiyondan iki gün sonra, farenkste mCherry'yi eksprese eden F1 dölünü içeren P0 plakalarını tanımlamak için bir floresan mikroskobu kullanın. En mCherry pozitif F0 hayvanlarını içeren üç P1 plakası seçin. Seçilen üç P0 plakasının her birinden, toplam 24 ila 36 mCherry pozitif F1 için sekiz ila 12 mCherry pozitif F1 hayvanına bir solucan penası kullanın.Tek tek F1'lerin kendi kendine döllenmesine ve bir ila iki gün oda sıcaklığında yumurta bırakmasına izin verin. Bir ila iki günlük yumurtlamadan sonra, F1'leri yedi mikrolitre solucan lizis tamponu içeren ayrı PCR şerit tüp kapaklarına aktarmak için bir solucan penası kullanın. Hayvanları tüpün dibine getirmek için PCR tüplerini maksimum hızda ve oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyin.Daha sonra tüpleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, aşağıdaki programı kullanarak donmuş solucanları bir termodöngüleyicide parçalayın. Ardından bu tabloda gösterildiği gibi bir PCR ana karışımı ayarlayın.Temiz PCR tüplerine 21 mikrolitre PCR ana karışımı ekleyin, ardından dört mikrolitre solucan lizis tüpü ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, üreticinin yönergelerini izleyerek PCR programını çalıştırın. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA temizleme ve konsantre kiti kullanarak PCR reaksiyonlarını saflaştırın.Daha sonra döndürme kolonuna 10 mikrolitre su ekleyerek DNA'yı seyreltin. Kısıtlama enzimi ana karışımını kurduktan sonra, temizlenmiş her PCR reaksiyonuna 10 mikrolitre ekleyin ve tüpleri bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra sindirilmiş PCR ürünlerini 120 voltta 1x TAE tamponu kullanarak %1,5'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın.Enzimle sindirilmiş numuneleri, potansiyel düzenlenmiş hayvanları gösteren bantların varlığı açısından inceleyin. Potansiyel düzenlenmiş hayvanları belirledikten sonra, kalan üç mikrolitre solucan lizizini kullanın ve PCR'yi tekrarlayın. Ardından, bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak bandı ayırmadan ve çıkarmadan önce tamamlanan reaksiyonları hemen %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.F1 astarını kullanarak, doğru şekilde düzenlenmiş hayvanları tanımlamak için Sanger sıralaması yapın. Son olarak, doğrulanmış heterozigot düzenlenmiş hayvanlardan, tek sekiz ila 12 F2 hayvandan homozigot hayvanlar elde etmek ve metin protokolüne göre genotipleme ve dizi doğrulaması yapmak. CRISPR / Cas9 RNP tabanlı yaklaşımın basitliğini, fizibilitesini ve verimliliğini göstermek için, C.Elegans sod-1 geni, solucan genomunda hastalıkla ilişkili insan G93a varyantını tanıtmak için hedeflendi.Bu jel görüntüsü, 24 mCherry pozitif F1 hayvanları için genotipleme sonuçlarını göstermektedir. 10'u monoallik veya bialilik modifikasyon içeriyordu, 10'u vahşi tipti, üçü potansiyel indel'di ve biri PCR başarısızlığıydı. Floresan mCherry markörünün genom modifikasyonu için zenginleştirdiğini göstermek için, üç P0 plakasının her birinden sekiz mCherry negatif hayvan seçildi.Sadece bir hayvan doğru şekilde modifiye edilirken, 23'ü vahşi tipti. Bu şekil, ssODN HDR şablonunda tasarlanan kesin nükleotid değişikliklerinin bu homozigot F1 hayvanının genomuna sadık bir şekilde dahil edildiğini gösteren tam uzunlukta jel ekstrakte edilmiş PCR ürününden alınan kromatogramı göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse dört ila beş gün içinde C.Elegans'ta genomik nokta mutasyonları oluşturmak ve tanımlamak için kullanılabilir.Bu prosedürü denerken, RNaz içermeyen su, filtre, pipet uçları ve eldivenler dahil olmak üzere çekirdek içermeyen reaktifler ve teknikler kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen mutasyon ile ilişkili olabilecek fenotipleri araştırmak için hücresel, moleküler ve davranışsal testler yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kimerik tek kılavuz RNaz ve CRISPR / Cas9 ribonükleerproteinleri kullanarak C.Elegans'ta genomik nokta mutasyonlarının nasıl hassas bir şekilde oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, PCR taraması ile tek bir nematodun genetik bir belirteç için hızlı bir şekilde taranması için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Örnek protokolde, CRISPR tabanlı genom düzenlemeyi tarıyoruz.

Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.

Gonad Mikroenjeksiyonu: C. elegans'ın Germ Hattına Doğrudan Bileşik Verme Yöntemi

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Öğrenin C. elegans'ta CRISPR/Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak genomik nokta mutasyonları oluşturmayı. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili genetik varyasyonların fonksiyonel çalışmalarını hızlandırır.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Daha fazla video keşfet