Name: Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNAların Toeprinting analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Öğrenin, memeli mRNA'larında çeviri başlatma komplekslerinin oluşumunu incelemek için toeprinting analizi yöntemini. Bu teknik, IRES aracılıklı çeviri mekanizmalarını detaylı şekilde araştırmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bir Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada-keşif Grant'ın (RGPIN-2017-05463), Kanada Vakfı tarafından yenilik-John R. Evans liderleri Fonu (35017), kampüs Alberta yeniliklerin programı ve Alberta Bakanlığı için finanse edildi Ekonomik kalkınma ve ticaret.

Not: RNA ribonükleazlar (RNases) tarafından bozulması için son derece açıktır. RNA sağlam tutmak için standart önlemler almak. Eldiven sık sık değiştirin. Filtre uygulanmış pipet ipuçları, nükleaz ücretsiz plasticware ve kimyasallar nükleaz ücretsiz iletişim kuralının tüm adımlarını kullanın. Kullanım nükleaz içermeyen veya Dietil pyrocarbonate (DEPC)-tedavi su tüm çözümleri.
1. hazırlanması çözümleri
<ol><li>Toeprinting arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, %5 (w/v) Sükroz, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve 0,5 mM spermidine.<ol>
<li>DTT ve spermidine tek kullanımlık aliquots tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek için-20 ° C'de depolayın. Not: Kullanmadan önce hemen toeprinting arabelleğine DTT ve spermidine eklenmelidir. DTT ve spermidine yoksun bir çözümü-20 ° C'de depolanan</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquots 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) ve 91 mM adenozin trifosfat (ATP) hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>450 mL % 6 polyacrylamide - 7 M üre jel karışımı hazırlayın: 67,5 mL % 40 acrylamide:bis-Akrilamid (19:1), üre, 112.5 mL 5 x TBE (Tris/Bor/thylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) ve 120 mL su 189 g. Üre 37 ° C su banyosu ya da sıcak bir tabak karıştırma ile ısınma tarafından çözülür. Çözüm filtre (örn., 0,2 mikron nitroselüloz vakum filtre). Not: Çözüm 4 ° C'de en az bir ay depolanabilir. Dikkat: Monomeric Akrilamid deri yoluyla absorbe edilebilir bir nörotoksin var. Cilt teması önlemek için büyük özen (i.e., eldiven, önlük, giyim ve göz koruma). Polimerizasyon için % 100 tamamlanma devam edemeyebilirsiniz gibi polyacrylamide da bakım ile ele alınmalıdır.</li>
	<li>Formamide boya yükleme hazırlamak: % 95'i formamide, 18 mM EDTA, % 0,025 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 Ksilen cyanol. -20 ° C'de mağaza</li>
	<li>10 pmol/μL bir çalışma konsantrasyonu su 100 μL içine astar (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' IRDye 800 ile son etiketli) 1 nmol geçiyoruz. Işıktan korunan-20 ° c tek kullanımlık aliquots (yaklaşık 10 µL), içinde saklayın.</li>
</ol>2. mRNA hazırlanması
<ol><li>Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) uygun şablonları tarafından mRNA sentezi için DNA şablonları yükseltmek (i.e., genomik DNA veya uygun olarak plazmid DNA). Bir yüksek-sadakat DNA polimeraz üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki reaksiyon koşulları (35 döngüleri) ile kullanın: eritmek, 98 ° C, 10 s; TAV, 53 ° C, 20 s; genişletmek, 72 ° C, 30 s. Not: İleri astar (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) RNA transkripsiyonu için izin vermek için T7 organizatörü sıra içerir; ters astar (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) Poli-A kuyruk için transkripsiyonu RNA sağlamak için 51 timin kalıntıları içerir. Vitro plazmid DNA transkripsiyonu RNA da olabileceğine dikkat edin.</li>
	<li>Kullanım bir uygun transkripsiyon kiti vitro için uyarlamak IRES içeren RNA veya DNA şablonundaki kepli RNA. Üreticinin yönergeleri izleyin. RNA örnek standart 20 μL tepki cilt olarak hazırlayın. 37 ° C'de 2 adet RNase free Dnaz 30 dk ile yeni sentezlenmiş RNA tedavi</li>
	<li>Dnaz tedavi RNA 110 seyreltik µL nükleaz ücretsiz su ile 20.000 x g oda sıcaklığında de 110 µL asit fenol, girdap 5 s ve 3 dk santrifüj ekleyin. Sulu faz için yeni bir 1.5 mL microfuge tüp 100 µL kaldırmak, 3 M sodyum asetat ve girdap 2 s. Ekle, % 100 etanol, girdap 5 s, 3 Cilt 10 µL eklemek ve RNA-20 ° C'de gecede çökelti.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi > 20.000 x g 4 ° C ve atma süpernatant 30 dk için. Pelet 500 µL buz gibi % 70 (v/v) etanol ile yıkayın ve aralıklarla tekrarlayın. Büyük bir kısmını süpernatant mümkün olduğunca Aspire edin ve pelet pelet çıkarmak değil dikkatli olmak da 5-10 dakika kuruması.</li>
	<li>RNA nükleaz ücretsiz su bir çalışma konsantrasyonu 0.5 μg/μL vermeye uygun hacmi resuspend. Bu-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir.</li>
</ol>3. Toeprinting tepki
<ol><li>Mix 15 μL, tavşan Retikülosit Lysate (RRL, nükleaz tedavi), RNase inhibitörü, 1 µL 91 mm ATP (1.82 mM son) ve 85 mm GMP-PNP (nihai 1.7 mM) 1.5 mL microfuge tüp içinde 1 μL 1 μL (40 adet). 30 ° c 5 min için kuluçkaya. Not: RRL tekrarlayan donma-çözülme önlemek Tek Kişilik Kullanım için bölünmemeli olmalıdır. Kritik kontrol RRL, RNA'ın ikincil yapı nedeniyle ters transkripsiyon doğal duraklar aydınlatmak için eksik bir tepkidir. Bu denetim için RRL eski yerine koymak için toeprinting tampon ekleyin.</li>
	<li>RNA'ın 0,5 µg (1 µL) ekleyin ve 5 min için 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Toeprinting arabellek 22 µL ekleyin ve 3 dakika 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>IRDye etiketli astar 0.5 µL (5 pmol) ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>25 mM dNTPs 2 µL ekleyin (son konsantrasyonu: 1 mM), 2 µL 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL kuş Myeloblastosis virüs ters transkriptaz (AMV-RT), ve Toeprinting arabelleği 3,5 µL. Son 50 μL birimdir.</li>
	<li>Tepki için 45 dk 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>200 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin ve hemen 25:24:1 fenol: kloroform: izoamil alkol (pH yaklaşık 8.0) 250 µL ile ayıklayın. Girdap 5 s ve oda sıcaklığında 3 min için 20.000 x g, santrifüj. Yeni 1.5 mL microfuge Tube sulu faz kaldırmak, % 100 etanol, girdap 5 s, 3 cilt eklemek ve -20 ° C'de gecede çökelti.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi > 20.000 x g 4 ° C ve atma süpernatant 30 dk için. DNA Pelet 500 µL buz gibi % 70 (v/v) etanol ile yıkayın. Santrifüj kapasitesi > 4 ° C'de 15 dakika 20.000 x g Aspire edin kadar süpernatant mümkün ve hava kuru 5-10 dakika süreyle pelet pelet çıkarmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>Pelet 6 μL nükleaz ücretsiz su içinde dağıtılması ve boya yükleme formamide 3 μL ekleyin.</li>
</ol>4. sıralama tepkiler
<ol><li>2.1 DNA şablondan ve adım 3.4 IRDye etiketli astar standart sıralama reaksiyonlar, dideoxynucleotides (ddNTPs) zincir sonlandırıcılar kullanma için kullanın. Uygun bir DNA sıralama setini kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin.</li>
	<li>Formamide boya yükleniyor 3 μL ile Mix 6 μL her sıralama tepki.</li>
</ol>5. hazırlık, jel ve Elektroforez sıralama
Not: Bu protokol bir floresan Imager jel tabanlı ve bir 21 cm x 23 cm x 0.2 mm jel kullanır, ancak diğer sıralayıcılar veya jel-boyutları, gerekirse adapte edilebilir.
<ol><li>İyice 0.2 mm boşluk ekleyiciler yanı sıra kısa (23 × 25 cm) ve uzun (30 × 25 cm) cam plakanın % 100 etanol ile temizleyin. Hava kuru.</li>
	<li>% 6 polyacrylamide - 7M üre jel karışımı 30 mL % 10 (w/v) amonyum persülfat (APS) 200 μL ile karıştırın ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 μL. Kabarcıklar, önlemek için dikkat çekici jel dökmek ve 'köpekbalığı-dişli' jel tarak ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için polimerize jel izin.</li>
	<li>Sıralama cihazı montajı ve rezervuarlar 1 ile doldurun x TBE.</li>
	<li>55 ° C en uygun sıcaklık elde kadar 15dk için 1500 V'de önceden çalıştırın.</li>
	<li>(Kimden adım 3.9 veya 4.2) örnek/yükleme boya karıştırmak için sıralama jel üzerine 5 dk. yük 1 μL için 85 ° C ısı.</li>
	<li>Jel 1500 V 8 h için çalıştırın. Makine gerçek zamanlı bantlarında okuyacaktır.</li>
	<li>Aparatı sökmeye ve Akrilamid jel ve çalışan tampon atmayın.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
<li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
<li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly%28A%29+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li>
<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li>
<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

Yazarlar çatışma-in-ifşa etmek niyetimiz yok.

Toeprinting doğrudan ilgi bir RNA çeviri başlatma kompleksleri son derece kontrollü koşullar altında oluşumunu desteklemek yeteneği ölçmek için güçlü bir tekniktir. Bu iletişim kuralı toeprinting için basitleştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır memeli RNA'ların. Tavşan Retikülosit lysate (RRL) ribozomlar, mantolama, başlatıcı uygun kaynağı olarak kullanılan tRNA ve IRES trans-faktörler (ITAFs) hareket. Deneyci kendi RNA seçim sağlar ve ayrıca kendi seçtiğiniz belirli Kofaktörler ile toeprinting reaksiyonu ile de...

Çevirisi en hücresel enerji tüketir gibi bu çeviri sıkıca düzenlenmiş1olduğunu mantıklı. Diğer taraftan, bozukluk çeviri-protein çıktı bunun sonucunda değişiklik ve -genellikle kanser1,2gibi stres tepkisi ve hastalık durumları görülmektedir. Translasyonel kontrol önemli bir avantajı olan çeşitli uyaranlara3' e cevap için protein çıktılarını hücreleri değiştirebilirsiniz hızıdır. Çeviri yönetmelik böylece hücre yaşam ve ölüm1,2,3etkileyebilecek önemli bir mekanizma temsil eder. Çeviri adımlardan inisiyasyon en son derece düzenli ve karmaşık3' tür. Kısaca, en ökaryotik mRNA'ların hemen hemen her zaman onların çeviri için gerekli olan bir 5' m7G başlık içerir. Cap-bağımlı başlatma gerektirir ökaryotik başlama faktörleri eIF4E, Eıf4a ve eIF4G (cap-tanıma kompleksi 5' uç mRNA ile etkileşim kurmak için). EIF2 bağlı Başlatıcı içeren 43S preinitiation ribozom karmaşık, tRNA ve eIF3, 5' sonuna kadar mRNA yolu ile eIF4G eIF3 ile bir etkileşim işe. Karmaşık preinitiation Eıf4a tarafından destekli mRNA, tarama düşünülmektedir (RNA helikaz) başlama kodonu (AUG) bulunana kadar. Karmaşık 48S başlatma sonradan oluşmuş ve tRNA ribozom P-site teslim edilir. Son olarak, 60'lar ve 40'lı ribozom alt birimleri karmaşık, 80S başlatma oluşturmak için çeviri uzama1,3,4tarafından takip Birleşmiş. Buna ek olarak, iç ribozom giriş siteleri (IRESes) 40'lı ribozomal altbirimde başlama kodonu3için doğrudan işe alma tarafından 5' başlık gereksinimini devre dışı. Fizyolojik stres koşulları küresel mRNA çeviri değişikliklerini anahtar genel ökaryotik başlama faktörleri (mantolama) nedeniyle azalt. Ancak, kanonik olmayan çeviri başlatma mekanizmaları genellikle stres tepkisi protein kodlamak belirli mRNA seçici çeviri için izin ve kanonik olmayan çeviri inisiyasyon bozukluk gibi kanser hastalığı Devletleri'nde karıştığı 1 , 2. gizli RNA gibi hücresel IRESes, düzenleyici elemanlarının izin böyle mRNA'ların2,3çeviri için.
Bir özellikle ilginç yönü translasyonel kontrol mekanizmaları karşı verilen bir mRNA kanonik olmayan çeviri kurallı anlamaktır. Toeprinting belirli RNA'ların içinde vitroinisiyasyon çeviri ayrıntılı mekanik çalışma sağlayan bir tekniktir. Toeprinting genel amacı bir RNA ilgi hangi dizileri, yapı elemanlarının veya aksesuar belirlemek için bir çeviri başlatma koşulları, çeşitli altında ribozom ile karmaşık oluşumu nucleate yeteneği değerlendirmek etmektir verimli çeviri kabul töreni için gerekli faktörlerdir. Örneğin, ribozom işe alım 5' başlık yokluğunda engel ama bir IRES varlığı ile uyarılmış.
Vitro için teknik bir ilkesidir ilgi bir RNA uyarlamak başlatma kompleksleri forma ve tersine çevirmek için uyarlamak izin vermek için çeviri bileşenleri (veya saf bileşenleri) içeren hücre özleri huzurunda kuluçkaya RNA ile belirli bir astar. İstikrarlı RNA-ribozom kompleksleri 3' kenarında ribozom sözde 'toeprint'5,6,7durak ters transkripsiyon neden olur.
Bu iletişim kuralı, ribozomal alt birimleri, mantolama, tRNA ve IRES trans-oyunculuk faktörler (ITAFs) uygun tarafından tavşan Retikülosit lysate (RRL) katkıda bulunmuştur. Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı radiolabeled astar yerine fluorescently etiketli bir astar ve floresan jel tabanlı Imager kullanmaktır. Bu astar, radiolabeling gibi jel kurutma ve kuvvetlenmesine ekranına açığa dahil olmak üzere ek adımlar ortadan kaldırır. Floresan bantları gerçek zamanlı olarak, daha fazla çözümleme için izin jel ishal olarak kaydedilir. Her ne kadar çok Millî olan mRNA'ların da bu tekniği8tarafından analiz edilebilir kapağını X'e inhibitörü Apoptozis protein (XIAP) IRES RNA'ın burada, bir örnek kullanılır.
Hücre lysates çeviri sürecinde son çıktı ölçer, Batı analiz farklı olarak, toeprinting bir RNA çeviri başlatma karmaşık oluşumu ölçmek için vitro yaklaşımıdır. Bu indirgemeci yaklaşımın yüzeylerde veya çeviri başlatma düzenleyen faktörler son derece ayrıntılı bir çalışma için izin verir (örn., kaplama veya un kepli mRNA, IRES yapısı, varlığı ya da yokluğu Poli-A kuyruk, belirli protein faktörler, hükmü vs.). Bu nedenle, toeprinting çeviri8 farklı mod veya protein sentezi9,10IRESes gibi bir mRNA yapıları etkileri eğitimi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>DEPC (Dietil pirokarbonat)</td> <td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TRIS tabanı, Ultra saf</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (Potasyum asetat)</td> <td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg (OAc) < alt > 2 (Magnezyum asetat tetrahidrat)</td> <td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>Sakkaroz, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (Guanozin 5&asal; -[&beta;,&gama;-imido]trifosfat trisodyum tuzu hidrat) 0.1 M çözelti</td><td>Sigma</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenozin 5&asal;-trifosfat) disodyum tuzu, 100 mM çözelti</td><td>Sigma</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 Akrilamid:bis-akrilamid, %40</td> <td>Bio Basic</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>500mL şişe üstü filtrasyon üniteleri, 0.2 & m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (disodyum tuzu, dihidrat)</td><td>Bio Basic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen siyanol FF</td><td>Bio Basic</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 transkripsiyon kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 transkripsiyon kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Asit Fenol: Kloroform (5: 1)</td> <td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25: 24: 1 Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol</td><td>Invitrojen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Retikülosit Lizat (RRL). Nükleaz ile tedavi edilmemelidir.</td><td>Yeşil Hektar, ABD</td><td></td><td>Green Hektar ile iletişime geçin, 1: 1 RRL: su</td></tr><tr><td>RiboLock RNase İnhibitörü (40 U /&mikro; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP'ler</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>Her biri 25 mM'lik bir stok için eşit parçaları karıştırın.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&mikro; L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sekel Versiyon 2.0 DNA Dizileme</td><td>Kiti Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>Model 4200 IR2 DNA analizörü</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Ürünün üretimi durduruldu</td></tr><tr><td>APS (Amonyum Persülfat)</td><td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polimeraz</td><td>Yeni İngiltere Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Termo Balıkçı</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mrna'ların toeprinting analizi

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma hızı sınırlaması adım protein sentezi ve hangi hücrelerin protein çıktılarını düzenleyen önemli bir nokta temsil eder. Düzenleme protein sentezi, hücresel stres tepkisi anahtarıdır ve bozukluk birçok hastalık durumlarında, kanser gibi merkezi bir noktada bulunuyor. Örneğin, hücresel stres küresel çeviri inhibisyonu inceltiyorum kap bağımlı başlatma tarafından leads rağmen bazı stres tepkisi proteinler seçerek bir kap bağımsız şekilde çevrilir. Hücresel iç ribozom giriş siteleri (IRESes), gibi sağduyulu RNA düzenleyici elemanlarının bu belirli mRNA'ların çeviri için izin. Böyle mRNA'ların tanımlaması ve düzenleyici mekanizmaları, karakterizasyonu Moleküler biyolojide önemli bir alan olmuştur. Gibi çeviri başlatma için ilgilidir Toeprinting, RNA yapısı ve işlevi için bir yöntemdir. Toeprinting vitro yeteneği değerlendirmek için hangi dizileri, yapı elemanlarının veya aksesuar faktörler ribozom içinde söz konusu belirlemek için koşullar, çeşitli altında ribozomlar ile kararlı kompleksler oluşturmak için RNA transkripsiyonu hedeftir bağlama — için verimli çeviri başlatma öncesi bir imleç. Batı analiz ve polysome profil oluşturma, gibi diğer teknikleri ile birlikte çeviri başlatma düzenlenmesi için mekanizmalar sağlam bir karakterizasyonu için toeprinting sağlar.

XIAP IRES kap bağımsız çeviri başlatma vitro8,10destek yeteneği daha önce anlatmıştık. Toeprinting mekanik ayrıntıları karmaşık XIAP IRES inisiyasyon sorguya çekmek için anahtar yöntem oldu. XIAP IRES (şekil 1A) içeren bir mRNA kodlama bir DNA yapısı transkripsiyonu ve toeprinting analize tabi vitro yapıldı. Burada kullanılan XIAP IRES mRNA mutant türevleri <strong c...

Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Bu ayak izi analizinin genel amacı, memeli mRNA'ları üzerinde translasyon başlatma kompleksi oluşumunu gözlemlemektir. Bu yöntem, IRES aracılı çeviri başlatma gibi mRNA çevirisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir mRNA üzerinde translasyon başlatma kompleksi oluşumunun ayrıntılı analizinin yapılabilmesidir.XIAP IRES RNA'yı veya mutantlarını kodlayan PCR amplifiye DNA şablonlarından RNA'yı kopyalamak için transkripsiyon reaksiyonlarını birleştirin. Daha sonra, RNA'nın her 20 mikrolitrelik reaksiyonuna DNA şablonunu çıkarmak için iki birim RNaz içermeyen DNaz ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.Daha sonra, DNaz ile muamele edilmiş RNA'yı nükleaz içermeyen su ile 110 mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin. Ardından, RNA saflaştırmasına başlamak için 110 mikrolitre asit fenol ekleyin. Numuneleri beş saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.Fenol ekstraksiyonundan önce RNA veya CDNA'yı seyreltmek çok önemlidir. Hacim çok düşükse, sulu fazı fiziksel olarak geri kazanmak zor olacak ve nihai verim düşük olacaktır. Ardından, RNA içeren sulu fazın 100 mikrolitresini dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.10 mikrolitre 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ekleyin ve numuneleri karıştırın. Ardından, RNA'yı çökeltmek için üç hacim %100 etanol ekleyin ve numuneleri beş saniye boyunca girdaplayın. Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, numuneleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, peleti 500 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ile yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Peleti yerinden çıkarmadan mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice aspire edin.Sonra, peleti beş ila 10 dakika havayla kurutun. Peletleri nükleaz içermeyen suda mikrolitre başına 0,5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Ayak izi testine başlamak için, vahşi tip XIAP IRES RNA ve mutantlarını temsil eden her 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 15 mikrolitre nükleaz ile muamele edilmemiş tavşan retikülosit lizatı ekleyin.Her tüpe RNase inhibitörü, ATP ve GMP-PNP ekleyin. Beş dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, tüplerin her birine ilgili RNA'dan bir mikrolitre ekleyin ve beş dakika daha 30 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçka süresi boyunca, ayak izi tamponuna DTT ve spermidin ekleyin. Ardından, tüplerin her birine 22 mikrolitre parmak izi tamponu ekleyin ve 30 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Daha sonra, 0,5 mikrolitre IR boya etiketli ayak izi astarı ekleyin ve reaksiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.Daha sonra, iki mikrolitre dNTP, iki mikrolitre magnezyum asetat ve bir mikrolitre kuş miyeoloblastosis virüsü ters transkriptaz ekleyin. Parmak izi tamponu ile son hacmi 50 mikrolitreye getirin. Ardından, astar uzamasının 30 santigrat derecede 45 dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin.Ayak izi reaksiyonuna magnezyum asetat eklemek de çok önemlidir, bu olmadan ters transkriptaz en iyi şekilde çalışmayacaktır. Bundan sonra, 200 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. cDNA'nın saflaştırılmasına başlamak için 250 mikrolitre 25:24:1 fenol:kloroform:izoamil alkol, pH 8.0 ekleyin.Numuneleri beş saniye boyunca vorteksledikten sonra, numuneleri oda sıcaklığında 20.000 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Daha sonra, DNA'yı içeren sulu fazı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, DNA'yı çökeltmek ve beş saniye boyunca girdap yapmak için üç hacim% 100 etanol ekleyin.Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra, DNA peletini 500 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ile yıkayın ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin.Peleti yerinden çıkarmamaya dikkat ederek mümkün olduğunca süpernatan aspire edin. Sonra, peleti beş ila 10 dakika havayla kurutun. DNA peletini altı mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözün.Ardından, üç mikrolitre formamid yükleme boyası ekleyin. Ayak izi astarı ve XIAP IRES RNA'yı kodlayan DNA yapısı ile bir dideoksi nükleotid dizileme merdiveni hazırlamak için bir dizileme kiti kullanın. Daha sonra, her sıralama reaksiyonunun altı mikrolitresini üç mikrolitre formamid yükleme boyası ile karıştırın.Plakaları temizledikten ve monte ettikten sonra jeli dökün ve tarağı yerleştirin. Jelin polimerizasyonunu takiben, sıralama aparatını monte edin ve rezervuarları 1x TBE ile doldurun. Ardından, 55 santigrat derece sıcaklığa ulaşılana kadar 15 dakika boyunca 1500 voltta önceden çalıştırın.Tüm numuneleri formamid boya ile beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, her numuneden bir mikrolitreyi %6'lık bir poliakrilamid dizileme jeli üzerine yükleyin ve jeli sekiz saat boyunca 1500 voltta çalıştırın. Son olarak, floresan tabanlı bir görüntüleyici ile bantları gerçek zamanlı olarak okuyun.Bu yöntem, RNA'nın doğrulanmasının translasyon başlatma kompleksi oluşumu için kritik olduğunu göstermektedir. XIAP mRNA ribozom kompleksinin ters transkripsiyonu, AUG'nin akış aşağısında 17 ila 19 nükleotid tipik ayak izleri verir. 5'PPT mutant, bozulmuş ayak izi oluşumu gösterir.Bununla birlikte, 5'cap ile yazıya döküldüğünde, başlatma kompleksi oluşumu meydana gelir. Benzer şekilde, 3'PPT mutantı da bozulmuş ayak izi oluşumu gösterir. Bununla birlikte, 5'cap ile transkripsiyon, başlatma kompleksi oluşumuna yol açar.Hem 5'PPT hem de 3'PPT mutasyonlarını barındıran çift PPT mutantı, 5'cap olmadan başlatma kompleksini oluşturabilir. RRL ve GMP-PNP ve bir Poly A kuyruğunun yokluğunda başlangıç kodon mutantı için ayak izi oluşumu güçlü bir şekilde bozulur. CDNA ürünleri, bir dideoksi nükleotid dizileme merdiveni ile karşılaştırılır.İnsan beta globin veya HBB mRNA, 5'kapağın yokluğunda ayak parmağı izi göstermez. Bununla birlikte, başlatma kompleksi, HBB'nin kapaklı 5'UTR'si üzerinde oluşturulur ve AUG'nin akış aşağısında 16 ila 18 nükleotid ayak izleri verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, in vitro transkripsiyon şablonlarının ve RNA'nın hazırlanması da dahil olmak üzere üç gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü takiben, IRES'in vahşi tip veya mutant varyantlarının ikincil yapısı gibi ek soruları yanıtlamak için yapısal sondalama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, mRNA çevirisi alanındaki araştırmacıların IRES aracılı çeviriyi in vitro olarak keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, memeli mRNA'sının parmak izinin nasıl yapıldığını ve translasyon başlatma komplekslerinin oluşumunu analiz etmeyi iyi anlamış olmalısınız.Asit-fenol, fenol:kloroform:izoamil alkol ve akrilamidin son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu reaktifleri kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.

toeprinting-analysis-translation-initiation-complex-formation-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Öğrenin, memeli mRNA'larında çeviri başlatma komplekslerinin oluşumunu incelemek için toeprinting analizi yöntemini. Bu teknik, IRES aracılıklı çeviri mekanizmalarını detaylı şekilde araştırmanızı sağlar.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Daha fazla video keşfet