Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi
10 Mayıs 2018
Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.
Bu ayak izi analizinin genel amacı, memeli mRNA'ları üzerinde translasyon başlatma kompleksi oluşumunu gözlemlemektir. Bu yöntem, IRES aracılı çeviri başlatma gibi mRNA çevirisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir mRNA üzerinde translasyon başlatma kompleksi oluşumunun ayrıntılı analizinin yapılabilmesidir.
XIAP IRES RNA'yı veya mutantlarını kodlayan PCR amplifiye DNA şablonlarından RNA'yı kopyalamak için transkripsiyon reaksiyonlarını birleştirin. Daha sonra, RNA'nın her 20 mikrolitrelik reaksiyonuna DNA şablonunu çıkarmak için iki birim RNaz içermeyen DNaz ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, DNaz ile muamele edilmiş RNA'yı nükleaz içermeyen su ile 110 mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin. Ardından, RNA saflaştırmasına başlamak için 110 mikrolitre asit fenol ekleyin. Numuneleri beş saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.
Fenol ekstraksiyonundan önce RNA veya CDNA'yı seyreltmek çok önemlidir. Hacim çok düşükse, sulu fazı fiziksel olarak geri kazanmak zor olacak ve nihai verim düşük olacaktır. Ardından, RNA içeren sulu fazın 100 mikrolitresini dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
10 mikrolitre 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ekleyin ve numuneleri karıştırın. Ardından, RNA'yı çökeltmek için üç hacim %100 etanol ekleyin ve numuneleri beş saniye boyunca girdaplayın. Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, numuneleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, peleti 500 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ile yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Peleti yerinden çıkarmadan mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Sonra, peleti beş ila 10 dakika havayla kurutun. Peletleri nükleaz içermeyen suda mikrolitre başına 0,5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Ayak izi testine başlamak için, vahşi tip XIAP IRES RNA ve mutantlarını temsil eden her 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 15 mikrolitre nükleaz ile muamele edilmemiş tavşan retikülosit lizatı ekleyin.
Her tüpe RNase inhibitörü, ATP ve GMP-PNP ekleyin. Beş dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, tüplerin her birine ilgili RNA'dan bir mikrolitre ekleyin ve beş dakika daha 30 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçka süresi boyunca, ayak izi tamponuna DTT ve spermidin ekleyin. Ardından, tüplerin her birine 22 mikrolitre parmak izi tamponu ekleyin ve 30 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Daha sonra, 0,5 mikrolitre IR boya etiketli ayak izi astarı ekleyin ve reaksiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, iki mikrolitre dNTP, iki mikrolitre magnezyum asetat ve bir mikrolitre kuş miyeoloblastosis virüsü ters transkriptaz ekleyin. Parmak izi tamponu ile son hacmi 50 mikrolitreye getirin. Ardından, astar uzamasının 30 santigrat derecede 45 dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin.
Ayak izi reaksiyonuna magnezyum asetat eklemek de çok önemlidir, bu olmadan ters transkriptaz en iyi şekilde çalışmayacaktır. Bundan sonra, 200 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. cDNA'nın saflaştırılmasına başlamak için 250 mikrolitre 25:24:1 fenol:kloroform:izoamil alkol, pH 8.0 ekleyin.
Numuneleri beş saniye boyunca vorteksledikten sonra, numuneleri oda sıcaklığında 20.000 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Daha sonra, DNA'yı içeren sulu fazı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, DNA'yı çökeltmek ve beş saniye boyunca girdap yapmak için üç hacim% 100 etanol ekleyin.
Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra, DNA peletini 500 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ile yıkayın ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin.
Peleti yerinden çıkarmamaya dikkat ederek mümkün olduğunca süpernatan aspire edin. Sonra, peleti beş ila 10 dakika havayla kurutun. DNA peletini altı mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözün.
Ardından, üç mikrolitre formamid yükleme boyası ekleyin. Ayak izi astarı ve XIAP IRES RNA'yı kodlayan DNA yapısı ile bir dideoksi nükleotid dizileme merdiveni hazırlamak için bir dizileme kiti kullanın. Daha sonra, her sıralama reaksiyonunun altı mikrolitresini üç mikrolitre formamid yükleme boyası ile karıştırın.
Plakaları temizledikten ve monte ettikten sonra jeli dökün ve tarağı yerleştirin. Jelin polimerizasyonunu takiben, sıralama aparatını monte edin ve rezervuarları 1x TBE ile doldurun. Ardından, 55 santigrat derece sıcaklığa ulaşılana kadar 15 dakika boyunca 1500 voltta önceden çalıştırın.
Tüm numuneleri formamid boya ile beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, her numuneden bir mikrolitreyi %6'lık bir poliakrilamid dizileme jeli üzerine yükleyin ve jeli sekiz saat boyunca 1500 voltta çalıştırın. Son olarak, floresan tabanlı bir görüntüleyici ile bantları gerçek zamanlı olarak okuyun.
Bu yöntem, RNA'nın doğrulanmasının translasyon başlatma kompleksi oluşumu için kritik olduğunu göstermektedir. XIAP mRNA ribozom kompleksinin ters transkripsiyonu, AUG'nin akış aşağısında 17 ila 19 nükleotid tipik ayak izleri verir. 5'PPT mutant, bozulmuş ayak izi oluşumu gösterir.
Bununla birlikte, 5'cap ile yazıya döküldüğünde, başlatma kompleksi oluşumu meydana gelir. Benzer şekilde, 3'PPT mutantı da bozulmuş ayak izi oluşumu gösterir. Bununla birlikte, 5'cap ile transkripsiyon, başlatma kompleksi oluşumuna yol açar.
Hem 5'PPT hem de 3'PPT mutasyonlarını barındıran çift PPT mutantı, 5'cap olmadan başlatma kompleksini oluşturabilir. RRL ve GMP-PNP ve bir Poly A kuyruğunun yokluğunda başlangıç kodon mutantı için ayak izi oluşumu güçlü bir şekilde bozulur. CDNA ürünleri, bir dideoksi nükleotid dizileme merdiveni ile karşılaştırılır.
İnsan beta globin veya HBB mRNA, 5'kapağın yokluğunda ayak parmağı izi göstermez. Bununla birlikte, başlatma kompleksi, HBB'nin kapaklı 5'UTR'si üzerinde oluşturulur ve AUG'nin akış aşağısında 16 ila 18 nükleotid ayak izleri verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, in vitro transkripsiyon şablonlarının ve RNA'nın hazırlanması da dahil olmak üzere üç gün içinde yapılabilir.
Bu prosedürü takiben, IRES'in vahşi tip veya mutant varyantlarının ikincil yapısı gibi ek soruları yanıtlamak için yapısal sondalama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, mRNA çevirisi alanındaki araştırmacıların IRES aracılı çeviriyi in vitro olarak keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, memeli mRNA'sının parmak izinin nasıl yapıldığını ve translasyon başlatma komplekslerinin oluşumunu analiz etmeyi iyi anlamış olmalısınız.
Asit-fenol, fenol:kloroform:izoamil alkol ve akrilamidin son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu reaktifleri kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu ayakbastı analizi, memeli mRNA'larında translasyon inisyasyon komplekslerinin oluşumunu ölçmeyi amaçlamaktadır. Hem kap bağımlı hem de IRES yönlendirmeli translasyon mekanizmaları hakkında bilgiler sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Ayakbastı, translasyon inisyasyonunu incelemek için kullanılan bir tekniktir.
- Bu, mRNA'ların ribozomlarla spesifik etkileşimlerinin analizini sağlar.
- Yöntem, IRES aracılı translasyon inisyasyonunu araştırmak için uygulanabilir.
- Bu süreçleri anlamak, gen ekspresyonu düzenlemesi hakkında bilgiler için kritiktir.
Çalışmanın Amacı
- Memeli mRNA'larında translasyon inisyasyon komplekslerinin oluşumunu gözlemlemek.
- IRES yönlendirmeli translasyon inisyasyonunun mekanizmalarını keşfetmek.
- Belirli mRNA'lar üzerinde translasyon inisyasyonunun ayrıntılı bir analizini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- PCR ile amplifikasyon yapılmış DNA şablonlarından RNA transkripsiyonu için transkripsiyon reaksiyonları oluşturulur.
- RNA reaksiyonlarından DNA şablonunu çıkarmak için RNase içermeyen DNase eklenir.
- 37 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübasyon gerçekleştirilir.
- Kompleks oluşumunu değerlendirmek için ayakbastı analizi yapılır.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, translasyon inisyasyon komplekslerinin oluşumunu başarıyla gösterir.
- IRES yönlendirmeli translasyon inisyasyonu hakkında bilgiler elde edilir.
- Ribozomlarla spesifik mRNA etkileşimleri detaylı olarak analiz edilebilir.
- Teknik, translasyon inisyasyonunu incelemek için sağlam bir çerçeve sunar.
Sonuçlar
- Ayakbastı, translasyon inisyasyonunu incelemek için etkili bir yöntemdir.
- Teknik, mRNA translasyon mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirir.
- Çeşitli mRNA'ların translasyon dinamiklerini keşfetmek için uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Toeprinting analysis enables precise interrogation of translation initiation mechanisms, a critical control point in protein synthesis regulation. This method provides actionable insights into cap-dependent and IRES-mediated translation, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Its ability to dissect regulatory elements and ribosome interactions supports predictive confidence for portfolio triage in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of ribosome binding to specific mRNA sequences and structures.
- Clarifies the functional impact of regulatory elements such as IRES on translation initiation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing cap-dependent from cap-independent initiation pathways.
- Facilitates hypothesis-driven validation of translational control points relevant to disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantifying translation initiation complex formation under defined conditions.
- Enables reproducible measurement of mutant and wild-type mRNA interactions with ribosomes.
- Supports assay standardization for downstream screening of translation modulators.
- Delivers quantitative outputs that inform compound evaluation and mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by interrogating stress-response translation mechanisms.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation of translational regulation.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying the translational impact of RNA regulatory elements.
- Provides mechanistic data to inform biomarker development for translation-based interventions.
Pipeline & Workflow Integration
Toeprinting positions within the early discovery to lead identification continuum, bridging molecular mechanism elucidation and assay development for translation-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of translation initiation mechanisms and regulatory element function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for translation initiation complex formation.
- Analytics: Enables direct comparison of wild-type and mutant mRNA translation initiation efficiency.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant translation control and stress-response pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse mRNA and regulatory element interrogation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in translation control.
- Operational Value: Standardizes translation initiation assays for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying translational regulation and supporting capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms based on translational control data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, in vitro transcription, and ribosome complex assembly.
- Demands access to specialized reagents, fluorescent imaging, and sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible toeprint quantification.
- Adaptation may be needed for different mRNA templates or regulatory element contexts.
- Careful handling of hazardous reagents and optimization of reaction conditions are essential for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Preparation of mRNA
2:59
Toeprinting Assay
6:32
Sequencing Reactions and Gel Electrophoresis
7:53
Results: Importance of IRES Secondary Structure in the Formation of Translation Initiation Complexes on an Uncapped XIAP IRES RNA
9:35
Conclusion
