Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Bu deneyin genel amacı, mümkün olan en doğal ortamda teğetsel göç sırasında genetik olarak değiştirilmiş kortikal GABAerjik internöronları görselleştirmektir. Bu yöntem, beyin gelişimi sırasında proteinlerin belirli genlerinin işlev kaybının etkisini tarayarak gelişimsel sinirbilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, utero elektroporasyon gibi diğer benzer yöntemlere kıyasla düşük maliyetli ve nispeten kolay olmasıdır.

Bu nedenle, bu teknik, hastalarda tanımlanan spesifik mutasyonların patojenliğini ve beyin gelişimi sırasında yeni hastalık genlerinin rollerini açıklığa kavuşturarak, otizm ve epilepsi gibi genetik nörogelişimsel bozuklukları olan hastalar için tanıyı iyileştirebilir. Diseksiyon ve kültür için gerekli tüm aletlerle biyogüvenlik kabinini kurarak başlayın. Biyogüvenlik kabinindeki tüm aletleri cömertçe %70 etanol ile püskürtün ve aletleri ve kabin içini UV ışığı ile 15 ila 20 dakika sterilize edin.

Embriyoları toplamaya hazır olduğunuzda, ötenazi yapılmış barajın karnına% 70 etanol püskürtün. Karın derisini bir çift sterilize forseps ile yukarı çekin ve diğer elinizle cildi karın bölgesinden kesmek için sterilize edilmiş cerrahi makas kullanın. İkinci bir çift sterilize forseps ve makasla, karın fasyasını yukarı çekin ve uterustan dikkatlice kaçınarak kesin.

Üçüncü bir çift sterilize edilmiş forseps ve makas kullanarak rahim boynuzlarını tutun ve pelvik boşluktan kesin. Disseke uterus boynuzlarını, amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzlarla desteklenmiş nöral bazlı lebovitz kültür ortamı ile doldurulmuş steril 60 milimetrelik bir petridish içine yerleştirin. Steril biyogüvenlik kabininde, embriyoları plasentadan çıkarmak için iki çift ince cımbız kullanın ve kafaları dekapitasyon ile izole edin.

Bevel, steril üç mililitrelik plastik transfer pipetinin ucunu kesin ve bunu kafaları aspire etmek ve kanı yıkamak için aynı takviye edilmiş nöral bazlı kültür ortamıyla doldurulmuş yeni bir steril 60 milimetre petri kabına aktarmak için kullanın. Bunları tekrar katılaşmış siyah balmumu ile kaplanmış ve nöral bazlı takviye edilmiş kültür ortamı ile doldurulmuş üçüncü bir petri kabına aktarın. Siyah balmumu ile kaplanmış ve kafası kesilmiş kafaları içeren 16 milimetrelik petri kabını, biyogüvenlik kabinindeki diseksiyon mikroskobu altında nöral bazlı takviye edilmiş kültür ortamına yerleştirin.

Rostral kısım sağa bakacak şekilde başı sabitlemek için sol elinizde tutulan ince cımbız kullanın. Daha sonra sağ elinizdeki nano enjektörü kullanarak bir ila iki mikrolitre boya çivili plazmid solüsyonunu sağ lateral ventriküle enjekte edin. MGE'yi hedeflemek için negatif elektrot dorsal ve kafaya paralel olarak konumlandırılmış negatif elektrot ve pozitif elektrot başın ventral tarafına doğru olacak şekilde kafayı elektrotlar arasına yerleştirerek enjekte edilen beyni elektropoze edin.

Elektrotlar iyi bir şekilde yerleştirildikten sonra, 500 milisaniye ara darbe aralıklarında 50 milisaniye boyunca 40 voltluk dört kare darbeler verin. Biyogüvenlik kabininin steril ortamında çalışmaya devam ederken, beyni kafatasından çıkarmaya başlayın. İlk olarak, beyinden dikkatlice kaçınırken her göze bir iğne sokarak kafayı siyah balmumu tabakası üzerinde sabitleyin.

Daha sonra boynun sol tarafını tutmak için bir çift ince cımbız kullanın ve cildi kafatasından arkadan öne doğru yırtmak için ikinci bir ince cımbız kullanın. Bir elinizdeki cımbızla başı yanlamasına tutarken, diğer elinizdeki başka bir cımbız kullanarak kafatasını beyin sapı hizasında dikkatlice kesin ve kafatasını yukarı çekin. Her cımbızla, kafatasını sagital düzlemde öne doğru kesin ve ardından kafatası parçalarını serbest bırakmak için yanal olarak kesin.

Sonra beyin sapını kaldırın ve beyin tamamen kafatasından çıkana kadar meninksleri ve kraniyal sinirleri dikkatlice kesin. 35 milimetrelik bir petri kabını 42 santigrat derecede sıvı tutulan erimiş agaroz çözeltisi ile doldurun. Daha sonra, önceden kesilmiş transfer pipetini kullanarak elektroporasyonlu bir beyni agaroz dolu kaba hızlı bir şekilde aktarın.

Batmayı önlemek için beyni kuyunun ortasında tutmak için agarozu metal bir çubukla karıştırın ve beyni tabağa paralel bir rostral kaudal düzlemde konumlandırın. Beyne herhangi bir zarar vermemek için agaroz katılaşmaya başladığında karıştırmayı bırakın. Agaroz gömmesinin katılaşmasını beklerken, işlenecek beyin sayısına göre altı kuyucuklu kültür plakasının her bir oyuğuna 750 mikrolitre N2 takviyeli kültür ortamı aktarın.

Ve her bir ortam dolu kuyuya 30 milimetrelik bir membran eki yerleştirin. Beyni çevreleyen agarozu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve beynin etrafında bir ila iki milimetrelik bir kenar boşluğu bırakarak dikdörtgen bir blok oluşturun. Sonraki kesit adımları için oryantasyonu kolaylaştırmak için beynin rostral kısmının bloğun ön sınırına dik olduğundan emin olun.

Agaroz bloğunu vibratom platformuna, rostral kenarı aşağı bakacak ve ventral kenarı kullanıcıya bakacak şekilde yapıştırın. Dört santigrat derecede 250 mikron kalınlığında kesitler elde etmek için beyni koronal bölümler halinde kesin. Sterilize edilmiş spatulalarla, MGE içeren iki ila üç bölüm toplayın ve bir hayvanın tüm beyin bölümlerini tek bir 30 milimetrelik zar ekine yerleştirin.

Bölümler arasında çakışmayı dikkatlice önlerken. Kültür plakasını 37 santigrat derecede, %60 nem ve yüzde beş CO2 ile 48 veya 72 saat boyunca havalandırmalı steril bir inkübatöre yerleştirin. İstenilen inkübasyon süresinden sonra, ilgilenilen bölümleri üç ila beş mikrolitre kültür ortamı ile doldurulmuş sekiz odacıklı bir lamel içine aktarın.

Lameli bir çevre odasına yerleştirin, hızlandırılmış görüntüleme oturumunu ayarlamak için bilgisayar destekli bir toplama yazılımı ile donatılmış, ters çevrilmiş bir dönen disk konfokaline bağlayın. E 13.5'te TD domates kasetini eksprese eden deneysel bir plazmid ve ilgilenilen bir geni hedefleyen SH RNA ile elektropore edilen internöronlar, 48 saatlik kültürden sonra bir DLX5 6Cre RCEE GFP fare embriyosundan elde edilen organo-tipik bir beyin diliminde teğetsel göçte görülür. İnternöronlar, sekiz saat boyunca hızlandırılmış canlı görüntüleme kullanılarak görüntülendi.

Bu örnekte, aynı elektroporasyonlu internöron, nükleokinez sürecinde görülür. Kabuk yüzeyine paralel olarak kortekste teğetsel olarak göç ederken. Nöron başlangıçta nükleokinez sürecinde uzun bir hücre gövdesi gösterir.

Takip eden bir sürecin yanı sıra ve dallanmış bir öncü süreç. Üç saatlik canlı görüntülemeden sonra nükleokinezi tamamlanır. Takip etme süreci geri çekildi ve öncü süreç iki uzun dalı uzatıyor.

Beş saat 30 dakika sonra, önde gelen işlem dallarından biri geri çekildi ve nöron hücre gövdesi yaklaşık 10 mikron ileri gitti. Son olarak, sekiz saatlik görüntülemeden sonra, göç durakladı, nöron öncü sürecini tekrar uzattı ve bir takip süreci ortaya çıktı. Ancak çekirdek henüz ilerlemedi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, mümkün olan her zaman steril bir ortam sağlamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, ultraselüler düzeyde nöronal göç sırasında meydana gelen dinamik hücre iskeleti süreçlerini aydınlatmak için cevaplar için ek soruları ele almak için MG elektroporasyonları ve ardından eksplantlar gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.