Name: Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarından elde edilen organotipik beyin dilimlerinde elektroporasyon yöntemiyle GABAerjik internöronların göçünü canlı görüntüleme. Bu teknik, nörogelişimsel bozuklukların genetik temellerini anlamak için düşük maliyetli bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Savoy Vakfı ve tedavi epilepsi Vakfı'nın hibe işletim tarafından desteklendi ve ekipmanı tarafından yenilik için Kanada Vakfı E.R (confocal mikroskop) ve G.H (iplik disk confocal mikroskop) verir. Acil serviste bir kariyer ödülü alır Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Ödülü) yanı sıra--dan Kanada Enstitüleri gibi Sağlık Araştırma (CIHR; Genç Araştırmacı Ödülü). G.H. FRQ-S. üst düzey bir bilim adamı olduğunu L.E Savoy temelden, CHU Sainte-Justine Vakfı doktora sonrası Eğitim Ödülü ve FRQ-S doktora sonrası Eğitim Ödülü, yıldız Vakfı ile ortaklaşa Steriade-Savoy doktora sonrası Eğitim Ödülü alıcı olduğunu. Beyin Kanada Kanada beyin araştırma fonu, sağlık Kanada, Le için verilen mali desteği ile yoluyla, mümkün yapılmış bu proje

Tüm Deney hayvanları içeren Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les CHU Sainte-Justine araştırma Merkezi'nde Animaux de Recherche (CIBPAR) tarafından kabul edildi ve Kanada Konseyi hayvan bakım'ın rehberinde uygun olarak yapılmıştır Care and Use deneysel hayvan (Ed. 2).
Burada açıklanan protokol için embriyo elektroporasyon embriyonik gün (e) bir anda 13,5, ne zaman INs MGE kaynaklı aktif olarak oluşturulur, tepe CGE kaynaklı INs üretim45,46önce optimize edildi. Ayrıca, doğru GABAergic INs elektroporasyon önyargı için biz seçerek bileşenler (örneğin, en az artırıcı ile Dlx5/6 organizatörü)47yılında ifade bir organizatörü kullanın.
1. adım ve Organotypic dilim kültürler için çözümler hazırlanması
<ol><li>125 mL steril kültür ortamı hazırlamak.<ol>
<li>125 mL normal nöron özel kültür ortamının ölçmek ( Tablo malzemeleri formülasyon için görmek) bir daha önce UV sterilize Biyogüvenlik kabini steril bir şişede % 70 etanol ile püskürtülür. 50 serum Ücretsiz Nöron özel ek, 1,75 mL 200 mM glutamin (son konsantrasyonu 0.5 mm) ve ısı inaktive at serum steril koşullar altında daha önce bölünmemeli 6.25 mL x 2,25 mL ekleyin. İyice, aliquot 15 ml steril konik tüpler karıştırın ve 4 ° C'de depolayın Not: Hazırlanan kültür orta 4 ° C'de 3 hafta kadar depolanabilir</li>
		<li>150 µL aliquots steril koşullarda bir 100 hisse senedi çözüm Botteinstein'ın N-2 formülasyonu48 X böler ve kadar kullanmak-20 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril yapay serebrospinal sıvı (ACSF) 1 L hazırlayın.<ol>
<li>800 mL distile su bir 1 L ölçek ölçmek. 25.67 g Sükroz, 5,08 g sodyum klorür (NaCl), sodyum bikarbonat (NaHCO3), 2.18 g glikoz, 0,19 g Potasyum klorür (KCl), 1.80 g yem mono susuz sodyum fosfat (NaH2PO4), 0.15 g 1 M stokunun CaCl2 1 mL ekleyin. .2H2O ve 1 m 2 mL stok MgSO4.7H2oda sıcaklığında çözülmeye O. heyecan. Toplam hacmi 1 L. ulaşmak için distile su ilave</li>
		<li>0,22 µm filtresini kullanarak, steril şişede steril Biyogüvenlik kabini içine çözüm filtre ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ACSF içinde % 4 özel her deneme önce taze bir çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Önceden hazırlanmış ACSF 50 mL steril konik tüp içinde 25 mL ölçmek ve düşük erime noktası özel 1 g ekleyin.</li>
		<li>45 için ısı fırın mikrodalga bir de s. Dökülmesini önlemek için ne zaman kaynama başlar her 3-4 s Isıtma kesme, tüp basıncı dışarı, tekrar kapatın ve el ile özel karıştırmak için kışkırtmak izin açın. Özel çözüm homojen gelene kadar bunu tekrarlayın. Özel çözüm 42 ° C'de katılaşma önlemek için deney sırasında geri kalanı tutmak. Not: Daha yüksek sıcaklıklarda beyin dokuları zarar verir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enjeksiyon için plazmid hazırlanması
<ol><li>Bir cam mikroenjeksiyon pipet çekin<ol>
<li>Micropipette çektirme uygun parametrelerle ayarla, cam kılcal sağlanan uzayda güvenli ve filaman ile merkezli olduğundan emin olun.</li>
		<li>Çekme düğmesine basın.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde yeni yapılan mikroenjeksiyon Pipetler ısı puller ve yerin kutusundaki veya temiz petri kabına ucu zarar görmesini önlemek için daha fazla kullanılmasını kadar kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kurulum tüm aletleri ile kabine Biyogüvenlik bunun için (bkz. şekil 1A) deneme, cömertçe tüm araçları Biyogüvenlik kabini % 70 etanol ile sprey ve sterilize cihazları ve çevre için 15-20 dk UV ışığıyla.</li>
	<li>Sterilizasyon adımı sırasında plazmid buz (4 ° C) çözülme.</li>
	<li>Plazmid hisse senedi çözüm (4 µg/µL) üzerinden 10 µL temiz 1.5 mL santrifüj tüpüne ölçmek. Hızlı yeşil FCF % 0,01 ekleyin. Karışımı yavaşça, kısaca spin ve buz üzerinde kullanımda kadar devam. Not: Maxi-prep DNA bir endotoksin-Alerjik maxi-hazırlık seti üreticinin iletişim kuralı'nı göre hazırlanmalıdır. DNA TE arabellek veya nükleaz ücretsiz çözündürüldükten H2O ve boya çözüm olabilir, ama ile plazmid hazırlanması steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir değil. Plazmid Maxi-hazırlık üzerinden birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek için bölünmemeli olmalıdır. Bölünmemeli Plasmid'ler ile boya yok daha fazla o 2 h kullanmadan önce karışık olabilir ve daha fazla kullanım için refrozen değil.</li>
	<li>Sterilizasyon sonra aşağıdaki gibi nano-enjektör hazırlayın.<ol>
<li>Bir temiz kutusu veya petri kabına pipet ucu bir dış çapı yaklaşık 15 µm ulaşmak için eğimli bir şekilde kesmek için küçük cımbız kullanın saklanan önceden hazırlanmış cam mikroenjeksiyon pipet birini seçin. Not: Burada verilen dış çap kullanıcı bizim deneylerde kullandığımız bir fikir vermek için yaklaşık bir ölçüsüdür ve plazmid enjeksiyon için kafatasının piercing için sıvı izin verirken beynin zarar vermeden kolaylaştırmak için en iyi duruma getirilmiş Yükleme ve DNA'ın yayın. Dış çapı ölçmek kesme parlak alan mikroskop altında micrometric ölçek çubuğu için apposed cam mikroenjeksiyon pipet ucu bakarak.</li>
		<li>Bir şırınga ile madeni yağ (tüm havayı çıkarmak için) unpulled sonundan micropipette doldurmak için kullanın.</li>
		<li>Doldurulmuş cam micropipette nano-enjektör içinde üreticinin yönergeleri izleyerek ekleyin.</li>
		<li>Boş 2/3'ünü (Hava girişini engellemek için yeterli yağ tutma) cam micropipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dikkatle hazırlanmış micropipette plazmid/boya solüsyon içeren tüpe takın ve cam micropipette plazmid/boya çözüm ile doldurun.</li>
</ol>3. fare embriyo gelen hamile kadın koleksiyonu
<ol><li>Vajinal, tercihen aynı zamanda her gün (erken öğleden sonra) tanıttığım için değerlendirmek için üreme kadın her gün izlemek. Gün e0.5 ne zaman vajinal bir fiş gözlenen ilk gün karşılık gelir. Not: Burada açıklanan deneyler vahşi tipi fareler yapılabilir. Ancak, MGE tanımlaması kolaylaştırmak ve bütün GABAergic INs (veya belirli alt kümelerini MGE kaynaklı bileşenleri gibi) etiket Transjenik hayvanlar kullanılabilir (örneğin: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre Cre-muhabir gen, vb47,49ile). Bu durumda, enjekte deneysel plazmid görselleştirme transfected ins (sarı) (yeşil) transfected INs ile karşılaştırılabilir izin vermek için başka bir fluorophore (örneğin mCherry veya TdTomato) hızlı.</li>
	<li>Erkek, embriyonik gün e13.5, boyun çıkığı tarafından kurban. Not: anestezik ajanların kurban anda verilen geçiş ve hayatta kalma50,51 de etkileyebilir ve kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Embriyo sezaryen tarafından aşağıdaki gibi toplamak.<ol>
<li>Cömertçe kadın karın % 70 etanol ile sprey. Karın deri çift sterilize Forseps ile yukarı çekin ve diğer elini de steril Cerrahi makas karın derisini kesmek için kullanın.</li>
		<li>İkinci bir çift sterilize forseps ve makas ile karın fasya yukarı çekin ve dikkatli bir şekilde rahim kaçınırken kesti.</li>
		<li>Üçüncü çifti sterilize forseps ve makas kullanarak, rahim boynuzları çekin ve pelvik kavite dışında kesin. Disseke rahim boynuzları sinirsel tabanlı kültür amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzları ( Tablo malzemeleri ticari ürün için görmek) ile takıma orta dolu steril 60 mm petri kabına yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kabine bir steril Biyogüvenlik içinde iyi cımbız (her biri elinde) iki çift embriyoların plasenta dışında incelemek ve başkanları tarafından işten çıkarma yalıtmak için kullanın.</li>
	<li>Eğik kesimli bir steril 3 mL plastik transfer pipet ucu Aspire edin kafaları ve onları yeni steril 60 mm petri kabına katılaşmış siyah balmumu ile katmanlı ve sinirsel tabanlı aynı ile dolu transfer kültür ortamı olarak yukarıdaki desteklenmiştir. Not: Bu adımı kirleticileri (fare saç, kan) transferi en aza indirir. Siyah mum baş diseksiyon sırasında stabilize etmek için kullanılır. Kültür medya bu işlemler sırasında oksijenli gerek yok.</li>
</ol>4. İntraventriküler plazmid enjeksiyonları ve Ex Vivo elektroporasyon MGE
Not: Aşağıdaki adımları önceden hazırlanan Biyogüvenlik kabini steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>Yer 60 mm petri kabına siyah balmumu ile katmanlı ve kesik başları içeren sinirsel tabanlı kültür orta Biyogüvenlik kabini dürbün altında desteklenmiş.</li>
	<li>Baş, sağ, sol el ile sorun cımbız ile karşı karşıya rostral bölümü stabilize ve nano-enjektör sağ elinde 1-2 µL plazmid/boya çözüm sağ yanal ventrikül enjekte için kullanın. Not:-Ebilmek var olmak eş ifade deneyler her iki plazmid ekimolar konsantrasyonlarda karıştırılarak bir kurtarma Plazmid ve shRNA ifade plazmid co-electroporating tarafından yürütülen.</li>
	<li>Electroporate enjekte beyin.<ol>
<li>Başını elektrotlar ile negatif elektrot dorsally konumlandırılmış ve kafasına paralel ve ventral MGE hedeflemek için baş tarafına doğru pozitif elektrot arasına yerleştirin.</li>
		<li>Sonra elektrotlar iyi yerleştirilmiş, 4 kare bakliyat 40 V 500 ms 50 ms için arası darbe aralıkları teslim.</li>
		<li>Zaten içinde Biyogüvenlik kabini yerleştirilir cımbız kullanarak elektrotlar herhangi bir kalıntı dokuyu. Not: Bu parametreler özellikle bizim deneylerde kullanılan electroporator için optimize edilmiştir. Biz kullanıcıların en iyi duruma getirme testleri önceden electroporator farklı bir türünü kullanıyorsanız gerçekleştirmenizi öneririz.</li>
		<li>4.1-4.3 tüm kalan beyin için yineleyin. Not: her ne kadar bu iletişim kuralı bir beyin için gerekli işlemler açıklanır, bu sırayla electroporating önce 4 beyin böylece verim artan her beyin enjekte etmek mümkündür. 2 veya daha fazla farklı plazmid sırayla (Denetim veya deneysel plazmid) (littermates arasında karşılaştırma için izin verir) aynı deneyi sırasında enjekte edilir bu strateji özellikle avantajlıdır. Buna ek olarak, bu enjekte etmek mümkün ve electroporate aynı anda 's elektrotlar tamamen beyin yüzeyine paralel getirerek verimi artırmak için beynin her iki taraf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. beyin diseksiyon ve Organotypic dilim kültürleri
<ol><li>Hala Biyogüvenlik kabini steril ortamda manipüle ederken, kafatası dışında beynini incelememize.<ol>
<li>Siyah mum tabakası kafasına dikkatle beyin kaçınırken her gözün içine bir iğne ekleme tarafından stabilize.</li>
		<li>Bir çift güzel cımbız boynun sol tarafında ve kafatasından arka ön için deriden gözyaşı iyi cımbız ikinci bir çifti için kullanın.</li>
		<li>Baş yanal cımbız bir elinde tutarken, diğer elinde cımbız başka bir çifti dikkatle kafatası beyin düzeyinde kesin ve kafatası yavaşça çekin için kullanın. Her cımbız ile kafatası önüne doğru sagittal düzlemde (ortada) kesme ve kafatası parçasını kurtarmak için yanal deşmek.</li>
		<li>Beyin kaldırın ve kranial sinirler ve meninkslerde beyin tamamen dışarı kafatası kadar dikkatle kesin. Not: 5. 1'açıklanan tüm adımları bir biyogüvenlik kabini sıkı steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin düşük erime noktası özel kesit için % 4 katıştırın.<ol>
<li>35-mm petri kabına (42 ° C'de sıvı tutulması) yukarıda hazırlanan özel çözüm ile doldurun.</li>
		<li>Hızlı bir electroporated beyin daha önce kesilmiş transfer pipet kullanarak özel dolu çanak aktarın. Yemek oda sıcaklığında tutmak.</li>
		<li>Özel (batan önlemek için) iyi ortasında beyin tutmak için metal bir sopa ile karıştırın ve beyin rostro Kaudal bir düzlemde paralel olarak çanak yerleştirin. Özel başladığında kuvvetlendirmek için herhangi bir beyin hasarı önlemek için karıştırma durdurmak.</li>
		<li>Beyin çevresinde 1-2 milimetre bir marj bırakarak dikdörtgen bir blok oluşturmak üzere beyin çevreleyen özel kesmek için jilet kullanın. Beyin rostral parçası sonraki parça adımları için yönlendirme kolaylaştırmak için bloğunun ön sınırlamak için dik olduğundan emin olun.</li>
		<li>Her beyin için yineleyin. Not: Birden fazla beyin ayrı özel bloklar her beynin farklı heights adlı ayarlanırken şekillendirme tarafından bir anda (en fazla 3) kesmek mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome koronal bölümleri ve dilim kültür.<ol>
<li>100 X N-2 tezcan bir aliquot (150 µL) buz üzerinde ek ve steril koşullarda 15 mL bölünmemeli kültür Orta'ya ekleyin.</li>
		<li>Kültür orta (1 X N2 eki ile) 750 µL 6-şey kültür plaka her şey için transfer.</li>
		<li>Eğri cımbız ile bir hücre kültür Ekle (30 mm çap, 0.4 µm gözenek boyutu, PTFE) her orta-iyi doldurdu koyun.</li>
		<li>Vibratome banyo ile sürekli oksijenli ACSF doldurun. 4 ° C-banyo çevreleyen buz ile serin ya da soğuk hava vibratome kullanın.</li>
		<li>0,150 mm/s ve 80 Hertz frekans vibratome hızını ayarlar.</li>
		<li>Vibratome platformu, aşağı bakacak şekilde rostral edge ve ventral özel blokta tutkal kenar kullanıcı karşı karşıya.</li>
		<li>250 µm kalınlığında kesitler (4 ° C'de) elde etmek için koronal bölümleri beyinde kesti.</li>
		<li>Steril spatula ile tüm beyin bölümleri tek 30 mm membran üzerinde bir hayvan eklediğiniz, dikkatli bir şekilde bölümler arasında örtüşme kaçınırken yeri ve MGE içeren 2-3 bölümler toplamak. INSERT bir kuyu (yukarıda açıklandığı gibi ilave kültür ortamının 750 µL içeren) bir 6-şey kültür tabak yerleştirin. Alternatif olarak, her bölümün ayrı 13 mm çap membran ile 500 µl takıma kültür orta dolu bir 12-şey kültür plaka yerleştirilebilir. Kültür her şey için önerilen orta miktarda medya tarafından batık olmadan beslenmesi için beyin bölümleri sağlar. Not: vibratome sterilize ve bir biyogüvenlik kabini kullanılan sürece 5.3.6 ve 5.3.7 açıklanan adımları tam steril koşullarda gerçekleştirilir değil. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde herhangi bir kirlenmesini önlemek için aşağıdaki adımları yapmak çok önemlidir. Saç, yüz ve eller, hiç geçmek gibi kültür plaka (varken veya yokken kültür orta) üzerinde uygun koruma araçlar (temiz maske, cerrahi eldiven ve önlük) tüm kez ve vücut parçaları hatta kaplı, giyilmelidir. Ayrıca % 70 etanol eldiven ve beyin bölümleri toplamak için kullanılan spatula üzerinde sık sık sprey için önerilir.</li>
		<li>48 veya 72 s % 60 nem oranı ve % 5 CO2 37 ° C'de havalandırılmış bir steril kuluçka kültür tabak koyun. Not: Bu kuluçka kez MGE kaynaklı ins zaman hata görüntüleme ve sabit dilimleri, confocal görüntüleme için sırasıyla optimize. En uygun kuluçka kez önceden her deneysel tasarım için test edilmelidir. Buna ek olarak, seçilen kuluçka 72 h ve altında kültür ortamı değiştirmeye gerek yoktur. Uzun kuluçka süreleri için kültür orta 2-3 günde değiştirilmelidir.</li>
		<li>İstenen kuluçka süre sonra faiz bölümlerini bir 8 odalı coverslip transfer ve 3-5 µL kültür ortamının ekleyin. Coverslip (37 ° C, % 60 nem oranı, % 5 CO2) çevresel bir odasında bir ters bağlı yer disk confocal donatılmış bir edinme bilgisayar destekli yazılım kurulumu için hızlandırılmış görüntüleme oturum iplik. Not: Alternatif olarak, Bölüm %4 paraformaldehyde (gecede 4 ° C'de veya oda sıcaklığında 2 h) ve daha sonra immunostained electroporated INs altında bir confocal Morfolojik özellikleri görüntüleme için farklı antikorlar ile sabit olabilir mikroskop. Her ne kadar karşı boyama yordami olmadan confocal mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir eGFP ve mCherry, immünhistokimya GFP ve mCherry fiksasyon işlemi Floresan, azaltabilir beri sinyal artırmak için karşı yapmak tavsiye azaltılması öncü veya izleyen süreçlerde küçük dalları gibi embriyonik nöronların ince bileşenleri algılama.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok. Kez burada ifade Sağlık Bakanı veya Kanada hükümeti görüşlerini temsil etmemektedir.

Bu makalede, biz rahim elektroporasyon e13.5, fare MGE gerçekleştirmek için ve embriyonik beyin dilimleri kültürleri organotypic nesil için güvenilir bir yöntem sağlar. Boyden odası tahlil gibi vitro yöntemleri gerçekleştirmek nispeten kolay ve farklı genler ve proteinler diğer faktörlere müdahale olmadan belirli rolleri değerlendirmek için kullanılabilir olsa da, onlar inç soruşturma engel geçiş dinamiği açısından doğrultu ve geçiş yolu25. MGE explants sırasında göç, biz burada ...

Kortikal GABAergic interneurons (Ins) biyokimyasal özellikleri açısından, fizyolojik özellikleri ve bağlantı, çeşitli ve farklı işlevler olgun ağlar1,2,3 aracılık ,4,5. Kortikal ins farklı alt türlerinden tayini sıkıca kapsamlı eğitimi1,2olmuştur genetik cascades ile düzenlenir. Kortikal GABAergic INs çoğunluğu (% 70) ataları medial ganglionic hazretleri (MGE), ventrally bulunduğu bir embriyonik yapısı içinde kaynaklanan ve kortikal plaka1, ulaşmak için oldukça uzun mesafeler arasında geçirmeniz gerekir 2 , 6. kortikal piramit hücreleri Radyal Radyal glia iskele boyunca kortikal plaka (VZ) ventrikül bölgesinden göç ederken, böyle bir iskele bağlı değil, ins, teğet geçiş içsel çeşitli gerektirir ve uzak olmayan-kortikal yapılar2,7,8rehberlik ederken geçirme nöronlar kortikal plaka doğru çekmek için dış yardımlar. Hücre döngüsü çıktıktan sonra INs püskürtüldü MGE kemoterapi itici cues kortikal plaka9,10doğru teğet geçiş tetikleyen MGE VZ içinde ifade tarafından. INs geçirme striatum farklı itici ipuçları11 yardımı ile önlemek ve, kortikal plaka ulaşan sonra onlar bir teğet bir Radyal geçiş moduna geçin ve onların son Laminer pozisyonda, kısmen yanıt ipuçlarını piramit ulaşmak hücreler12 ve diğer hücresel nüfus13. Bileşenler, geçiş diğer nöron popülasyonları gelince nöron fiili hareketi izin vermek için çeşitli dinamik morfolojik değişiklikleri içerir. Bu sözde nöronal hareket üç ardışık adımlar tekrarlayan döngüleri tarafından karakterize: uzama önde gelen bir süreç, bir etkin anterograd hareket çekirdeği (nucleokinesis) ve retraksiyon izleyen süreç14. Geçiş sırasında sürücü dallanma ve etkin INs Yönlendirme ve geçiş14,15 hızını belirleme uygun yönde rehberlik için önde gelen süreç remodeling çok sayıda iç ve dış yardımlar tarafından düzenlenmiştir ,16.
Geçişinde kortikal düzenleyen belirleyici son yıllarda1,2,7,17,18,19,20içinde kapsamlı bir şekilde inceledik, ve bazı bu moleküler aktörler bozulma Pediatrik dirençli epilepsi veya otizm spektrum bozuklukları1,2,21, gibi nörogelişimsel bozukluklar için öne 22 , 23 , 24. bu nedenle, çeşitli vitro ve in vivo yaklaşımlar geliştirilmesi önemli ölçüde bu dinamik bir süreç, daha önce geçirilmiş25olarak çalışmaya yeteneğimizi ilerlemek için takip. Vitro yöntemleri Boyden odası tahlil ve şerit seçim tahlil de dahil olmak üzere, gereksinim ve belirli genler veya proteinler hücre özerk etkisini nöronal geçiş sırasında değerlendirilmesi en hızlı ve en tekrarlanabilir anlamına gelir sağlamak, diğer faktörler25etkisi. Canlı görüntüleme8,26,27ile birleştirildiğinde bu deneyleri özellikle yararlıdır. Bu teknikleri ile bileşenler kolayca e13.5 MGE alındı ve sonra farklı sinyal yolları ve rehberlik cues soruşturma olması, enzimatik ve mekanik ayrışma tarafından daha önce8,28 gösterildiği gibi izole . Ancak, bu deneyleri yokluğunda potansiyel olarak etkileyen hücre göç ve/veya hayatta kalma25nöronal davranış ve hücre özelliklerini değiştirebilir üç boyutlu doku mimarisi, yapay bir hücre dışı matriks yer almaktadır. Bu sınırlamaları aşmak için ex vivo MGE explants hızı ve yönü14gibi parametreleri ile birlikte taşıma sırasında meydana gelen dinamik morfolojik değişiklikleri ölçmek için alternatif bir araç olarak geliştirilmiştir, 29. MGE explants üreten nispeten basit ve kapsamlı olmuştur başka bir bölümünde30. İkinci isteğe bağlı31olmasına rağmen MGE monolayer karışık kortikal hücrelerinin veya matrigel ve kollajen çekici veya itici cues25, huzurunda karışımı üzerinde küçük bir özü kaplama üzerine kuruludur. MGE explants seyrek etiketli hücreleri görüntüleme, çalışma hücre iskeleti dallanma, önde gelen işlemi sırasında yeniden daha önce32,33 gösterildiği gibi hücre içi süreçlerin basitleştirilmesi yüksek çözünürlük için izin ver ,34 ve çalışmanın içinde. MGE explants başarıyla dinamik hücre iskeleti değişimler sırasında geçiş 2D bir ortamda, örneğin belirli farmakolojik veya kemotaktik manipülasyonlar sonra (bkz, örneğin, Tielens vd. 201633) değerlendirmek için kullanılan . Ancak, bu yaklaşım ile INs göç içinde yapay bir matris ve bu davranış ve tekrarlanabilirlik ve deneysel sonuçlar önemini değiştirebilir.
Buna karşılık, rahim içinde elektroporasyon INs genetik manipülasyon kendi doğal ortamlarında sağlar ve hızla ve verimli bir şekilde değerlendirmek kazanç etkisini ve gen fonksiyon kaybı sınırlamaları engellemeyi süre için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir pahalı ve zaman alıcı nakavt ve çakma stratejileri25,35. Rahim içinde elektroporasyon doğru ataları içinde hücre türü belirli Organizatör kullanarak ve elektrotlar MGE36dahil olmak üzere ventromedial yapılar doğru konumlandırma önyargılı. Ayrıca, rahim içinde adım 1-2 gün içinde deneysel yapıları, zamanında ifade sağlar yapı ifade viral kullanmak için gereken 7-10 gün ile karşılaştırıldığında25Vektörler. Ancak, rahim içinde çoğalmasıyla, ataları olarak düşük verimli olma eğilimindedir. Piramit hücre ataları dorsal ventrikül bölgede bulunan verimli bir şekilde transfected rağmen Nitekim, rahim içinde kullanarak elektroporasyon MGE gibi daha ventrally bulunduğu yapıların hedefleme, daha teknik meydan okuyor, özellikle küçük e13.5 embriyo ve embriyonik ölümcül daha da yüksek oranda deneysel verim25azaltır.
Bazı vitro ile ilişkili teknik sınırlamaları aşmak için MGE explant deneyleri ve vivo rahimde çoğalmasıyla, ex vivo organotypic dilim kültürler gelişmiş8,37edilmiştir, 38,39. Beyin organotypic dilim kültürler teklif vivo içinde taklit avantajı koşulları, daha az pahalı ve zaman alıcı üreten hayvan25modelleri daha olurken. Gerçekten de, bu ürünleri ile birlikte ins, belirli görselleştirme MGE kolay bir erişime ve bileşenler altında bir daha fizyolojik çevre8 ' geçiş belirli moleküler yolları araştırmak için odak elektroporasyon ile birlikte , 39 , 40 , 41. biz bu nedenle bir yaklaşım eski utero elektroporasyon ve hızlandırılmış confocal görüntüleme ile kombine organotypic kültürler için38, optimize, morfolojik ve dinamik bir süreç meydana gelen değerlendirmek için daha fazla MGE-ins teğet geçiş sırasında. Mevcut Protokolü uyarlanmış ve piramidal hücreleri42,43 geçiş çalışmaya eski rahim veya rahim içinde beyin elektroporasyon ve organotypic dilim kültürler kullanan diğerlerinden en iyi duruma getirilmiş ve kortikal INs36,39,44. Özellikle, fare embriyo kesti ve MGE electroporated ex vivo deneysel plazmid, İntraventriküler enjeksiyon sonra ne ile elde edilebilir daha MGE ataları daha verimli ve hassas hedefleme izin vermek olur rahim içinde adım. Beyin sonra ayıklanır ve bir kaç günlüğüne kültürlü bütün beyin koronal dilimler halinde kesitli, böylece sürekli izleme ve sağlar transfected INs görüntüleme. Bu yaklaşım, genellikle 5-20 yüzeysel geçirme INs kolay ayrılması emin olmak için yeterince seyrek nöronal Vaha'da etiketleme istatistiksel anlamlılık, ulaşmak için gerekli deneysel yineleme sayısını en aza indirme başına beyin dilim, etiketleri bireysel nöronlar imar ve iyi morfolojik değerlendirme. Ayrıca, organotypic kültürlerin bu geçirme sağlamak MGE explants için karşılaştırıldığında INs maruz kalmış yerel olarak salgılanan kemokinler ve talamik afferents girdileri de dahil olmak üzere daha doğal bir ortam. Bu yaklaşım böylece yön ve göç yolu önde gelen işlem dallanma gibi daha hassas dinamik süreçler karakterizasyonu izin vermek için yeterli anatomik bilgi sunarken transfected bileşenleri tarafından kabul ölçmek için de uygundur, nucleokinesis ve sondaki işlem geri çekilmesi.

<table><tbody><tr><td>Neurobazal Medium</td>: <td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Ticari olarak temin edilebilen nörona özgü kültür ortamı. Bu web sitesinde bulunan tam formülasyon: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 serumsuz takviye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X Serum içermeyen nöron spesifik takviye</td></tr><tr><td>15 mL steril santrifüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Orta (+ L-Glutamin)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>Amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzlarla desteklenmiş, ticari olarak temin edilebilen nöral bazlı kültür ortamı. Distribütörün web sitesinde bulunan eksiksiz formülasyon&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>At serumu, ısıyla inaktive edilmiş</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurocell takviyesi N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>Botteinstein'ın N-2 Formülasyonu</td></tr><tr><td>VWR Kare PETG Medya Şişeleri 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II Tip A Biyogüvenlik Kabini</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+ glikoz</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik susuz</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steril santrifüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL santrifüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Alevli/Kahverengi Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Enstrümanlar A.Ş.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm İç Çap x 75 mm Kılcal Boru</td><td>Drummond scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Yağ (ağır)</td><td>Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI İsviçre Cımbızı #5</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>504511</td><td>11 cm, düz, 0,06x0,07 mm uçlar, antimanyetik. Bunlardan 2 tanesine ihtiyacınız olacak.</td></tr><tr><td>WPI İsviçre Cımbızı #7</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>504504</td><td>11,5 cm, 0,18x0,2 mm, kavisli uçlar</td></tr><tr><td>HTC Cımbız</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>504617</td><td>11 cm, Düz, düz</td></tr><tr><td>Çalıştırma makası</td><td>World Precision Instruments</td><td>501225</td><td>16 cm, Keskin/keskin, düz. Bunlardan 3 tanesine ihtiyacınız olacak.</td></tr><tr><td>Pansuman Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501217</td><td>12,5 cm, düz, tırtıklı</td></tr><tr><td>İris Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>504478</td><td>10,2 cm, tam eğri, tırtıklı</td></tr><tr><td>DeBakey Doku Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501996</td><td>15 cm, 45 derece açı, Hassas Çene, 1,5 mm genişliğinde</td></tr><tr><td>Fisherbran Yuvarlak uçlu mikrospatula</td><td>FisherScientific</td><td>21-401-5</td><td>Bunlardan 2 tanesine ihtiyacınız olacak.</td></tr><tr><td>Nanoject II Otomatik Nanolitre Enjektör</td><td>Drummond scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC Çanak 60, Standart</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>60 mm çanak</td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı</td><td>Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>35 mm çanak</td></tr><tr><td>Siyah Balmumu</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL, küçük ampul</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Biosystems Leica M80</td><td>Üretici tarafından üretimi durdurulan stereomikroskobumuzun yerine (FisherScientific'ten StereoMaster)</td></tr><tr><td>Elektro Kare Porator</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız, Platform Kaplama, 3mm</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S Titreşimli bıçak mikrotomu</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM, Tek kenarlı tıraş bıçağı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71952-10</td><td>Vibratomun bıçak tarafından belirlenen alanına yerleştirmeden önce kör ucu çıkarın</td></tr> <tr><td>ve mikro;-Kaydırın 8 kuyulu</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>15</td></tr><tr><td>Milicell hücre kültürü eki</td> <td>paketiMillipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, hidrofilik PTFE, 0.4 & m gözenek, 50'lik paket.</td></tr><tr><td>Leica DMi6000 mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dönen disk konfokal kafa Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 edinim yazılımı</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Stage üst inkübasyon sistemi</td><td>Patoloji cihazları</td><td>LC30030</td><td>Sıcaklık, CO2 ve nem kontrolü sağlar.</td></tr><tr><td>SP8 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Michael Davidson'dan hediye</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G 25G</td><td>şişe, Biyolojik Leke Komisyonu tarafından onaylanmıştır</td></tr></tbody></table>

eski utero elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, gabaergic interneurons geçiş için organotypic dilim kültürleri

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (Ins) sürücü biliş ve davranış nöronal ağların önemli bileşenleridir. Korteks doldurmak için mukadder INs yüzeysel (medial ve Kaudal ganglionic efendiler (MGE, CGE) dorsal kortikal plaka yanıt olarak bir değişiklik de dahil olmak üzere) ventral telencephalon içsel ve dışsal kökenli yerden göç İpuçları. Genetik olarak belirli yolları değiştirmek ve nasıl onlar için uygun gerekli dinamik hücre iskeleti değişiklikleri düzenleyen araştırmak için yıl içinde farklı yöntemleri geliştirilmiştir geçiş içinde. Rahim içinde elektroporasyon yoğun gen baskı etkisini incelemek için kullanılan veya overexpression belirli inç içinde morfoloji ve son konumu üzerinde etki değerlendirme sırasında alt türlerinden. Bu yaklaşım kolayca Radyal geçirme piramit hücreleri değiştirmek için kullanılırken, İzo rahim içinde elektroporasyon hedefleme bir düşük verim azalmıştır sağkalım oranları ve yavrularını verilen oluşturduğunda ancak, bu teknik açıdan daha zorlu bir zaman elektroporasyon MGE kaynaklı INs okurken geleneksel olarak e14.5 önce yapılır. Alternatif bir yaklaşım, MGE explants MGE için kolay erişim sağlar ve görüntüleme genetiği değiştirilmiş ins kolaylaştırmak. Ancak, bu explants içinde endojen rehberlik ipuçları ve talamik girişleri yoksun yapay bir matris içine INs geçirin. Bu bize bir yöntem teknik zorluklar içinde utero yaklaşımların engellemeyi INs daha doğal bir ortamda nerede geçirebilirsiniz optimize etmek için istenir. Bu yazıda, biz eski utero elektroporasyon kolayca izlemek, görüntü ve genetiği değiştirilmiş INs yanıt olarak kendi doğal yolları boyunca göç yeniden oluşturmak için organotypic dilim kültürler tarafından takip embriyonik fare beyin kombinasyonu tanımlamak endojen ipuçları. Her iki miktar geçiş hızlandırılmış confocal görüntüleme ile dinamik açıdan, yanı sıra çeşitli morfolojik parametreleri nöronal rekonstrüksiyonlar sabit immunolabeled doku üzerinde kullanma ayrıntılı bir analiz için bu yaklaşım sağlar.

Bu bölümde, biz temsilcisi sonuçları elde edilen denetim plazmid veya bir gen ilgi e13.5 fare embriyo organotypic dilim kültürler tarafından takip MGE hedefleme bir deneysel plazmid eski utero elektroporasyon takip sağlamak 37 ° C'de 48 h (için hızlandırılmış görüntüleme) veya (fiksasyon ve immunohistokimyasal etiketleme için) 72 saat inkübe (için şematik Protokolü Bkz: şekil 1B ). Temsilcisi bir MGE explant geçiş INs de resimli (bkz. <strong class="...

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Bu deneyin genel amacı, mümkün olan en doğal ortamda teğetsel göç sırasında genetik olarak değiştirilmiş kortikal GABAerjik internöronları görselleştirmektir. Bu yöntem, beyin gelişimi sırasında proteinlerin belirli genlerinin işlev kaybının etkisini tarayarak gelişimsel sinirbilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, utero elektroporasyon gibi diğer benzer yöntemlere kıyasla düşük maliyetli ve nispeten kolay olmasıdır.Bu nedenle, bu teknik, hastalarda tanımlanan spesifik mutasyonların patojenliğini ve beyin gelişimi sırasında yeni hastalık genlerinin rollerini açıklığa kavuşturarak, otizm ve epilepsi gibi genetik nörogelişimsel bozuklukları olan hastalar için tanıyı iyileştirebilir. Diseksiyon ve kültür için gerekli tüm aletlerle biyogüvenlik kabinini kurarak başlayın. Biyogüvenlik kabinindeki tüm aletleri cömertçe %70 etanol ile püskürtün ve aletleri ve kabin içini UV ışığı ile 15 ila 20 dakika sterilize edin.Embriyoları toplamaya hazır olduğunuzda, ötenazi yapılmış barajın karnına% 70 etanol püskürtün. Karın derisini bir çift sterilize forseps ile yukarı çekin ve diğer elinizle cildi karın bölgesinden kesmek için sterilize edilmiş cerrahi makas kullanın. İkinci bir çift sterilize forseps ve makasla, karın fasyasını yukarı çekin ve uterustan dikkatlice kaçınarak kesin.Üçüncü bir çift sterilize edilmiş forseps ve makas kullanarak rahim boynuzlarını tutun ve pelvik boşluktan kesin. Disseke uterus boynuzlarını, amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzlarla desteklenmiş nöral bazlı lebovitz kültür ortamı ile doldurulmuş steril 60 milimetrelik bir petridish içine yerleştirin. Steril biyogüvenlik kabininde, embriyoları plasentadan çıkarmak için iki çift ince cımbız kullanın ve kafaları dekapitasyon ile izole edin.Bevel, steril üç mililitrelik plastik transfer pipetinin ucunu kesin ve bunu kafaları aspire etmek ve kanı yıkamak için aynı takviye edilmiş nöral bazlı kültür ortamıyla doldurulmuş yeni bir steril 60 milimetre petri kabına aktarmak için kullanın. Bunları tekrar katılaşmış siyah balmumu ile kaplanmış ve nöral bazlı takviye edilmiş kültür ortamı ile doldurulmuş üçüncü bir petri kabına aktarın. Siyah balmumu ile kaplanmış ve kafası kesilmiş kafaları içeren 16 milimetrelik petri kabını, biyogüvenlik kabinindeki diseksiyon mikroskobu altında nöral bazlı takviye edilmiş kültür ortamına yerleştirin.Rostral kısım sağa bakacak şekilde başı sabitlemek için sol elinizde tutulan ince cımbız kullanın. Daha sonra sağ elinizdeki nano enjektörü kullanarak bir ila iki mikrolitre boya çivili plazmid solüsyonunu sağ lateral ventriküle enjekte edin. MGE'yi hedeflemek için negatif elektrot dorsal ve kafaya paralel olarak konumlandırılmış negatif elektrot ve pozitif elektrot başın ventral tarafına doğru olacak şekilde kafayı elektrotlar arasına yerleştirerek enjekte edilen beyni elektropoze edin.Elektrotlar iyi bir şekilde yerleştirildikten sonra, 500 milisaniye ara darbe aralıklarında 50 milisaniye boyunca 40 voltluk dört kare darbeler verin. Biyogüvenlik kabininin steril ortamında çalışmaya devam ederken, beyni kafatasından çıkarmaya başlayın. İlk olarak, beyinden dikkatlice kaçınırken her göze bir iğne sokarak kafayı siyah balmumu tabakası üzerinde sabitleyin.Daha sonra boynun sol tarafını tutmak için bir çift ince cımbız kullanın ve cildi kafatasından arkadan öne doğru yırtmak için ikinci bir ince cımbız kullanın. Bir elinizdeki cımbızla başı yanlamasına tutarken, diğer elinizdeki başka bir cımbız kullanarak kafatasını beyin sapı hizasında dikkatlice kesin ve kafatasını yukarı çekin. Her cımbızla, kafatasını sagital düzlemde öne doğru kesin ve ardından kafatası parçalarını serbest bırakmak için yanal olarak kesin.Sonra beyin sapını kaldırın ve beyin tamamen kafatasından çıkana kadar meninksleri ve kraniyal sinirleri dikkatlice kesin. 35 milimetrelik bir petri kabını 42 santigrat derecede sıvı tutulan erimiş agaroz çözeltisi ile doldurun. Daha sonra, önceden kesilmiş transfer pipetini kullanarak elektroporasyonlu bir beyni agaroz dolu kaba hızlı bir şekilde aktarın.Batmayı önlemek için beyni kuyunun ortasında tutmak için agarozu metal bir çubukla karıştırın ve beyni tabağa paralel bir rostral kaudal düzlemde konumlandırın. Beyne herhangi bir zarar vermemek için agaroz katılaşmaya başladığında karıştırmayı bırakın. Agaroz gömmesinin katılaşmasını beklerken, işlenecek beyin sayısına göre altı kuyucuklu kültür plakasının her bir oyuğuna 750 mikrolitre N2 takviyeli kültür ortamı aktarın.Ve her bir ortam dolu kuyuya 30 milimetrelik bir membran eki yerleştirin. Beyni çevreleyen agarozu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve beynin etrafında bir ila iki milimetrelik bir kenar boşluğu bırakarak dikdörtgen bir blok oluşturun. Sonraki kesit adımları için oryantasyonu kolaylaştırmak için beynin rostral kısmının bloğun ön sınırına dik olduğundan emin olun.Agaroz bloğunu vibratom platformuna, rostral kenarı aşağı bakacak ve ventral kenarı kullanıcıya bakacak şekilde yapıştırın. Dört santigrat derecede 250 mikron kalınlığında kesitler elde etmek için beyni koronal bölümler halinde kesin. Sterilize edilmiş spatulalarla, MGE içeren iki ila üç bölüm toplayın ve bir hayvanın tüm beyin bölümlerini tek bir 30 milimetrelik zar ekine yerleştirin.Bölümler arasında çakışmayı dikkatlice önlerken. Kültür plakasını 37 santigrat derecede, %60 nem ve yüzde beş CO2 ile 48 veya 72 saat boyunca havalandırmalı steril bir inkübatöre yerleştirin. İstenilen inkübasyon süresinden sonra, ilgilenilen bölümleri üç ila beş mikrolitre kültür ortamı ile doldurulmuş sekiz odacıklı bir lamel içine aktarın.Lameli bir çevre odasına yerleştirin, hızlandırılmış görüntüleme oturumunu ayarlamak için bilgisayar destekli bir toplama yazılımı ile donatılmış, ters çevrilmiş bir dönen disk konfokaline bağlayın. E 13.5'te TD domates kasetini eksprese eden deneysel bir plazmid ve ilgilenilen bir geni hedefleyen SH RNA ile elektropore edilen internöronlar, 48 saatlik kültürden sonra bir DLX5 6Cre RCEE GFP fare embriyosundan elde edilen organo-tipik bir beyin diliminde teğetsel göçte görülür. İnternöronlar, sekiz saat boyunca hızlandırılmış canlı görüntüleme kullanılarak görüntülendi.Bu örnekte, aynı elektroporasyonlu internöron, nükleokinez sürecinde görülür. Kabuk yüzeyine paralel olarak kortekste teğetsel olarak göç ederken. Nöron başlangıçta nükleokinez sürecinde uzun bir hücre gövdesi gösterir.Takip eden bir sürecin yanı sıra ve dallanmış bir öncü süreç. Üç saatlik canlı görüntülemeden sonra nükleokinezi tamamlanır. Takip etme süreci geri çekildi ve öncü süreç iki uzun dalı uzatıyor.Beş saat 30 dakika sonra, önde gelen işlem dallarından biri geri çekildi ve nöron hücre gövdesi yaklaşık 10 mikron ileri gitti. Son olarak, sekiz saatlik görüntülemeden sonra, göç durakladı, nöron öncü sürecini tekrar uzattı ve bir takip süreci ortaya çıktı. Ancak çekirdek henüz ilerlemedi.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, mümkün olan her zaman steril bir ortam sağlamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, ultraselüler düzeyde nöronal göç sırasında meydana gelen dinamik hücre iskeleti süreçlerini aydınlatmak için cevaplar için ek soruları ele almak için MG elektroporasyonları ve ardından eksplantlar gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

E12.5 fare embriyonik Ortabeyin Organotipik dilimler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır. Organotipik dilim kültürleri dopaminerjik nöronlar veya diğer ventral orta beyin nöronları davranışını gözlemlemek için kullanılabilir.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, fare embriyolarından elde edilen organotipik beyin dilimlerinde elektroporasyon yöntemiyle GABAerjik internöronların göçünü canlı görüntüleme. Bu teknik, nörogelişimsel bozuklukların genetik temellerini anlamak için düşük maliyetli bir platform sunar.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri (Video) | JoVE Journal

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Daha fazla video keşfet