Name: Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin, görüntüleme akış sitometrisi ve transkriptomik profil oluşturma kullanarak kirletici maruziyetinin insan dendritik hücrelerinde endositik fonksiyon bozukluklarını nasıl değerlendirebilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Robert Giulitto (Hoxworth kan Merkezi) insan kan örnekleri için teşekkür ederiz ve Dr Liang Niu gen ekspresyonu normalleştirme için okur. Biz de teşekkür hibe destek üzerinden Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (ES006096), Merkez çevre genetik (CEG) pilot proje için (S.H.), Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati Üniversitesi Araştırma Konseyi Ödülü (S.H.) ve University of Cincinnati üniversite tıp çekirdek geliştirme fon (X. Z.).

Bu çalışmanın insan iletişim kuralları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulca kabul edildi ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Kan örnekleri sağlıklı bağışçılardan Cincinnati Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Hoxworth kan merkezinden elde edilmiştir.
1. Transcriptomic kirletici günese maruz kalan insan monosit kaynaklı DCs profil oluşturma
<ol><li>BaP maruz DCs toplam RNA çıkarımı<ol>
<li>İnsan DCs sitokinler GM-CSF ve Il-4 kullanarak ayırt etmek ve DC için BaP 6 gün13için maruz.</li>
		<li>Sıralama BaP maruz DCs yüzey ifade işaretleri (Lineage-HLA-DR+), temel akış sitometresi çoğunluğu oluşur geleneksel DCs kullanarak (CD11c+CD1c+)13. Tipik olarak, 10.000 DCs kültür orta % 10 içeren sıralamak FBS, DCs 600 x g ve 4 ° C 6 dk santrifüj kapasitesi ve hemen süpernatant tarafından aspirasyon 1 mL pipet ucu kullanarak kaldırın.</li>
		<li>Bir kez süpernatant aspirasyon tarafından kaldırılır, hücre Pelet RNA izolasyon kiti-80 ° C daha önce RNA çıkarma depolamada için 0.4 mL lizis/bağlama arabelleği ekleyerek parçalayıcı.</li>
		<li>RNA izolasyon kiti toplam RNA ayıklama protokolü ile toplam RNA14ayıklamak için kullanın. Bioanalyzer15kullanarak RNA bütünlük ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcriptomic analiz sıralanmış DC'lerin (Şekil 1A)<ol>
<li>Kütüphane için RNA-seq RNA Kütüphane hazırlık seti kullanarak hazırlayın. Kısacası, izole poli-bir RNA parçası (~ 200 bp), geriye doğru parçaları cDNA 1 iplikçik için uyarlamak ve dUTP ile etiketlenmiş ikinci strand cDNA sentezi tarafından izleyin.</li>
		<li>Çift Kişilik strand cDNA bağdaştırıcısına bir sap-ilmik yapısı ile son onarım ve dA-takip boncuk arıtma sonra ligate. CDNA ve bağdaştırıcı döngünün strand özgüllük korumak ve bağdaştırıcı döngü PCR için açmak için Kullanıcı (urasil özgü eksizyon reaktif) enzim ile 2 iplikçik urasil kalıntılarında tüketim.<ol>
<li>Dizin oluşturulmuş Kütüphane zenginleştirmek için evrensel ve Dizin özgü primerler kullanılarak PCR 13 döngüleri gerçekleştirin. Kitaplığı temizlemek ve Kütüphane kalite kontrol ve dağıtım boyutlandırmak için Bioanalyzer DNA yüksek hassasiyet yonga üzerinde çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir kütüphane miktar setini kullanın ve bir gerçek zamanlı PCR sistemi ile Kütüphane boyutu bilgileri toplama Kütüphane üzerinden hesaplamak için bir standart eğri yöntemi kombine.</li>
		<li>Orantılı olarak havuz tek tek dizin oluşturulmuş uyumlu kütüphaneler ve son toplam konsantrasyonu 15'e ayarlamak am. Kütüphane küme üretimi gerçekleştirmek ve ~ 25 milyon okuma örnek başına oluşturmak için bir ayarı tek oku 1 x 50 BP kütüphanede sıra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıralama<ol>
<li>Nasıl yapılacağını ve sırasıyla reaktifler SBS ve PE reaktif rafları için dizin oluşturma yük. Kadar tüm buz erimiş vardır ve her şişe/tüp reaktifler düzgün karışık 1 h için bir laboratuvar-grade su banyosunda reaktifleri koyun.</li>
		<li>ICB mix biberondan çözdürülen boya ve -20 ° C enzim ekleyerek hazırlamak ve karıştırın. NaOH çözüm sıralama talimatlara göre hazırlayın. Tüm reaktifler 4 ° C'de kullanıma hazır kadar yerleştirin.</li>
		<li>1 h sırasında dönem, sequencer'ın gücüyle bekliyor. DONOTEJECT sürücü görünür ve bilgisayar bir ağ sürücüsüne bağlanmak için bekleyin.</li>
		<li>Sequencer'ı kontrol yazılımını başlatın.</li>
		<li>%0.5 ara 20 ve % 0.03 içeren bakım yıkama çözüm 2 L ProClin 300 içinde laboratuvar-grade su hazırlamak.</li>
		<li>SBS reaktif rafa her 8 şişe ve şişe vidalı huni kapakları ~ 100 mL bakım yıkama çözeltisi ekleyin. PE reaktif rafa her on 15 mL konik tüpler için ~ 12 mL bakım yıkama çözeltisi ekleyin ve kapaklar atın.</li>
		<li>İki rafları çözüm dolu şişe/tüpler için sequencer yükleyin.</li>
		<li>Sequencer'ı kontrol yazılımı bakım yıkama seçin; işlem tamamlanana kadar sequencer sıvı sistemi temizlemek için yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Yeni koşmak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "SEQUENCE" sekmesinden başlatın; bir ağ sürücüsüne çıktı verilerini doğrudan. Tek okuma 1 x 50 bp tek dizin multiplexed kitaplıklarla parametrelerini seçin.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak, sıralama durumu, uzaktan bir bilgisayar veya akıllı telefon izlenebilir BaseSpace sıra Hub'ına oturum.</li>
		<li>Bir örnek sayfası azaltma için upload ve reaktif bilgilere göre yazılım gereksinimi sağlamak.</li>
		<li>SBS ve PE reaktifler için sequencer yükleyin. Kullanılan akış hücre (~ 15 dk) sistemiyle Başbakan.</li>
		<li>Küme oluşturma işlemi tamamlandıktan sonra (~4.5 h), akış hücre çıkar, akış hücre su ve kuru objektif kağıt kullanarak silme ile hafifçe sprey. Hafifçe akışı hücre % 95 etanol ile sprey ve kuru silin. Yüzey enkaz veya tuz kalıntı temiz olduğundan emin olmak için bir ışık karşı kontrol edin.</li>
		<li>Başbakan adım tamamlandıktan sonra kümelenmiş akışı hücre yüklemek ve nasıl yapılacağını başlar. Sıra analiz Görüntüleyici yazılım otomatik olarak başlatılır.</li>
		<li>Sıralama veri kalitesi dahil olmak üzere küme yoğunluğu, okuma geçiş filtresi, küme pass filtre %, % ≥Q30, eski faz/profaz %, SAV dizin oluşturma QC, bu veri kalitesi anlamak ve sorun giderme yardımcı olur vb üzerinden izlemek.</li>
		<li>Akış hücre conta değiştirme ve sıralama tamamlandıktan sonra bir bakım yıkama gerçekleştirin. Sequencer'ı sonraki saldırı için hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioinformatic Analizi<ol>
<li>Biyoinformatik RNA-seq veri analizi13gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yol analiz Transcriptomic profilleri (Şekil 1B)
<ol><li>Bir edgeR Bioconductor sonuç gen ifade yoğunluğu sayıları üç bağışçılardan BaP maruz kalan ve sigara maruz DCs arasında karşılaştırmak için kullanın. O zaman, BaP maruz kalan ve sigara maruz DCs mutlak kat değişiminde temel arasında differentially ifade gen tanımlamak (> 2 kıvrımları) ve (FDR) - ayarlanan p- değerleri oranı yanlış keşif (< 0,05).</li>
	<li>İşlev kümelerini differentially tahmin etmek için genlerin ifade, ToppCluster yazılım paketi KEGG ve REACTOME de dahil olmak üzere çeşitli veritabanları karşı değiştirilmiş genler aramak ve küme verileri oluşturmak için kullanın. ToppCluster hipergeometrik test fonksiyonel zenginleştirme gen liste zenginleştirme analiz16üzerinden elde etmek için kullanır.</li>
	<li>Daha fazla bu işlev kümeleri sonuçlarından Cytoscape17,18 yorum 3.3.0, karmaşık ağları görüntülenmesi için genel olarak kullanılan açık kaynak yazılım platformu için giriş. Böylece, farklı kümeleri veya yollar, endositik kümeleri ve lipid metabolizması, dahil olmak üzere dahil genler gen ifade (Şekil 1B)13ortalama kat değişim renk ek açıklama ile bir ağ gösterilmektedir.</li>
</ol>3. akış sitometresi CD1d ve Lamp1 Colocalization görüntüleme
<ol><li>Antikor BaP maruz DCs etiketleme<ol>
<li>Maruz 0.5 x 106 insan DCs 5,94 mm BaP 2 ml tam Dulbecco'nın 37 ° C'de 4 gün için modifiye kartal orta. DCs Santrifüjü 400 x g 10 dk. blok için de tarafından hücreleri insan serumu engelleyici ve anti-insan Fc reseptör antikorları buz anti-insan CD16, CD32 ve CD64 antikorları da dahil olmak üzere, 10 min için kuluçka tarafından farklılaştırılmış DCs hasat.</li>
		<li>Kuluçkaya parlak mor 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/siyanür boya 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR ve PE/Cy5-anti-CD11c buz içinde 20 dk için DCs ile. Tablo 1 antikorlar listesini gösterir.</li>
		<li>DCs PBS %4 paraformaldehyde ile düzeltin ve onları Permeabilization yıkama arabellek ile permeabilize. Bir PE etiketli arıtılmış anti-insan CD1d (51,1) karışımı ve Alexa Fluor 647 etiketli anti-Lamp1 (CD107a) ile hücre içi boyama gerçekleştirmek (H4A3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış Sitometresi ölçüm (Şekil 2) görüntüleme<ol>
<li>Cincinnati Çocuk Hastanesi 40 X amacı ile yaklaşık 10 mm çapında bir hücre için 300 piksel vermeye kullanarak akış sitometresi temel görüntüleme bir akış sitometresi kullanarak lekeli örnekleri analiz. Bir piksel boyutu yaklaşık 0,5 mm adımlarla nesne 0,5 mm dir.</li>
		<li>10.000 hücresel görüntüleri üreticinin yönerge göre tarafsız bir şekilde elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analizleri akış sitometresi görüntülerin görüntüleme
<ol><li>FİKİRLER yazılım (Şekil 2) kullanarak colocalization Analizi<ol>
<li>Tek sigara lekeli örnekleri karşı sigara lekeli örnekleri sigara lekeli BaP maruz DCs olduğu gibi rutin akış sitometresi veri BaP autofluorescence ile de dahil olmak üzere eşiğin floresan yoğunluğu ayarlayarak lekeli tazminat ile gerçekleştirmek analiz.</li>
		<li>Kapı alt kümelerine HLA-DR+CD11c+CD1d elde etmek için hücreleri lekeli+Lamp1+ hücreleri (Şekil 2A) ve göstermek hücresel Albümdeki kapı alt kümeleri (2B rakam).</li>
		<li>İki teknik dahil kriterlere göre bir png biçiminde güçlü işbirliği lekeli sinyaller görsel varlığı ve ImageJ-Fiji (2B rakam) kullanarak colocalization analizleri için CD1d ve Lamp1 proteinlerin hücre altı yerelleştirme hücre görüntüleri kaydetmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazılım ImageJ-Fiji colocalization Analizi (Şekil 3) gerçekleştirmek için kullanın.<ol>
<li>Sigara maruz ve BaP günese maruz kalan insan DCs için sırasıyla 100 kaydedilen hücre görüntüleri birleştirerek girdi görüntüsü dosyaları hazırlayın (Şekil 3A).</li>
		<li>CD1d analiz (kırmızı) ve Lamp1 (yeşil) colocalization bir scatterplot kullanarak.<ol>
<li>ImageJ-Fiji programını çalıştırın. 100 hücre görüntüleri (Şekil 3B ve Şekil 4A) .png dosyasını açın: "dosya | Açık".</li>
			<li>İki resim bir kırmızı veya yeşil bir kanal ile birleştirilmiş kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüsüyle ayrılmıştır: "görüntü | Renk | Kanalları Böl".</li>
			<li>Komutları kullanarak bir scatterplot çizmek "Analyze | Colocalization | Colocalization eşik". İstimal belgili tanımlık "PrintScreen" anahtar scatterplot kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mander'ın colocalization katsayıları her tekli hücresel resim hesaplamak (n = 100) (Şekil 4B)<ol>
<li>Bir tek hücre görüntü görüntü dosyası üzerinde kullanarak split kanallı seçin "Oval" seçim aracı.</li>
			<li>Kullanma belgili tanımlık buyurmak "Analyze | Colocalization | Colocalization eşik". "Kanal 1" bölge (ROI) ilgi diyalog kutusundan seçin. Her hücre görüntüsü için "Mander'ın eşikleri kullanarak" de dahil olmak üzere tüm hesaplama seçenekleri tutmak.</li>
			<li>Bu hesaplama tüm 100 hücre resimler için yineleyin.</li>
			<li>Kaydedin ve bir elektronik tablo kullanarak sonuçları açın.</li>
			<li>Ortalama ve standart hataları "Thresholded Mander'ın katsayıları" için arsa (n = 100, 0 anlamına gelir yok colocalization 1 anlamına gelir ve mükemmel colocalization). Öğrenci t-testi BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar (Şekil 4B) arasında karşılaştırma p değerini hesaplamak için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>CD1d ve Lamp1 arasında işbirliği için birden çok hücre resim lokalize thresholded piksel yoğunluğu yüzdesini hesaplamak (n = 100) (Şekil 4 c).<ol>
<li>4.2.3 içinde aynı çözümleme iletişim kuralını kullanan ve ek olarak sonuç seçeneği "eşiğin colocalized % yoğunluğu"seçin.</li>
			<li>Mander'ın colocalization katsayıları ile birlikte bu çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
			<li>Benzer şekilde ortalama ve standart hataları % yoğunluk CD1d ve Lamp1 arasında colocalized için arsa. Öğrenci t-testi BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar (Şekil 4 c) arasında karşılaştırma p değerini hesaplamak için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li>
<li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li>
<li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325(2009).</li>
<li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li>
<li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085(2017).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li>
<li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppCluster%3A+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li>
<li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li>
<li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li>
<li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594(2016).</li>
<li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Fonksiyonel onay döngüsünün bir değişmiş gen içeren birden çok yolları ve bireysel ve populational hücresel aktiviteler tümleştirmek için zorluk yaygın olarak etkilenen gen ekspresyonu nedeniyle meydan okuyor. Özellikle test CD1d endositik bölmeleri kaçakçılığı görüntüleme akış sitometresi çalıştırmaya başladık. Akış Sitometresi Imaging hücre populational ölçüm ve birden çok proteinlerin hücre altı colocalization bireysel gösterimi bütünleştirir. Confocal mikroskobu daha önce yüksek çözünürlüklü protein colocalization öl...

Antijen sunumu genelde kez morfolojik karakterizasyonu ve fenotipik antijen sunan hücreler1,2,3 profil oluşturma kullanarak soruşturma kaçakçılığı, hücre içi protein içerir . Görüntüleme ve fenotipleme yöntemleri avantajları birleştirmek için bir görüntüleme analizi platform tek hücre ve bir değişmiş protein colocalization insan dendritik hücreler (DC) olarak göstermek için nüfus düzeyleri açıklanmaktadır. Peptid antijen sunumu, MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri kısa peptid (8-10 artıkları) endoplazmik geleneksel CD8 etkinleştirmek için bağlamak+ T hücreleri, MHC sınıf II moleküller nispeten daha uzun bağlamak iken peptid (~ 20 artıkları) geleneksel CD4 etkinleştirmek için endositik bölmeleri içinde+ T hücreleri1,4. Buna ek olarak, lipid özgü T hücreleri CD1 proteinler tarafından ağırlıklı olarak endositik bölmeleri5,6' yüklü lipid antijenleri ile aktif hale gelir. Lipid antijen sunumu lipid metabolizma7,8,9,10 ve fonksiyonel lipid metabolitleri CD1 proteinler için yüklenmesini üretilen lipid metabolitleri temini gerektirir endositik bölmeleri5,6. Bu bağlamda, özellikle de lipofilik kirleticiler ve bağışıklık bozuklukları, çevresel maruz lipid antijen sunumu oransal çeşitli hücresel tanımlanması için kritik faktörlerdir. Bu çalışmada, biz transcriptomic analizi, görüntü profil oluşturma ve insan monosit kaynaklı DCs hücresel ve populational görüntüleme analizi lipid antijen sunumu kirletici maruz katkıda endositik protein kaçakçılığı belirlemek için kullanılır. Kesinlikle, bu Birleşik platform hücre altı protein trafiği ve colocalization farklı biyolojik süreçlerin, eğitim için uygulanabilir.
Teknik olarak, hücre altı protein yerelleştirme genellikle confocal mikroskobu kullanarak ve istatistiksel analiz algılanan hücreleri1,2,3,11sınırlı sayıda içinde gösterilmiştir. Ayrıca, akış sitometresi geniş bir hücresel düzeyde12birden çok proteinlerin Co lekeli sinyallerle kapısı hücre popülasyonlarının uygulandı; Ancak, bu hücre altı protein colocalization detaylı bir görselleştirme eksik. Yüzde protein colocalization, hücresel ve nüfus düzeyde kapsamlı ve istatistiksel analizlerini elde etmek için protein colocalization ile biyolojik özelliklerini belirlemek için profil oluşturma ve çözümleme yaklaşımlar görüntüleme dahil alaka. Özellikle, colocalization, CD1d ve ilişkili lizozomal membran proteini 1 (Lamp1) algılamak için görüntüleme akış sitometresi kullanır Bu çalışmada proteinler. Kantitatif analiz colocalized moleküllerin daha önce populational bir ölçekte yapılması zordu. Bu çalışmada, ImageJ-Fiji program protein colocalization ile çok sayıda populational ve bireysel hücresel düzeyde işbirliği lekeli hücre yüzdesi incelemek için uyarlanmış. Özellikle, biz birlikte lokalize alanlarda, yoğunluk ve CD1d protein büyük ölçüde insan DC'lerin lipofilik kirletici benzo [a] dumanında (BaP)13 maruz geç endositik bölmeleri içinde muhafaza edildi sonuç desteklemek için populational boyutu ölçülür . Bu kombine cep ve analiz görüntüleme nüfus CD1d-Lamp1 colocalization Inhibe lipid antijen sunumu için ilgili son derece tekrarlanabilir, kapsamlı ve istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar sağladı.
İnsan DCs BaP maruz transcriptome endositik lipid metabolizması ve CD1d endositik kaçakçılığı BaP pozlama Engelli hipotez kuvvetle desteklediler. Bu hipotezi test etmek için biz CD1d, endositik işaretleri ve DC işaretleri de dahil olmak üzere birden çok proteinler ile birlikte lekeli görüntüleri DC nüfusunun profil görüntüleme akış sitometresi uygulanır. Son olarak, ortak lekeli hücreleri istatistiksel olarak yoğunluk yüzdesi ve CD1d ve Lamp1 colocalization alanları göstermek için analiz edildi.

<table><tbody><tr><td>Transkriptomik</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>Illumina HiSeq sistemi</td></tr><tr><td>Görüntüleme Akışı X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>Görüntüleme akışı sitometrisi</td></tr><tr><td>mirVana miRNA İzolasyon Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Toplam RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kiti</td><td>Agilent</td><td></td><td>Toplam RNA QC analizi</td></tr><tr><td>Veriti 96 Kuyulu Hızlı Termal Döngüleyici</td><td>Termo Fisher</td><td></td><td>PCR, enzim reaksiyonu</td></tr><tr><td>NEBNext Poli(A) mRNA Manyetik İzolasyon Modülü&nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>PolyA RNA saflaştırma</td></tr><tr><td>Otomatik SMARTer Apollo sistemi</td><td>Takara</td><td></td><td>PolyA RNA saflaştırma</td></tr><tr><td>NEBNext Illumina</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Kütüphanesi için</td>Ultra RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti hazırlama</tr><tr><td>Agencourt AMPure XP manyetik boncuklar</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA saflaştırması&nbsp;</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td></td><td>Kütüphanesi QC, boyut dağılım analizi</td></tr><tr><td>Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, boyut dağılım analizi</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Kütüphane miktar tayini</td></tr><tr><td>NEBNext Kütüphane Quant Kit</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Kütüphanesi miktar tayini</td></tr><tr><td>cBot</td><td>Illumina</td><td></td><td>Kitaplığı küme oluşturma</td></tr><tr><td>TruSeq SR Küme Kiti v3 - cBot &ndash; HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Kitaplığı küme oluşturma</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Illumina</td><td></td><td>Dizileme</td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kiti v3 - HS (50 döngü)</td><td>Illumina</td><td></td><td>Dizileme</td></tr><tr><td>Fikoeritrin/Siyanin 7 (PE/Cy7)</td><td>Biyo Efsane</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Fikoeritrin/Siyanin 5 (PE/Cy5)</td><td>Biyo Efsane</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Parlak menekşe 421</td><td>Biyo Efsane</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE-anti-fare IgG2b</td><td>Bio Legend</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647)</td><td>Bio Legend</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik cd1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma transcriptomic entegre

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational morfolojik ve fonksiyonel değişikliğin endositik proteinlerin populational düzeyde bir tek hücre düzeyi ve istatistiksel görüntü analizi, görüntü yakalama talebi nedeniyle zorlu analizlerdir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz görüntüleme akış sitometresi ve transcriptomic (RNA-seq) profil oluşturma ilişkili değişmiş hücre altı yerelleştirme farklılaşma 1 d protein (CD1d) kümenin belirlemek için Engelli endositik gen ifade insan ile kullanılan ortak lipofilik sinin dendritik hücreler (DCs), kirletici benzo [a] dumanında hava. Colocalization CD1d ve endositik işaret Lamp1 proteinler akış sitometresi Imaging ile yakalanan hücre görüntüleri binlerce fikir ve ImageJ-Fiji kullanılarak analiz programları. Hücresel görüntülerle çok sayıda ortak lekeli CD1d ve Lamp1 proteinleri CD1d üzerinde Perdeleme sonra görüntülenir+Lamp1+ DCs fikirler kullanarak. Pozlama daha da thresholded scatterplots, kullanarak ortak yerelleştirilmiş yoğunluğu için Mander'ın katsayıları ile test edilmiş ve çizilen gösterilmiştir BaP üzerine geliştirilmiş CD1d ve Lamp1 colocalization ImageJ-Fiji kullanarak ortak lokalize alanlarda yüzde tabanlı. Protein colocalization, kirletici günese maruz kalan insan transcriptomic değişiklik Engelli fonksiyonel sonuç destekleyen tek ve populational hücresel düzeyde ölçmek için avantajlı bir enstrümantal ve bioinformatic yaklaşım bizim veri sağlamak DCs.

Lipofilik kirletici BaP endositik gen kümelerden her donör insan DCs. insan DCs monosit kaynaklı olarak değiştirir (n = 3) BaP ile inkübe ve daha da açıklandığı gibi RNA çıkarma ve transcriptomic analiz için kullanılan geleneksel DCs için sıralanmış . Gen ifadesinin normalleştirme, BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar arasında değişmiş gen göre differentially ifade genlerin korelasyon fonksiyonel kümelenmiş. Toppcluster program16 ilgili hücresel yol...

Akış Sitometresi Imaging hücreleri, bireysel ve populational düzeyde morfolojik ve fonksiyonel İLETİMLERİNİZE algılamak için ideal bir yaklaşım sağlar. Kirletici günese maruz kalan insan dendritik hücrelerinde lipid antijen sunumu için kesintiye endositik işlevi bir kombine transcriptomic gen ekspresyonu ve protein ticareti morfolojik gösteri profil oluşturma ile gösterilmiştir.

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Bu yöntemler yeni nesil sıralama ve akış sitometri görüntüleme analizientegre. Bazı henotypik değişikliklerin transkripsiyon yerine, özellikle kirletici maruzkalma ortamında, karışıp karışmadığı gibi ilginç soruların yanıtlatımı yardımcı olabilir. Bu basit yöntemin bizim için en büyük avantajı, biyolojik olarak önemli proteinin kolokalizasyonunu ölçmek, anahtar diferansiyel gen ekspresyonunun sonuçlarını işlevsel düzeyde yorumlamak için kullanabilmektir.Bu tekniğin sonuçları patolojik ve toksikolojik sonuçların tanısına kadar uzanır. Normal bir görüntüleyici yaklaşımı olarak, forsee protein fonksiyonu gen ekspresyonu bağlamak için yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yönteme yeni yeni bireyler görüntüleme ve transkripsiyon analizinin yüksek teknik talepleri nedeniyle mücadele edecektir.İnsan monositt tendritik hücre kitaplığı dizilimi için, ilk sıralama ve indeksleme reaktifleri sırasıyla biyosentez ve indeksleme reaktif rafları üzerine yükleyin ve tüm buz eriyene kadar rafları bir saat boyunca laboratuvar sınıfı su banyosuna yerleştirin ve reaktifler iyice karıştırılır. Reaktifler çözülirken, sıralayıcının gücü, Do Not Eject sürücüsü göründüğünde bilgisayarı bir ağ sürücüsüne bağ

integrate-imaging-flow-cytometry-transcriptomic-profiling-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Burada, intraepitelyal gama delta T hücrelerinin analizi için insan endoservikal intraepitelyal lenfositlerini elde etmek için bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, endoservikal gama delta T hücrelerinin manyetik boncuklar veya hücre sınıflandırması ile saflaştırılması için genişletilebilir.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Öğrenin, görüntüleme akış sitometrisi ve transkriptomik profil oluşturma kullanarak kirletici maruziyetinin insan dendritik hücrelerinde endositik fonksiyon bozukluklarını nasıl değerlendirebilirsiniz.

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre (Video) | JoVE Journal

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre

Daha fazla video keşfet