Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Bu prosedürün genel amacı, insülin salgılayan hücrelerden salgılanan insülin seviyelerini indüklemek ve doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, pankreas beta hücrelerinde glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu altındaki ana mekanizmalar gibi diyabet alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, glikoz stimülasyonuna yanıt olarak insülin sekresyonunu doğru ve hızlı bir şekilde ölçebilmesi ve sekresyon üzerindeki potansiyel ilaç etkilerini tespit edebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, Tip 2 diyabetin tedavisi için tedavi ve ilaç keşfine kadar uzanır, çünkü ilaca bağlı metabolik disfonksiyonun mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlayacaktır. Bu yöntem, ölümsüzleştirilmiş beta hücre dizilerinden insülin salgılanması hakkında fikir verebilse de, sağlam pankreas adacıkları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, çoklu hücre işleme adımları ve ilaç preparatları nedeniyle mücadele edecektir.

Bu yöntem için ilk olarak, dopaminerjik ilaçların insülin sekresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için hızlı bir test yapmak istediğimizde aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü hücrelerin hassas doğası ve deneyler arasındaki testin tutarlılığını sağlamak için hassasiyetin önemi nedeniyle hücre işleme adımlarının öğrenilmesi zordur. İlk olarak, INS-1E hücrelerini metin protokolünde belirtildiği gibi büyütün.

Hücreler istenen birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin. Hücreleri beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere 0,5 mililitre% 025 tripsin ekleyin, ardından hücreleri 37 santigrat derecede üç ila dört dakika inkübatörde bırakın.

Dokuz mililitre tam ortam ekleyerek tripsini devre dışı bırakın. Daha sonra, hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra bir pelet oluşturmak için hücreleri santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, peleti beş mililitre taze ortamda çözün. Tüpten 10 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş hücreyi pipetleyin ve canlılığı değerlendirmek için 10 mikrolitre tripan mavisi hayati boya ile karıştırın. Ardından, canlı ve ölü hücrelerin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın ve hücrelerin %90'ının canlı olduğundan emin olun.

Saydıktan sonra, taze RPMI 1640 ortamında mililitre başına bir milyon hücre ekleyin, daha sonra poli-L-lizin kaplı 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0.5 mililitre 500.000 INS-1E hücresi tohumlayın. Plakayı bir gün boyunca inkübatörde bırakın. Ertesi gün, ortamı çıkarın ve kuyucukların her birine 500 mikrolitre taze RPMI 1640 ortamı ekleyin.

Hücrelerin kuyu yüzeylerine yayılması için plakayı 24 saat daha inkübe edin. Tahlili gerçekleştirmek için önce KRB tamponunu hazırlayın, ardından ortamı her bir kuyucuktan aspire edin ve önceden ısıtılmış fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa sığır serum albümini ile desteklenmiş, ancak glikoz içermeyen 450 mikrolitre KRB tamponu ekleyin.

Kültür plakasını bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bırakın. 10X nihai konsantrasyon 200 milimolar glikoz ile desteklenmiş KRB tamponunda ilaçların seri seyreltmelerini hazırlayın. Glikoz açlığı adımından sonra, karşılık gelen oyukların her birine 50 mikrolitre seri olarak seyreltilmiş ilaç pipetleyin.

Glikoz stimülasyonu için, ilgili seri olarak seyreltilmiş ilaçları 20 milimolar glikoz varlığında ekleyin. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Stimülasyon bittiğinde, süpernatanları toplayın ve bunları etiketli 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.

Toplanan her süpernatantın 10 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Bir ila 10 seyreltme oranı elde etmek için her kuyucuğa 90 mikrolitre KRB ekleyin. Homojenliği sağlamak için seyreltmeleri karıştırın.

Ardından, HTRF insülin testi için insülin standart eğrisini elde edin. Daha sonra, standart insülin örneklerinin her birine 10 mikrolitre ve seyreltilmiş tahlil süpernatantlarını 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Tespit tamponunda bir oranı kabul etmek için antikor karışımını bir ila iki donörde hazırlayın.

Antikor karışımını hazırladıktan sonra, 96 oyuklu bir plakadaki oyukların her birine 30 mikrolitre ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında inkübe edin. İki saatlik inkübasyondan sonra, plaka okuyucusunda antikor karışımı ile plakayı okuyun.

Okuma için 665 ve 620 nanometrede uygun HTRF optik modülünü kullanın ve her kuyu için 200 flaş kullanın. İlk olarak, tahlil örneklerinden insülinin gerçek değerlerini tahmin etmek için bir insülin standart eğrisi çizilir. Standart eğri, elde edilen oransal floresan okumasının, önceden tanımlanmış standart insan insülin konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak önemli ölçüde arttığını göstermektedir.

Daha sonra, INS-1E hücrelerinden bazal insülin sekresyon seviyesi, 20 milimolar glikozun varlığında veya yokluğunda incelenir. Grafikten, hücrelerin glikoz varlığında mililitre insülin başına yaklaşık 100 nanogram salgıladığını göstermektedir. İlginç bir şekilde, insülin seviyesi, glikoz yokluğunda mililitre başına yaklaşık 15 nanogramda neredeyse yarısıdır.

Daha sonra, hücreler 20 milimolar glikoz ile artan dopamin konsantrasyonlarının varlığında inkübe edilir. Salgılanan insülin, her bir oyuktan maksimum insülin yüzdesinin ortalama değerine normalize edilir. Grafik, dopaminin GSIS'i inhibe ettiğini ve böylece GSIS'deki dopaminerjik reseptörlerin fonksiyonel önemini göstermektedir.

Bu grafik, bir Tip 2 diyabet ilacı olan bromokripinin, GSIS'i indüklemede dopaminden daha güçlü olduğunu göstermektedir. Bu grafikler, artan quinpirol konsantrasyonu ile, bir D2 agonistinin, bromokriptinden daha az verimli olmasına rağmen, GSIS'i uyarmada dopamin gibi benzer bir güç gösterdiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa dört ila beş saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, dikkatli ve tutarlı bir şekilde pipetlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, aşağı akış sinyalizasyonu üzerindeki dopaminerjik ilaç etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için döngüsel AMP HDRF testi gibi diğer fonksiyonel testler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, metabolizma alanındaki araştırmacıların hem ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinde hem de pankreas adacıklarında diğer endokrin salgı yollarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, HDRF kullanarak hücrelerden insülin salgısını nasıl doğru bir şekilde ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.