Name: Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Öğrenin, pankreatik beta hücrelerinde HTRF tekniği kullanarak insülin salgılanmasını hızlı ve doğru bir şekilde ölçme yöntemini. Bu yaklaşım, diyabet araştırmalarında glukoz uyarılı salgılanma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ifşa gerek yok.

1. INS-1E hücreleri: bakım ve kaplama
<ol><li>INS-1E hücreleri oksijen 37 ˚C/5% CO2 kuluçka ve kültürlü RPMI 1640 orta ile %5 (v/v) ısı inaktive fetal sığır serum ile 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin takıma korumak çözüm, 50 µM β-mercaptoethanol. 10 mL tam RPMI 1640 orta (plaka), başına hücrelerde kültür % 80-90 izdiham ulaşana kadar ne zaman onlar trypsinized ve pasajlı veya insülin salgısı tahlil için kullanılan.</li>
	<li>
1. gün: Medya Aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mL de önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Tripsin (% 0,025) 0.5 mL 1:1 0.5 ml hücreleri trypsinize ve 3-4 dk 37 ˚C az için kuluçkaya için PBS seyreltilmiş ekleyin. Tripsin 15 mL santrifüj tüpü 9 mL tam medya ve transfer hücreleri ekleyerek pipetting tarafından devre dışı bırakın.</li>
	<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve hücre Pelet yaklaşık 5 mL taze medyada yeniden askıya alma.</li>
	<li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li><ol><li><li></ol></li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr></tbody></table><ol start="3"><li></li><li> </li><li><li><li> </li></ol><ol><li></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank"></a><ol start="2"><li><li></li><li></li></ol>

<ol><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+Insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
<li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li>
<li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li>
<li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li>
<li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22928575">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li>
<li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684(2016).</li>
<li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li>
<li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li>
<li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET%2FLRET%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li>
<li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTRF%28%28R%29%29%3A+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li>
<li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTRF%3A+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li>
<li>Mathis, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10838427">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li>
<li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li>
<li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+%5BCa%282%2B%29%5D+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li>
<li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li>
<li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li>
<li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li>
<li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li>
<li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine%3A+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Endocr+Metab+Immune+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li>
<li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromocriptine+mesylate%3A+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li>
<li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li>
<li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li>
<li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432(2017).</li>
<li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li>
</ol>

Biz Nicolas Pierre (Cisbio BİYOANALİZLER) için faydalı tavsiyeler ve Dr. Pierre Maechler (Cenevre Üniversitesi) cömertçe INS-1E hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Savunma Bakanlığı (grant PR141292 Z.F. için) ve John F. ve Nancy A. Emmerling Fonu (için Z.F.) Pittsburgh Vakfın fon tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan HTRF insülin tahlil insülin salgılanması kültürlü hücre tabanlı sistemden ölçmek için hızlı, verimli bir sistem sunmaktadır. En önemli avantajları arasında bu tahlil yüksek sinyal gürültü oranı nedeniyle düşük arka plan sinyal sunmaktadır. Buna ek olarak, biz HTRF sinyal uzun bir süre için kararlı olduğunu doğruladı (> 24 h)7. Yine de, insülin bağlama monoklonal antikorlar, hızlı bir şekilde tahlil için ek sonra bağlama doygunluk ulaşmak beri Kinetik antikor bağlama ortam sıcaklığ...

Enerji metabolizmasının büyük bir anabolik hormon tarafından insülin ince ayar. İnsülin sentezlenmiş ve yanıt olarak artan hücre dışı şekeri pankreas beta hücreleri tarafından yayımlanan. Yayımlanan insülin glukoz alımını insülin duyarlı dokular1,2tarafından tetikler. Fizyolojik açıdan, bu glikoz konsantrasyonu glukoz alımını düzenleyen insülin salgılanmasını tarafından takip bir yemekten sonra yükselmesine bağlı olduğu. İnsülin direnci ile sonuçlanan metabolik bozukluklar glikoz homeostazı bozuklukları neden olabiliyor ve sonuçta, tip 2 diyabet2,3,4başlangıcı.
Her ne kadar insülin salgılanması kapsamlı eğitimi aldı, onun düzenleyici mekanizmaları kötü anlaşılır kalır. Soruşturmanın kritik bir alan kimliği roman modülatörler insülin salgılanması beta hücreleri5,6,7,8tarafından olmuştur. Bu çalışmalar glikoz stimülasyon ve insülin salgılanması kaplin ilişkisi daha iyi anlaşılmasını gerektirir. Bu nedenle, doğru bir şekilde izlemek ve glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) düzeylerini ölçmek için yetenek gerekli olmuştur. Bugüne kadar ancak, sınırlı sayıda yöntemleri GSIS insülin salgılayan hücre satırları ve/veya pankreas adacıkları kullanarak miktar izin vermek mevcut idi. Radioimmunoassay (RIA), hangi Radyoizotop öğesini insülin ve antikorlar biridir. Bu yaklaşımın ana sınırlamaları nedeniyle işleme ve bertaraf radyoaktif malzemelerin güvenlik sorunları içerir. Ayrıca, bu emek yoğun, birden çok uzun çamaşır ve kuluçka adımları içeren bir yöntemdir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) insülin algılama için antikorlar kullanan başka bir pahalı ve emek yoğun bir yaklaşımdır. Varyasyon antikor benzeşim ve insülin tanıma verimliliğini faktörler bu yöntemin sınırlama var ve tekrarlanabilirlik sonuçları etkileyebilir. Ne ELISA ne de RIA yüksek üretilen iş deneyler için tasarlanmıştır. AlphaScreen algılama ve insülin salgılanması düzeylerini ölçmek için kullanılan homojen bir tahlil olduğunu. AlphaScreen teknoloji ortam oksijen dönüşüm Kemiluminesan üretimi kaynaklanan chemiluminescent türleri ile tepki verebilir bir heyecanlı oksijen singlet durumuna dayanır. Tahlil homojen olduğundan, RIA ve ELISA ile ilgili çamaşır adımlardan ortadan kalkar. Ancak, sinyal tepki doğası gereği istikrarsızlık tahlil okuma etkileyebilecek bir sınırlayıcı faktördür. (TR-KISKAÇ, Heyduk ve meslektaşları9tarafından geliştirilen başka bir homojen insülin molekül üzerinde farklı epitopları için iki ayrı antikorların bağlama göre insülin ölçüm yaklaşımdır. Antikorlar her kimyasal olarak bağlantılı çift telli DNA'sı ile kısa tamamlayıcı tek iplikçikli DNA çıkıntılar vardır. İnsülin antikorları bağlama onları bir araya getirir ve bir çift telli DNA dubleks için yol açar. Her antikor da ilgili bir donör veya alıcısı fluorophore ile ilişkilidir ve DNA çift yönlü Derneği Förster rezonans enerji transferi (FRET) oluşturmak için bu fluorophores buluşturuyor. TR-KISKAÇ, bir potansiyel sınırlama ancak, perde ile aittir. Arka plan Floresans FRET reaksiyon sırasında hızla dağılmaya yetersizlik arka plan Floresans nispeten yüksek düzeyde ve düşük sinyal gürültü oranı tahlil içinde neden olabilir. Bu nedenle, bir ihtiyaç GSIS bir yüksek-den geçerek şekilde miktarının için güvenilir, sağlam ve uygun maliyetli bir tahlil için devam eder.
Biyofizik son gelişmeler bir homojen zaman çözüldü floresan enerji rezonans transferi (HTRF) dayalı tahlil gelişiminde sonuçlandı. Enerji aktarım içinde özellikle, tahlil daha doğru bir şekilde donör ve alıcısı arasındaki enerji transferi ışınımsal olmayan ışıma enerji rezonans transferi (LRET)10 HTRF dayanan FRET dayalı olarak açıklanan olabilir tür11,12,13. Bu ayrım bir floresan zamanlama beri önemli, ya da perdeleme aynı türleri FRET ve LRET için kullanılan temel perde etkileşim Şoklama LRET için daha çok farklı olsa da. Ayrıca, nadir toprak lanthanide cryptate kullanımı Evropyum gibi maddeler ve birleşimler veya uzun floresan yarı-hayat12,14HTRF terbium cryptate üretir. Bu belirli bir gecikme süresiyle (µsn) donör uyarma ve alıcısı (Yani, zaman çözüldü tahlil) emisyon ölçümü arasında giriş benzersiz avantajı sunuyor. Bu gecikme süresini alıcısı emisyon Floresans ölçüm önce dağılımı arka plan floresan için yeterli zaman sağlar. Sonuç olarak, okuma non-spesifik Floresans ücretsiz ve böylece, bir yüksek sinyal gürültü oranı elde edilir mi (şekil 1). Ayrıca, HTRF homojen doğası çok tahlil yapmak ilişkisiz türler ELISA veya RIA tabanlı yöntemleri daha daha fazla hızlı yıkama adımları yıkamak için gereksinimini ortadan kaldırır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Şekil 1: HTRF insülin algılama için mekanizmasının şematik. İki bağımsız olarak oluşturulan monoklonal antikorlar özellikle tanımak ve insülin ayrı sitelerde bağlayın. Bu antikorlar Evropyum cryptate donör veya XL665 alıcısı için Birleşik. Uyarma 337 nm sonuçlara emisyon 620, içinde bağış nm. Elde edilen enerji transferi bir daha uzun dalga boyu, 665 yayılmasını sağlamak XL665 neden olan nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Burada, detaylı bir protokol sağlar GSIS INS-1E hücrelerden düzeylerini belirlemek için HTRF dayalı bir yaklaşım kullanmak için insülinoma hücre satır15sıçan bir iyi kurulmuş insülin salgılayan beta hücre kaynaklı. Buna ek olarak, bu tahlil insülin salgılanması moleküler düzenleyiciler farmakolojik profili tanımlamak için kullanılabilir. Dopamin D2incelemek için bu HTRF tabanlı insülin testin uyguladığımız-reseptör düzenleme GSIS, hangi tarihlerde. Artan çalışmalar nörotransmitter dopamin GSIS8,16,17,18,19,20, önemli bir düzenleyicisidir indirdik 21 , 22. dopamin bir negatif otokrin/parakrin şekilde dopamin D2eylemler yoluyla GSIS etkiler-tarihlerde beta pankreas hücreleri8 yüzeyde ifade reseptörleri (D2, D3, D4 reseptörleri) , 16 , 19. bu tahlil kullanarak, biz GSIS olumsuz bir düzenleyici olarak dopamin'ın rolü onaylamak ve gösteren dopamin D2-reseptör agonistleri bromokriptin ve quinpirole da GSIS azaltmak gibi.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu beyaz yarım alan plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384 oyuklu beyaz düşük hacimli, yuvarlak tabanlı plaka</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin Yüksek Menzilli Kiti</td><td>Cisbio Biyotahliller</td><td>62IN1PEH&nbsp;</td><td>10.000 test HTRF bazlı insülin test kiti</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plaka okuyucu</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>HTRF tabanlı tahlil okumaları için uyarlanmış plaka</td></tr><tr><td>okuyucu Plaka kapatıcılar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>Antikorlar inkübe edilirken plakayı mühürlemek için</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640 (1x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11875-093</td> <td>[+] L-glutamin</td></tr><tr><td>Tripsin% 0.05 & nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodyum bikarbonat</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Kalsiyum ve magnezyum olmadan</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin çözeltisi 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (% 0.4)</td> <td>Gibco&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromokriptin mesilat</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr> <tr><td>(-) -Quinpirole hidroklorür</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil sülfoksit)</td> <td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homojen zaman çözüldü förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

İnsülin salgılanması tespiti düzenlenmiş salgılanmasını de çalışmalar olduğu gibi metabolizma elucidating mekanizmaları için önemlidir. Çok sayıda insülin deneyleri yıllardır varmışsın, homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi (HTRF) teknolojisi son gelişiyle önemli ölçüde bu ölçümler basitleştirdi. Bu hızlı, uygun maliyetli, tekrarlanabilir ve güçlü optik tahlil zaman çözüldü Förster enerji rezonans Transfer kolaylaştırır uzun süreli emisyon ile parlak fluorophores için Birleşik antikorları üzerine bağımlı olduğunu. Ayrıca, HTRF insülin algılama yüksek üretilen iş tarama testleri geliştirme için mükellef olduğunu. Burada HTRF insülin salgılanması INS-1E hücrelerde, bir sıçan insülinoma türetilmiş hücre kültürünü algılamak için kullanır. Bu bize Bazal düzeyde insülin ve glikoz stimülasyon cevaben yaptıkları değişiklikleri tahmin etmek izin verir. Buna ek olarak, bu insülin algılama sistemi dopamin rol glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) negatif bir düzenleyici olarak onaylamak için kullanın. Benzer bir şekilde, diğer dopamin D2-reseptör agonistleri, quinpirole ve bromokriptin, GSIS bir konsantrasyon bağımlı şekilde azaltmak gibi. Sonuçlarımız HTRF insülin tahlil biçiminin GSIS ve farmakolojik kendi profilleri çok sayıda uyuşturucu rolünü belirlemede yardımcı programı vurgulayın.

Biz bizim insülin HTRF tahlil önceden tanımlanmış konsantrasyonları (Şekil 2) saf insan insülin Standartlar kullanılarak bir insülin standart eğri üreterek geçerliliği. Üretimi ratiometric floresan okuma ulaşmak için bize izin verilen standart eğri ve bu nedenle ilaç tedavileri (Şekil 2) yanıt olarak salgılanan insülin düzeylerini belirlemek. Intraplate değişim eğrisi montaj için en az (R2 0.99996 ± 5.0 x 10<s...

Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Bu prosedürün genel amacı, insülin salgılayan hücrelerden salgılanan insülin seviyelerini indüklemek ve doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, pankreas beta hücrelerinde glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu altındaki ana mekanizmalar gibi diyabet alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, glikoz stimülasyonuna yanıt olarak insülin sekresyonunu doğru ve hızlı bir şekilde ölçebilmesi ve sekresyon üzerindeki potansiyel ilaç etkilerini tespit edebilmesidir.Bu tekniğin etkileri, Tip 2 diyabetin tedavisi için tedavi ve ilaç keşfine kadar uzanır, çünkü ilaca bağlı metabolik disfonksiyonun mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlayacaktır. Bu yöntem, ölümsüzleştirilmiş beta hücre dizilerinden insülin salgılanması hakkında fikir verebilse de, sağlam pankreas adacıkları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, çoklu hücre işleme adımları ve ilaç preparatları nedeniyle mücadele edecektir.Bu yöntem için ilk olarak, dopaminerjik ilaçların insülin sekresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için hızlı bir test yapmak istediğimizde aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü hücrelerin hassas doğası ve deneyler arasındaki testin tutarlılığını sağlamak için hassasiyetin önemi nedeniyle hücre işleme adımlarının öğrenilmesi zordur. İlk olarak, INS-1E hücrelerini metin protokolünde belirtildiği gibi büyütün.Hücreler istenen birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin. Hücreleri beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere 0,5 mililitre% 025 tripsin ekleyin, ardından hücreleri 37 santigrat derecede üç ila dört dakika inkübatörde bırakın.Dokuz mililitre tam ortam ekleyerek tripsini devre dışı bırakın. Daha sonra, hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra bir pelet oluşturmak için hücreleri santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, peleti beş mililitre taze ortamda çözün. Tüpten 10 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş hücreyi pipetleyin ve canlılığı değerlendirmek için 10 mikrolitre tripan mavisi hayati boya ile karıştırın. Ardından, canlı ve ölü hücrelerin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın ve hücrelerin %90'ının canlı olduğundan emin olun.Saydıktan sonra, taze RPMI 1640 ortamında mililitre başına bir milyon hücre ekleyin, daha sonra poli-L-lizin kaplı 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0.5 mililitre 500.000 INS-1E hücresi tohumlayın. Plakayı bir gün boyunca inkübatörde bırakın. Ertesi gün, ortamı çıkarın ve kuyucukların her birine 500 mikrolitre taze RPMI 1640 ortamı ekleyin.Hücrelerin kuyu yüzeylerine yayılması için plakayı 24 saat daha inkübe edin. Tahlili gerçekleştirmek için önce KRB tamponunu hazırlayın, ardından ortamı her bir kuyucuktan aspire edin ve önceden ısıtılmış fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa sığır serum albümini ile desteklenmiş, ancak glikoz içermeyen 450 mikrolitre KRB tamponu ekleyin.Kültür plakasını bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bırakın. 10X nihai konsantrasyon 200 milimolar glikoz ile desteklenmiş KRB tamponunda ilaçların seri seyreltmelerini hazırlayın. Glikoz açlığı adımından sonra, karşılık gelen oyukların her birine 50 mikrolitre seri olarak seyreltilmiş ilaç pipetleyin.Glikoz stimülasyonu için, ilgili seri olarak seyreltilmiş ilaçları 20 milimolar glikoz varlığında ekleyin. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Stimülasyon bittiğinde, süpernatanları toplayın ve bunları etiketli 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.Toplanan her süpernatantın 10 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Bir ila 10 seyreltme oranı elde etmek için her kuyucuğa 90 mikrolitre KRB ekleyin. Homojenliği sağlamak için seyreltmeleri karıştırın.Ardından, HTRF insülin testi için insülin standart eğrisini elde edin. Daha sonra, standart insülin örneklerinin her birine 10 mikrolitre ve seyreltilmiş tahlil süpernatantlarını 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Tespit tamponunda bir oranı kabul etmek için antikor karışımını bir ila iki donörde hazırlayın.Antikor karışımını hazırladıktan sonra, 96 oyuklu bir plakadaki oyukların her birine 30 mikrolitre ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında inkübe edin. İki saatlik inkübasyondan sonra, plaka okuyucusunda antikor karışımı ile plakayı okuyun.Okuma için 665 ve 620 nanometrede uygun HTRF optik modülünü kullanın ve her kuyu için 200 flaş kullanın. İlk olarak, tahlil örneklerinden insülinin gerçek değerlerini tahmin etmek için bir insülin standart eğrisi çizilir. Standart eğri, elde edilen oransal floresan okumasının, önceden tanımlanmış standart insan insülin konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak önemli ölçüde arttığını göstermektedir.Daha sonra, INS-1E hücrelerinden bazal insülin sekresyon seviyesi, 20 milimolar glikozun varlığında veya yokluğunda incelenir. Grafikten, hücrelerin glikoz varlığında mililitre insülin başına yaklaşık 100 nanogram salgıladığını göstermektedir. İlginç bir şekilde, insülin seviyesi, glikoz yokluğunda mililitre başına yaklaşık 15 nanogramda neredeyse yarısıdır.Daha sonra, hücreler 20 milimolar glikoz ile artan dopamin konsantrasyonlarının varlığında inkübe edilir. Salgılanan insülin, her bir oyuktan maksimum insülin yüzdesinin ortalama değerine normalize edilir. Grafik, dopaminin GSIS'i inhibe ettiğini ve böylece GSIS'deki dopaminerjik reseptörlerin fonksiyonel önemini göstermektedir.Bu grafik, bir Tip 2 diyabet ilacı olan bromokripinin, GSIS'i indüklemede dopaminden daha güçlü olduğunu göstermektedir. Bu grafikler, artan quinpirol konsantrasyonu ile, bir D2 agonistinin, bromokriptinden daha az verimli olmasına rağmen, GSIS'i uyarmada dopamin gibi benzer bir güç gösterdiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa dört ila beş saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, dikkatli ve tutarlı bir şekilde pipetlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, aşağı akış sinyalizasyonu üzerindeki dopaminerjik ilaç etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için döngüsel AMP HDRF testi gibi diğer fonksiyonel testler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, metabolizma alanındaki araştırmacıların hem ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinde hem de pankreas adacıklarında diğer endokrin salgı yollarını keşfetmelerinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, HDRF kullanarak hücrelerden insülin salgısını nasıl doğru bir şekilde ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Bu video, bir test proteinine özgü antikorlar üzerinde etiketlenmiş donör ve alıcı floroforların yardımıyla endojen protein fosforilasyonunu belirlemek için zamana bağlı Förster rezonans enerji transferini veya TR-FRET testini açıklar. Bu teknik, hücre lizatlarındaki test proteinlerinin fosforilasyonunu ölçmek için tasarlanmıştır.

Hücrelerde protein fosforilasyonunun izlenmesi için zamana bağlı Forster rezonans enerji transferi

Bu video, insan serumundaki adacık otoantikorlarının elektrokemilüminesans tespitini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, rutenyum konjuge antijeni biyotinile yakalama antijenine köprü kurarak elektrokemilüminesans ölçümleri ile tespit edilen kompleksler oluşturur.

Elektrokemilüminesans Testi Kullanılarak İnsan Adacığı Otoantikorlarının Tespiti

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.

İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Burada, canlı HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonu ve fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme, kanser hücrelerinde insülin sinyal yolları ve metabolik düzenleme hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir araçtır.

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

Öğrenin, pankreatik beta hücrelerinde HTRF tekniği kullanarak insülin salgılanmasını hızlı ve doğru bir şekilde ölçme yöntemini. Bu yaklaşım, diyabet araştırmalarında glukoz uyarılı salgılanma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Daha fazla video keşfet