Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar
May 11th, 2018
Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.
Bu protokolün genel amacı, fare embriyoları üzerinde ışık tabakası mikroskobu ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak motor nöron akson arborizasyon paternlerinin kalitatif ve kantitatif değerlendirmesine izin vermektir. Bu yöntem, karmaşık hareketle koordineli olarak motor nöron gelişimini anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, motor nöronların akson arborizasyon modellerini çeşitli açılardan gözlemleyebilmeniz ve görüntüleyebilmeniz ve her bir siniri kantitatif olarak analiz edebilmenizdir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi olan Ya-Ping Yen ve Ee Shan Liau olacak. Bu işleme başlamak için, embriyoları 24 oyuklu bir plakaya, gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede oyuk başına PBS'de bir mililitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Ertesi gün, sabit embriyoları en az üç kez, her biri beş ila 10 dakika boyunca, bir mililitre 1X PBS ile yıkayın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, her bir embriyoyu bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca bir mililitre% 0.5 PBST'de geçirgenleştirin. Her numuneyi, bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 santigrat derecede 1X PBS'de hazırlanan bir mililitre %10 FBS ile bloke edin. Daha sonra, her embriyoyu bir mililitre anti-GFP primer antikoru ile 4 santigrat derecede 72 saat boyunca sürekli çalkalama ile inkübe edin.
Birincil antikor inkübasyonundan sonra, her embriyoyu bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki gün boyunca bir mililitre% 0.5 PBST ile yıkayın. Daha sonra, bir mililitre ikincil antikor uygulayın ve gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede sürekli çalkalama ile inkübe edin. Ertesi gün, her embriyoyu iki ila üç gün boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede en az üç kez bir mililitre% 0.5 PBST ile yıkayın.
Daha sonra, her bir embriyoyu, gece boyunca oda sıcaklığında ışıktan korunan 1.5 mililitrelik bir tüpte kırılma indisi 1.49 nd olan ticari bir temizleme reaktifinde inkübe edin. 5X/0.1 aydınlatma optiği ve 5X/0.16 algılama optiği ayarlayın. Numune tutucuyu ve numune kılcalını monte edin.
Numune haznesini temizleme solüsyonu ile doldurarak hazırlayın. Embriyoyu monte etmek için, üst kısmı kılcal damarın çapına uyacak şekilde keserek bir P200 pipet ucu hazırlayın ve numune eki için sivri kısmı çıkarın. Ardından, pipet ucunun körelmiş ucunu küçük bir alev kullanarak eritin.
Alevi söndürün ve embriyoyu erimiş uca dikey olarak hızlı bir şekilde tutturun. Pipet ucunun üst kısmını numune kılcal damarı ile takın ve hazırlanan numune haznesini mikroskoba koyun. Görüntüleme yazılımını kullanarak, Locate (Bul) sekmesi altında Locate Capillary (Kılcal Damarları Bul) öğesini seçin ve X, Y ve Z eksenlerini ayarlayın.
Ardından, Örneği Bul'u seçin ve embriyoya odaklanmak için 0,6X'e yakınlaştırın. Herhangi bir kalıntı veya kabarcıkları temizlemek için oda tamponunun bir süre embriyo ile dengelenmesine izin verin. Edinme sekmesi altında görüntü alımı için Dedektif Hedefleri, Lazer Engelleme Filtresi, Işın Ayırıcı, Kameralar ve Lazerler gibi ışık yolu parametrelerini tanımlayın.
Gölge azaltma için Pivot Taraması onay kutusunu işaretleyin. Ardından, 16 bit'e Bit Bepth, 0,36 ile 0,7X aralığına Zoom, tek site aydınlatması veya çift site aydınlatması gibi alım ayarlarını tanımlayın. Sürekli'ye tıklayın ve Lazer Yoğunluğu, Maruz Kalma Süresi, Lazer Gücü ve Işık Sayfası Konumunu ayarlayın.
Ardından, görüntü alımını sonlandırmak için Durdur'a basın. Şeffaf numunenin, tek tek motor sinirler üzerindeki ince ağaçlandırılmış yapıların görüntülerinin ayrıntılı olarak elde edilmesini sağlamak için en kısa ışık yolu içinde konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Çok boyutlu alım için, ilk ve son görüntü için z konumunu hareket ettirerek Z yığınını tanımlayın.
Dilim numarasını ayarlamak için En İyi'yi tıklatın. Ardından, seçili Z yığınını almak için Denemeyi Başlat'a tıklayın. Tamamlandığında, görüntüyü czi formatında kaydedin.
Akson arborizasyonunu ölçmek için, görüntü dosyasını görüntüleme analiz yazılımında açın. Yerel yoğunluk kontrastına dayalı olarak filamentleri algılamak için Ekran Ayarlama penceresini kullanarak görüntü rengini, parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Ardından, Yeni Filament Ekle simgesine tıklayın ve açılır menüden Otomatik Yol Algoritmasını seçin.
İlgilenilen bölgeyi seçin, ardından Dilim modu kullanılarak ölçülebilecek en büyük ve en ince çap ölçümlerini atayarak başlangıç ve tohum noktalarını tanımlayın. İlgilenilen bölgenin kenarına bir başlangıç noktası atayın. Başlangıç noktalarının el ile eklenmesini veya kaldırılmasını sağlamak için, önce işaretçi modunu değiştirin, seçimde gezinin ve ardından ilgi noktalarını kaydırıp sağ tıklayın.
Ardından, görünür ağaç iptalinin tümünün işaretlendiğinden emin olmak için tohum noktaları için manuel eşikleri seçin. Ardından, tohum noktalarını manuel olarak ekleyin veya kaldırın. Bağlantısı Kesilen Segmentleri Kaldır kutusunu işaretleyin ve başlangıç noktalarının etrafındaki tohum noktalarını kaldırın.
Ardından, arka plan çıkarma eşiğini ayarlayın ve işlemi tamamlayın. Doğru niceleme için arka plan artefaktlarını kaldırmak ve dedektör yolunun gerçek akson arborizasyonunu yansıttığını doğrulamak gerekir. Sonunda, istediğiniz stili ve rengi seçin.
İstatistikler sekmesi altında, Ayrıntılı'yı seçin ve motor akson arborizasyonunun bir göstergesi olarak motor sinir terminallerini ölçmek için filament sayısı, dendrit terminal noktalarını kullanın. Ardından, yeniden yapılandırılmış aksonun görüntüsünü bir tiff dosyası olarak dışa aktarın. LSFM, fare embriyolarında motor akson arborizasyonunun ayrıntılı 3D görselleştirmesini sağlar.
Motor nöronlar yukarıda tarif edilen protokole tabi tutulur ve transgenik olarak eksprese edilen GFP ile etiketlenir. Akson arborizasyonunu daha ayrıntılı olarak görüntülemek ve miktar tayini yapmak için büyütme, ince arborize edilmiş her yapının ortaya çıkabileceği şekilde ayarlanabilir. Son olarak, bireysel ön ayak sinirlerinin akson arborizasyon modeli, görüntü analiz yazılımı kullanılarak yeniden yapılandırılabilir.
Yazılımdaki otomatik yol algoritması, filamenti izler ve toplam akson terminali sayısını ölçer. Bu videoyu izledikten sonra, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanarak fare embriyolarının örneklerini nasıl hazırlayacağınızı ve motor nöron aksonlarını nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, MRS ile her bir motor sinirin arborizasyon modelini kantitatif olarak nasıl değerlendireceğinizi bileceksiniz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, transgenik Hb9::GFP fare embriyolarında motor nöron projeksiyonu ve akson ağacı görselleştirmek için bir protokol sunar. Işık tabakası floresan mikroskopi kullanarak, yöntem akson kalıplarının nitel ve nicel değerlendirilmesini sağlar ve motor nöron gelişiminin anlaşılmasında ilerleme kaydeder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nörogelişim
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Protokol, karmaşık hareketleri koordine etmek için hayati öneme sahip motor nöronlara odaklanır.
- Motor nöron akson ağacı, işlevsel sinir devreleri için kritik öneme sahiptir.
- Bu kalıpları anlamak, nörojenez süreçlerine dair içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Motor nöron akson ağacını görselleştirmek ve nicel analiz yapmak.
- Diğer nöron navigasyon süreçleri için uyarlanabilecek bir yöntem oluşturmak.
- Fare embriyolarında motor nöron gelişimi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Temel platform olarak ışık tabakası floresan mikroskopi kullanılmıştır.
- Hb9 promotörü altında GFP eksprese eden fare embriyoları biyolojik model olarak kullanılmıştır.
- Embriyolar, görüntülemeden önce immün boyama ve temizleme teknikleriyle hazırlanır.
- Kritik adımlar, numunelerin fiksasyonu, geçirgenleştirilmesi ve antikor inkübasyonunu içerir.
Ana Sonuçlar
- Bulgular, akson ağacının ince detaylarını 3D'de görselleştirme kabiliyetini doğrular.
- Niteliksel analiz, bireysel motor sinirlerin ağaçlanma kalıplarının değerlendirilmesini sağlar.
- Bu yöntem, karmaşık yapıları ortaya çıkarmak için büyütme ayarlamalarına izin verir.
Sonuçlar
- Çalışma, motor nöron gelişimini analiz etmek için sağlam bir protokol gösterir.
- Yöntem, nöron davranışına dair içgörüleri artırır ve diğer çalışmalarda potansiyel uygulamaya sahiptir.
- Bulgular, hareketin altında yatan sinir mekanizmalarının daha geniş anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
