Name: Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin motor nöron aks arborizasyonunu Hb9::GFP fare embriyolarında ışık levha floresan mikroskobu ile görselleştirme ve nicel analiz yöntemini. Bu protokol sinir gelişimini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LSFM deneyleri ve veri analizi kısmen enstrüman hizmet bölümü gelişmiş optik mikroskoplar kullanarak Academia Sinica ve Bayan Shu-Chen Shen yardımı ile yapıldı. Bayan Sue-Ping Lee Imaging Core tesis, IMB Imaris görüntü analizi ile önemli teknik destek için teşekkür ediyoruz. IMB'ın bilimsel İngilizce düzenleme Core el yazması inceledim. Bu eser Academia Sinica kariyer geliştirme Ödülü (CDA-107-L05), en (104-2311-B-001-030-MY3) ve NHRI (NHRI-EX106-10315NC) tarafından finanse edilmektedir.

Canlı hayvanların hepsi onaylanmış ve IACUC Academia Sinica tarafından denetlenecektir belirli patojen ücretsiz (SPF) hayvan tesisinde, tutuldu.
1. fiksasyon
<ol><li>Embriyo embriyonik gün 12.5 (E12.5) toplamak sonra başını kesmek ve onları alt.</li>
	<li>Embriyolar tek tek 24-şey levha ile 1 mL/taze hazırlanmış %4 paraformaldehyde fosfat tampon serum (PBS) x 1'in de gecede düzeltmek. Bir shaker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Sabit Embriyolardan en az 3 x, her biri için 5-10 dk, 1 mL 1 x PBS ile yıkama ve gecede 4 ° c üzerinde kalan paraformaldehyde kaldırmak için bir shaker kuluçkaya.</li>
</ol>2. bütün Dağı Immunostaining
<ol><li>Her embriyo % 0,5 1 ml permeabilize PBS-Triton-X-100 (PBST) bir gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde.</li>
	<li>Her örnek 1 mL 1 x PBS gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde FBS hazırlanan % 10 ile engelleyin.</li>
	<li>1 mL anti-GFP birincil antikor ile embriyo kuluçkaya (1:1, % 10 000 seyreltme FBS) 4 ° c sabit motor sinirler GFP sinyalinin yoğunlaştırmaya sallayarak ile 72 h için.</li>
	<li>Birincil antikor kuluçka sonra % 0,5 ile 1 mL yıkamak %0,5 değiştirme PBST bir shaker üzerinde 4 ° C'de 1-2 gün boyunca PBST en az üç kez.</li>
	<li>İkincil antikor 1 mL uygulamak (1:1, % 10 000 seyreltme FBS) ve gecede 4 ° C'de sabit sallayarak ile karanlıkta kuluçkaya.</li>
	<li>3 x 1 mL % 0,5 ile yıkayın bir shaker 2-3 gün boyunca üzerinde 4 ° C'de PBST. Örnekleri 1 x PBS 4 ° C'de görüntüleme önceki gün kadar devam et. Not: Takas, bağlı olarak bölüm embriyoların yansıması önce küçük parçalara embriyo disseke. Ön ayakları bu deneysel yaklaşım (şekil 1A) korunur.</li>
	<li>Bir ticari takas reaktif bir Kırılma indisi ışık oda sıcaklığında gecede, embriyo görüntüleme için şeffaf işlemek için korumalı bir 1,5 mL tüp 1,49 ND ile embriyo kuluçkaya. Not: Takas reaktif hacmi yaklaşık beş kez numune hacmi ki.</li>
</ol>3. LSFM (2-3 h)
<ol><li>
Örnek kurulum
	<ol>
<li>5 X / 0.1 ayarla aydınlatma optik ve 5 X / 0,16 algılama optik. Örnek sahibi ve örnek kılcal (1.5 mm iç çapı, yeşil) Montaj ve onları mikroskop yer. Not: ayrıntılı kurulum yordamları için mikroskop'ın işletim kılavuzuna bakın.</li>
		<li>Embriyo aşağıdaki gibi bağlayın:<ol>
<li>P200 pipet ucu kılcal damar çapını sığması uzakta üst kısmı keserek hazırlamak ve çıkarmak sivri bölüm (~ 3 mm) örnek ek için.</li>
			<li>Küçük bir alev kullanarak pipet ucu körelmenin sona eriyor.</li>
			<li>Alev söndürmek ve hızlı bir şekilde dikey olarak üzerine eritilmiş sonunda embriyo ekleyebilirsiniz.</li>
			<li>Örnek kapiller pipet ucuyla üst kısmındaki uygun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enkaz veya baloncuklar temizlemek 1 dk için embriyo ile equilibrate odası arabellek izin.</li>
		<li>Görüntüleme yazılımı kullanarak, yerleştirme kapiller bulun sekmesi altında seçmek ve ayarlamak x, y, z eksenleri boyunca örnek kılcal konumlandırmak için.</li>
		<li>Yerleştirme örnek seçin ve embriyo üzerinde odaklanmak için 0,6 X yakınlaştırma. Görüntülü bacak uzun ekseninin iki ışık kaynağı (şekil 1B) ışık yolu ile hizalandığından emin olun embriyo döndürün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resim alma
	<ol>
<li>Satın alma sekmesinin altındaki algılama hedefleri gibi ışık yolunu parametreleri tanımlamak, engelleme filtresi, ışın bölücü, fotoğraf makinesi ve lazer lazer. Not: Bu deneyde GFP kanal kullanılır (uyarma dalga boyu: 488 nm; emisyon filtresi: BP 505-545 nm, ışın splitter: SPS LP 560).</li>
		<li>Gölge azaltılması için Özet inceden inceye gözden geçirmek onay kutusunu işaretleyin.</li>
		<li>Satın alma ayarlarını tanımlayın: bit derinliği, 16 bit; Büyütme, 0,36-0,7 X; tek taraflı aydınlatma (sol/sağ) veya çift tarafı aydınlatma.</li>
		<li>Sürekli ' yi tıklatın ve lazer yoğunluğu, pozlama süresi, lazer güç ve hafif levha pozisyon daha net görüntüler elde etmek için ayarlayın. Not: Lazer güç duyarlilik en aza indirmek mümkün olduğunca düşük tutulur.</li>
		<li>Resim alma bitirmek için Dur tuşuna basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çok boyutlu edinme
	<ol>
<li>Z-yığın Z pozisyon için ilk ve son görüntü hareket ettirerek tanımlayın. Dilim numarasını ayarlamak için Optimal ' ı tıklatın.</li>
		<li>Seçili z-yığın kazanmak için Deneme başlatmak'ı tıklatın.</li>
		<li>Bittiğinde, resmi .czi biçiminde kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görüntü işleme (isteğe bağlı)
	<ol>
<li>Çift tarafı aydınlatma uygulanırsa çift yan füzyon ile Lightsheet işleme kanal altında devam edin. MultiView işleme birden çok açılardan görüntüleri birleştirmek için çoklu gösterim aldıysanız gereklidir.</li>
		<li>Bir 2B görüntü En fazla yoğunluk projeksiyon kanalın altında projeksiyon eksen boyunca yüksek yoğunluğu piksel verilerini kullanarak oluşturun.</li>
		<li>Kopya kanal altında görüntüleri alt kümelerine özgün kümesinden seçmek için alt küme küme küme ' ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. miktar Axon Arborization (tek tek her sinir için 30 dk)
<ol><li>Görüntü dosyasını görüntüleme analizi yazılımı açın (varsayılan olarak, görüntü XYZ veri içeren Surpass modunda ve 3D render görünümü olarak açılır).</li>
	<li>Görüntü renk, parlaklık, ayarlamak ve Ekran ayarlaması penceresi kullanarak kontrast (Edit | Ekran ayarlama göstermek) yerel yoğunluğu Karşıtlık'dayalı filamentler algılamak için.</li>
	<li>Eklemek yeni filamentler simgesine tıklayın ve açılan menüde Autopath (döngü) algoritma seçin.</li>
	<li>Faiz (Bu durumda, ilgi segmenting akson) seçin. Bittiğinde İleri ' yi tıklatın.</li>
	<li>Başlangıç ve tohum Puan dilim modunu kullanarak ölçülen en büyük ve en ince çapı ölçümleri atayarak tanımlayın.</li>
	<li>İlgi alanının kenarında bir başlangıç noktası atayın. El ile ekleme ya da kaldırma başlangıç noktası, elde etmek için ilk işaretçi modunu değiştirmek (Kayıt bul | SELECT) ve ardından üst karakter + sağ tıklatın olarak ilgi noktaları.</li>
	<li>Tüm görünür arborization işaretlenmiş emin olmak tohum puan için el ile eşikler seçin. İşaretçi modunu değiştirmek (Kayıt bul | SELECT) ve tohum noktaları el ile ekleyip sonra Shift + sol tıklayın olarak ilgi noktaları. Not: Arka plandaki gürültüleri ve sinyalleri komşu sinirler el ile kaldırmak önemlidir.</li>
	<li>Başlangıç noktası etrafında tohum noktalarını kaldırmakkutuyu işaretleyin.</li>
	<li>Bu çok uzakta olmaları ve bu arka plan gürültü temsil edebilir Puan hariç tutulmasına izin için Kaldır bağlantısı kesilmiş parçaları kontrol edin. Dışlama için üst sınırı tanımlamak için Gap uzunluğu en fazla sırada gösterir.</li>
	<li>Her Voksel arka plan yoğunluğunu tahmin etmek için bir Gauss filtre kullanan arka plan çıkarma için eşik ayarlayın.</li>
	<li>Dendrite çapı yaklaşık kesit alanı algoritmasıyla için Otomatik eşik ayarlayın.</li>
	<li>Omurga hesaplaması için adımları atlayın.</li>
	<li>İşlemi tamamlamak ve istenen stilini ve rengini seçin.</li>
	<li>Sadece yeniden oluşturulan aksonlar görüntülemek için Özellikler birim kutusunda onay kutusunu temizleyin.</li>
	<li>Detaylı İstatistikler sekmesinde seçin. Tel No kullanmak Dendrite Terminal Puan motor sinir terminallerine motor axon arborization bir göstergesi olarak ölçmek için. Not:-Ebilmek var olmak mülhak istatistiksel ek açıklama isterseniz.</li>
	<li>Yeniden oluşturulan axon görüntüsünü bir .tif dosyası olarak verin.</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
<li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).</li>
<li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A%3AEphA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li>
<li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li>
<li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+%28DINE%29+during+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li>
<li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li>
<li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret%2FGfralpha+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li>
<li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li>
<li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li>
<li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685(2017).</li>
<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İletişim kuralı birkaç adımda belirli koşullar altında değişikliklere tabi olabilir. Örneğin, fiksasyon süresi 2 h paraformaldehyde taze yapılmış kullanarak 1 veya daha fazla gün için değişen embriyo yaşın üzerinde bağlıdır. Fiksasyon için protein crosslinking, hassas antikorlar için bütün Dağı immunostaining önce yürütülen metanol alternatif bir sabitleştirici ajan olarak kullanılabilir. Boyama üzerine bir yüksek sinyal gürültü oranı için deterjan toplama en iyi duruma getirmek gereklidir (0,1-0,5 arasında %). Ek yıkama...

Omurilik MNs merkezi sinir sisteminin parçası olan ancak hareketini denetlemek için periferik kasları innervate. Gelişmekte olan omurilik içinde MN ataları (pMNs) notochord ve bitişik somites yayılan sinyaller göre kurulur. Tüm sonrası Mitotik MNs ayrıştırılan sonra pMNs, sonunda bir dizi omurilik1,2rostrocaudal ekseni boyunca MN türlerinden sebebiyet veren oluşturulur. Omurilik MNs arazi ve anatomik olarak de düzenlenmektedir. Morfolojik düzenleri onların anılan sıraya göre hedef konumunu çevre3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kas hedeflerine ulaştıktan sonra akson genişletmek ve şube için onları teşvik hücresel ve eksojen Nörotrofik faktör almak kas içine daha fazla. İnnervasyon ve dallanma kusurları nöromüsküler kavşak (NMJ) oluşturmak için başarısızlık için katkıda bulunabilir. Örneğin, gliyal kaynaklı Nörotrofik faktörler (GDNF)-indüklenen Pea3 axon arborization Kutanöz maximus (CM) içine için vazgeçilmez ve latissimus dorsi (LD) kas4,5. Buna ek olarak, DINE nakavt fare embriyo solunum yetmezliği ve ölüm hemen doğum6,7sonra neden diyafram, frenik sinir arızalı arborization gösterir. Bu nedenle, bu son adım MN olgunlaşma (Yani, aksonlar projeksiyon ve dallanma) nöronlar ve hedef hücreler arasındaki iletişimi sağlamak için önemlidir.
Arborization desenleri görüntülemek için araştırmacılar normalde confocal görüntüleme veya İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu kesitli veya bütün-bağlama örnekleri8,9,10kuralları. Bu mikroskobu tekniklerin her ikisi de kabul edilebilir çözünürlük ve derinlik penetrasyonu oluşturmak. İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu, iki alt-enerji fotonlar11eşzamanlı absorpsiyonu ile fluorophores uyarma içerir. İki fotonlu uyarma yakın kızılötesi radyasyon kullandığından, azalan uyarma sıklığını azaltılmış saçılma ve daha iyi doku penetrasyonu 1 mm doku, böylece daha büyük derinlik ile görüntülemede izin katkıda bulunur. Confocal mikroskobu odak out ve sinyalleri sadece odak düzlemi12içinde ışık toplar filtreleri kaldırır. Bu yaklaşım ile örnekleri farklı odak uçak görüntülerini bir Z-yığın fonksiyonu üzerinden üç boyutlu (3D) görüntü üretmek için kombine edilebilir. Yine de, sinyal şiddeti ışık çoğunu engellenir ve yüksek sayısal açıklık alan derinliği belirsiz olarak azalır. Daha da önemlisi, herhangi bir anda yalnızca bir uçak bile görüntüsü aydınlatma bütün numune alır bu yana her iki tekniğin de şiddetli duyarlilik ve fototoksisite katkı.
Bu eksikliklerini aşmak için LSFM hızlı, ışık verimli olmanın avantajı ile tercih edilen bir alternatif ve daha az Fototoksik13,14haline gelmiştir. Ayrıca, LSFM çok görünüm görüntüleme sağlar. Bu yaklaşım Özellikle onlar 3D uzayda yaymak gibi motor aksonlar ve dispersiyon onların terminalleri görüntülenmesi için uygundur. Örnekleri x, y ve z eksenleri boyunca hareketler ve bir dikey ekseni çevresinde döndürme sağlar bir sahnede monte edilir çünkü LSFM diğer iki seçenek daha iyi performans. İkisi de montaj örnekleri düz bir slaytta gerektiren bu kurulum sadece örnek en az engellenen bir görünümünü aynı zamanda bir arzu edilen aydınlatma yol, İki fotonlu ve confocal mikroskobu, bir eksiklik seçimi sağlar. Bu nedenle, LSFM en uygun miktar motor sinir Terminal içinde fare embriyo ve akson arborization 3D görüntüleme için bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>Hb9::GFP</td><td>Jackson laboratuvar</td><td>005029</td><td>Embriyonik gün 12.5 (E12.5)</td></tr><tr><td>%4 Paraformaldehit (PFA)</td><td></td><td></td> <td>embriyolarını toplayın200ml için: ddH2O'da 20ml 10X PBS, 8g PFA ekleyin. NaOH (10N) ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Filtre, sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>1L için: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 ekleyin ve ddH2O ile doldurun. Otoklavlayın ve RT'de saklayın.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Koyun poliklonal anti-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-koyun</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 temizleme reaktifi</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml mikro tüp</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyu plakası</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA Cımbız</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas striaght keskin/keskin</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrocerrahi Neşterleri, tek kullanımlık</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.0 görüntü analiz yazılımı</td><td>Bitplane, Zürih, İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP fareleri)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

görselleştirme motor axon navigasyon ve hafif levha floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo axon arborization miktar

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Omurilik motor nöronlar (MNs) böylece hareket ve karmaşık görevleri omurgalılarda kontrol innervating hedefleri, iletişim kurmak için onların aksonlar genişletir. Böylece, akson gidin, arborize ve periferik onların kas innervate motor geliştirme ve dejenerasyon sırasında nasıl hedefler moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir. Transgenik Hb9::GFP fare hatları uzun motor axon yörüngeleri embriyonik gelişim sırasında görselleştirmek için hizmet etmiş olsa da, terminal akson arborization tam spektrum ayrıntılı açıklamaları desen karmaşıklığı nedeniyle eksik kalır ve sınırlamalar geçerli optik mikroskobu. Burada, hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM) ve nitelik ve nicelik motor aksonlar geliştirme görselleştirmek için sağlam görüntü analizi bir araya getiren gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Bu sistem kolayca genetik mutantlar veya MN hastalık modelleri motor axon gezinti ve arborization yol açan yeni moleküler mekanizmalar açığa Hb9::GFP çizgilerle geçmek için kabul edilebilir.

LSFM embriyo MN yörünge ve akson arborization Mouse ayrıntılı 3D görselleştirme sağlar. Parlak alan altında doku ticari takas reaktif batırılır sonra tamamen şeffaf görünür. Hiçbir büzülme veya örnek şişmesi reaktif görüntüleme önce takas depolama bir hafta kadar sonra fark edildi. Floresans kanal altında motor nöronlar transgenically ifade GFP (film 1) ile etiketlenir. Bazı örnek ayrıntıları axon yapısının bozulması. Örneğin, Şekil 2 düşük k...

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Bu protokolün genel amacı, fare embriyoları üzerinde ışık tabakası mikroskobu ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak motor nöron akson arborizasyon paternlerinin kalitatif ve kantitatif değerlendirmesine izin vermektir. Bu yöntem, karmaşık hareketle koordineli olarak motor nöron gelişimini anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, motor nöronların akson arborizasyon modellerini çeşitli açılardan gözlemleyebilmeniz ve görüntüleyebilmeniz ve her bir siniri kantitatif olarak analiz edebilmenizdir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi olan Ya-Ping Yen ve Ee Shan Liau olacak. Bu işleme başlamak için, embriyoları 24 oyuklu bir plakaya, gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede oyuk başına PBS'de bir mililitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Ertesi gün, sabit embriyoları en az üç kez, her biri beş ila 10 dakika boyunca, bir mililitre 1X PBS ile yıkayın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra, her bir embriyoyu bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca bir mililitre% 0.5 PBST'de geçirgenleştirin. Her numuneyi, bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 santigrat dereced

visualization-motor-axon-navigation-quantification-axon-arborization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Bu video, bir mikroakışkan oda sistemi kullanarak motor nöronlarda aksonal taşımayı izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Aksonal büyümeyi indüklemek için fare embriyonik omurilik dokularının polimer kaplı kuyucuklarda besleyici ortamla kültürlenmesini içerir. Floresan boya lekeli organellerin canlı görüntülemedeki hareketi, çift yönlü aksonal taşımayı doğrular.

Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanarak Motor Nöronlarda Organellerin Aksonal Taşınımının İzlenmesi

Source: Liau, E. S. et al. Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Embriyolarında Motor Akson Navigasyonunun Görselleştirilmesi ve Akson Arborizasyonunun Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Exp. (2018). Bu video, motor nöron projeksiyonlarını ve akson dallanmasını görüntülemek için ışık tabakası floresan mikroskobunun kullanımını göstermektedir. transgenik fare embriyoları. Motor nöron büyümesini ve bağlantısını değerlendirmek için numune hazırlama, görüntüleme ve aksonal dallanmanın...

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Motor Nöron Projeksiyonlarının ve Akson Dallanmasının Görselleştirilmesi

Kaynak: Boyer, N. P. et. al., Eksize Fare Tibial Sinirinde Nörofilament Taşınmasının Görüntülenmesi ve Analizi. J. Vis. Uzm.  (2020) Bu video, analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemini göstermektedir. periferik sinirlerin miyelinli aksonlarında nörofilament taşınımı. Teknik, fotoaktif yeşil florofor etiketli nörofilamentleri izleyerek, nörodejeneratif hastalıklarda aksonal taşıma hakkında bilgi sağlar.

Miyelinli Fare Aksonlarında Nörofilament Taşınmasının Floresan Fotoaktivasyon Görüntülemesi 

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin motor nöron aks arborizasyonunu Hb9::GFP fare embriyolarında ışık levha floresan mikroskobu ile görselleştirme ve nicel analiz yöntemini. Bu protokol sinir gelişimini anlamaya yardımcı olur.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Daha fazla video keşfet