Transkripsiyon faktörü Olig2 genomik bağlayıcı siteleri içinde akut tanımlayan PDGFRα + hücreleri tarafından analiz sıralama düşük hücreli Kromatin Immunoprecipitation saf

Bu deneyin genel amacı, immünopanning, düşük hücreli kromatin immünopresipitasyonu, yüksek verimli dizileme ve biyoinformatik veri analizi gerçekleştirerek akut saflaştırılmış beyin oligodendrosit öncü hücrelerinde oligodendrosit transkripsiyon faktörü iki'nin genom çapında bağlanmasını analiz etmektir. Bu yöntem, hücre farklılaşması ve gelişiminde önemli rol oynayan genom çapında transkripsiyonel düzenleme ve epigenetik mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır. Bu tekniğin ana avantajı, in vitro proliferasyon olmaksızın akut olarak saflaştırılmış birincil hücreler de dahil olmak üzere, sınırlı sayıda herhangi bir hücre tipine sahip diğer transkripsiyon faktörlerinin ChIP-seq'inde geniş çapta uygulanabilir olmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Yanan You olacak. Bu makalenin ortak yazarıdır. PDGFR-alfa-pozitif hücreleri seçmek için, immünopanning için bir plaka hazırlayın.

Endotel hücreleri ve mikroglia tükenmesi için iki plaka daha hazırlayın. Ardından, 10 santimetrelik bir Petri kabını 30 mikrolitre keçi anti-sıçan immünoglobulini ile kaplayın. Ardından, plakanın tüm yüzeyinin kaplama çözeltisi ile eşit şekilde kaplandığından emin olmak için plakayı çalkalayın.

Petri kabını gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Daha sonra, 40 mikrolitre sıçan anti-PDGFR-alfa antikorunu,% 0.2 sığır serum albümini içeren 12 mililitre DPBS ile seyreltin. Daha sonra, immünoglobulin G kaplı plakayı art arda üç kez 10 mililitre 1X DPBS ile yıkayın.

Daha sonra, immünoglobulin G kaplı plakayı PDGFR-alfa antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında dört saat inkübe edin. Dört saat sonra, sıçan anti-PDGFR-alfa antikor kaplı plakayı üç kez yıkamak için plakanın yan duvarı boyunca dikkatlice DPBS ekleyin. Plakanın kaplanmış yüzeyini rahatsız etmeyin.

Daha sonra, iki saat boyunca iki adet 15 santimetrelik Petri plakasını kaplamak için mililitre BSL-1 başına 2.3 mikrogram ile 20 mililitre DPBS kullanın. İnkübasyondan sonra, BSL-1 plakasını üç kez yıkamak için plakanın yan duvarı boyunca dikkatlice 20 mililitre DPBS ekleyin. Kaplanmış yüzeyi rahatsız etmeyin.

Yıkadıktan sonra, tek hücreli süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, hücre peletine 15 mililitre immünopanning tamponu ekleyin. Daha sonra, iki fare beyninden gelen tek hücreli süspansiyonları iki BSL-1 kaplı Petri kabı üzerinde sırayla inkübe edin.

Daha sonra plakaları oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. İnkübasyon sırasında plakayı her beş dakikada bir çalkalayın. Ardından, hücre süspansiyonundan tüm yapışmayan hücreleri toplamak için plakayı hafifçe döndürün.

Daha sonra, hücreleri sıçan PDGFR-alfa antikor kaplı plaka üzerine tohumlayın. Plakayı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. 45 dakikanın sonunda plakayı tekrar döndürün.

Ardından, hücre süspansiyonunu atın. Daha sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için plakayı DPBS ile sekiz kez durulayın. Plakayı mikroskop altında inceleyin.

Daha sonra, sıçan PDGFR-alfa antikoru kaplı plaka üzerine hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Ardından, plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bu arada, yapışık hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın ve mikroskop altında inceleyin.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 300 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bir mililitre OPC hücre kültürü ortamı ile yeniden süspanse edin. Ardından, bir hemositometrede tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücreleri sayın.

Bir hemositometrede saydıktan sonra, ChIP reaksiyonu için bir mililitre OPC hücre kültürü ortamına 20.000 saflaştırılmış OPC ekleyin. Ardından, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 27 mikrolitre% 36,5 formaldehit ekleyin. Bu hücreleri düzeltir.

10 dakika sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca sabit hücrelere 50 mikrolitre 2.5 molar glisin ekleyin. Glisin eklemek, DNA-protein çapraz bağlanmasını durduracaktır. Daha sonra, çapraz bağlı hücreleri proteaz inhibitörü kokteyli ile bir mililitre HBSS tamponu ile yıkayın.

Daha sonra, hücreleri önceden soğutulmuş bir santrifüj makinesinde dört santigrat derecede 300 kez g santrifüjleyin. Saflaştırılmış OPC'lerin çapraz bağlanmasından sonra, çapraz bağlı hücreler buz gibi soğuk HBSS çözeltisi kullanılarak yıkanmalı ve kalan ChIP adımları dört derecede gerçekleştirilmelidir, aksi takdirde antikor genomik DNA'yı düzgün bir şekilde çökeltemez. Daha sonra, hücre peletine 25 mikrolitre tam lizis tamponu ekleyin ve beş dakika buz üzerinde bırakın.

Ardından, proteaz inhibitörü kokteyli ile 75 mikrolitre buz gibi HBSS tamponunu pipetleyin. Daha sonra, hücre lizatının kromatinini, 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı program olmak üzere beş döngü ile önceden soğutulmuş bir sonikasyon sisteminde kesin. Kromatin kesildikten sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 14.000 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemenin sonunda süpernatanı toplayın. Daha sonra, 100 mikrolitre kesilmiş kromatini, proteaz inhibitörü ile eşit hacimde buz gibi soğuk ChIP tamponu ile seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş kesilmiş kromatinin 180 mikrolitresine bir mikrolitre tavşan anti-Olig2 antikoru ekleyin.

Tüpleri dönen bir tekerlek üzerinde dakikada 40 devirde dört santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Daha sonra, soğuk bir odada ChIP reaksiyon tüpüne 10 mikrolitre önceden yıkanmış protein A kaplı boncuklar ekleyin. Yine, ChIP tüplerini dönen tekerlek üzerinde iki saat daha dört santigrat derecede inkübe edin.

İki saat sonra, ChIP reaksiyon tüpünü bir dakika manyetik rafta bırakın. Ardından, boncuk peletini 100 mikrolitre dört yıkama tamponu ile her biri dört dakika boyunca dört santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde yıkayın. Sonra, boncuk peletine 200 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin.

Reaksiyon tüpünü dört saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Çift sarmallı DNA denatüre edildikten sonra, karides alkalin fosfataz ekleyerek tek sarmallı DNA'nın üç asal ucunu defosforile edin. Daha sonra, terminal deoksinükleotidil transferaz kullanarak tek sarmallı DNA'ya poli-T kuyruğu ekleyin.

Ardından, DNA poli-dA primerini tek sarmallı DNA şablonuna tavlayın. Ardından, indeksleme için ileri ve geri primerleri kullanarak ChIP dizisi kitaplığını yükseltin. Kütüphane hazırlığı için PCR döngülerinin sayısı, başlangıç DNA'sının miktarına bağlıdır.

İyi bir kütüphane hazırlığı, girdi DNA miktarının doğru bir şekilde ölçülmesini gerektirir. Çok fazla veya çok az PCR döngüsü, kütüphane konsantrasyonunu ve karmaşıklığı etkileyerek PCR artefaktlarına yol açabilir. PCR ile güçlendirilmiş ChIP dizisi kitaplığından 250 ila 500 baz çifti arasında değişen parçaları seçmek için paramanyetik boncuklar kullanın.

Seçilen ChIP dizisi kütüphanesinin kalitesini incelemek için bir mikroakışkan çip kılcal elektroforez cihazı kullanın. İmmünopanlı OPC'lerin saflığını değerlendirmek için immün boyama çalışmaları yapılır. OPC soy markörü NG2 antikoru kullanıldığında, PDGFR-alfa antikoru immünopanlı hücrelerin çoğunun NG2 pozitif olduğunu gösterir.

Daha sonra, PDGFR-alfa'nın zenginleştirilmesini doğrulamak için kantitatif PCR yapılır. Elde edilen grafik, ayrışmış beyin hücrelerine kıyasla PDGFR-alfa'nın önemli ölçüde zenginleştiğini gösteren bir nöronal belirteç olan Tuj1'in çok az ekspresyonunu göstermektedir. GFAP, Mog ve Mbp gibi diğer tüm belirteçler için çok az ekspresyon gösteren benzer sonuçlar elde edilir ve bu da PDGFR-alfa'nın zenginleştiğini gösterir.

Ardından, ChIP dizi kitaplığının kalitesi analiz edilir. Elektroferogram, kütüphane PCR ürününün boyut seçiminden sonra 250 ila 500 baz çifti arasında değişen Olig2 transkripsiyon faktörü için net bir zirveyi temsil eder. Burada histogram, yoğun aramadan önce elde edilen kalite kontrol metriklerini doğrulamak için etiket klonalitesini gösterir.

Çubuk, okumaların %90'ından fazlasının yalnızca bir genomik konumla eşlendiğini gösterir. Daha sonra, baskın parça uzunluğuna karşılık gelen zenginleştirilmiş bir tepeyi gösteren bir iplik korelasyon grafiği elde edilir. Çizimde, kırmızı çizgiler sırasıyla 50 baz çiftinde okuma uzunluğunu ve 130 baz çiftinde parça uzunluğunu temsil eder, böylece yüksek kaliteli verileri gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların birincil hücrelerde veya nadir hücrelerde transkripsiyon faktörlerinin ve diğer proteinlerin genom çapında DNA bağlanma bölgesini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fare beyninden immünopanning ile birincil OPC'lerin nasıl saflaştırılacağını ve düşük sayıda hücre kullanılarak ChIP-seq deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.