Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Bu yöntem, epilepsi tedavisi için nöromodülasyon alanında, hangi beyin bölgesinin ve stimülasyon protokolünün en uygun olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, kemirgen beyin dilimlerinin basitleştirilmiş, gerçekçi beyin devreleri modelini temsil etmesi, mikroelektrot dizilerinin ise bilinen elektrotlar arası mesafede çoklu gözlem noktasına izin vermesidir. MEA'yı hazırlamak için, elastomerik sızdırmazlık maddesini kayıt odasının alt yüzeyine eşit şekilde yayın ve kabarcık olmadığından emin olun.

Ardından, kayıt odasını cımbız yardımıyla MEA'ya monte edin ve hafif bir baskı uygulayın. Kayıt odasının dış kenarına bir sızdırmazlık tabakası yayın. Ardından, MEA/hazne tertibatını kapalı, nemli bir ortama yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında kürlenmesine izin verin.

Kayıt tezgahını hazırlamak için ılık banyoyu 32 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, tutma ACSF'yi tutma ve ön ısıtma odalarına dökün. Solüsyonları %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile köpürtün ve ters çevrilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak sıkışan baloncukları çıkarın.

Tutma odasını oda sıcaklığında tutun ve ön ısıtma odasını ılık banyoya yerleştirin. Yatay hipokampus-korteks beyin dilimlerini standart prosedürlere göre hazırlayın ve en az 60 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletme odasında iyileşmelerine izin verin. 4AP ACSF'yi bir kuluçka odasına dökün.

Ardından, %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile köpürtün ve ters çevrilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak sıkışan baloncukları çıkarın. Daha sonra, odayı örtün ve ılık banyoya aktarın. Ön ısıtma ACSF ve 4AP ACSF sıcaklıklarının 30 ila 32 santigrat derece olduğundan emin olun.

Bir beyin dilimini ön ısıtma odasına aktarmak için ters çevrilmiş bir cam Pasteur pipeti kullanın ve dokunun 25 ila 30 dakika dinlenmesine izin verin. Daha sonra beyin dilimini 4AP ACSF kuluçka odasına aktarın ve 60 dakika dinlendirin. 4AP ACSF'nin perfüzyon tüpünden içeride hava kalmayana kadar bir behere akmasına izin verin.

Ardından çözüm akışını durdurun. Kuru MEA çipini MEA'nın içine yerleştirin amplifier ve amplifikatör kafasını sabitleyin. Ardından, 4AP ACSF'yi kayıt odasının giriş ve çıkış haznesine aktarmak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın.

Isıtma kanülünü manyetik bir tutucuya sabitleyin ve ucunu kayıt odası giriş portunun içine yerleştirin. Ardından, manyetik tutucuyu MEA üzerindeki manyetik bir şeride takın. Perfüzyon tüpünü kanüle ve kanülü termostata bağlayın.

Daha sonra emme iğnesini çıkış haznesine yerleştirin. Emme iğnesini ACSF'ye daldırarak negatif basınç olduğunu doğrulayın ve sabit bir düşük frekanslı emme gürültüsü olup olmadığını kontrol edin. Ardından, akış regülatörünü dakikada bir mililitrelik bir akış hızına izin verecek şekilde ayarlayın ve perfüzlemeye başlayın.

4AP ACSF kanülden akmaya başladığında termostatı açın. Kayıt odasının içinde 32 ila 34 santigrat derece arasında bir sıcaklık elde etmek için ısıtma kanülünü 37 santigrat dereceye ve MEA tabanını 32 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, harici referans elektrodunu kayıt odası giriş haznesine yerleştirin.

4AP ACSF seviyesi ve kayıt sıcaklığı istendiği gibi stabilize edildikten sonra, perfüzyonu ve emme musluklarını geçici olarak durdurmak için kapalı konuma getirin. Ters çevrilmiş bir cam Pasteur pipeti kullanarak bir beyin dilimini hızlı bir şekilde MEA kayıt odasına aktarın. Ateşle parlatılmış, kıvrılmış bir Pasteur pipeti veya yumuşak, kompakt, küçük bir fırça kullanarak MEA kayıt alanındaki konumunu gerektiği gibi ayarlayın.

Tutma ankrajını beyin dilimine yerleştirin. Musluklarını tekrar açık konuma getirerek perfüzyonu ve emişi yeniden başlatın. Ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine monte edilmiş bir kamera kullanarak beyin diliminin bir resmini çekin.

Ardından, elektrotları eşlemek üzere GUI'yi başlatmak için bilgisayar yazılımında mapMEA komut dosyasını çalıştırın. Beyin diliminin resmini yüklemek için Araştır düğmesine tıklayın. Referans elektrodunun MEA'nın sol yarısının üst sütununda göründüğünden emin olun.

Ardından, İşaretçiyi Etkinleştir düğmesini tıklayın. Görüntü düzleştirme ve elektrot eşleme için XY koordinatlarını işaretlemek üzere dizinin en sol sütunundaki üst ve alt elektrotları seçin. Dilim türü açılır menüsünden Yatay'ı seçin.

Varsayılan Yapılar onay kutusunu işaretleyin. Beyin dilimi resminin altındaki numaralı butonları kullanarak, ROI'ye karşılık gelen elektrotları seçin ve bunları atamak için yapı panelindeki ilgili butonlara tıklayın. Her ROI için bu adımı tekrarlayın.

Daha sonra Kaydet düğmesine basın. Yazılım, seçilen elektrotları ve ROI'leri bildiren bir tablo içeren bir sonuç klasörü oluşturacaktır. Elektrofizyoloji çalışması için, kendi kendine kalibrasyon ve stabilizasyona izin vermek için stimülasyon protokolünden en az 10 dakika önce uyarı ünitesini açın.

Ardından, uyaran kontrol yazılımını başlatın ve uyarıcı ve MEA amplifikatörünün, uyaran kontrol yazılımının ana panelindeki yeşil bir LED ile gösterildiği gibi doğru şekilde bağlandığını doğrulayın. Stimülasyonu bipolar konfigürasyonda ayarlayın. Uyarı ünitesini toprağa bağlayın.

Ardından, CA1/proksimal subiculumun piramidal hücre tabakası ile temas halinde olan elektrot çiftlerini, komut dosyası mapMEA ile eşlenenler arasında birleştirin. Veri almak için, kayıt yazılımının ana panelindeki oynat düğmesine basın. En az dört iktal deşarj kaydedin.

Ardından, en iyi uyaran yoğunluğunu belirlemek için hızlı bir giriş/çıkış testi yapın. Bunu yapmak için, faz başına 100 mikrosaniye süreli kare bifazik pozitif-negatif akım darbesi tasarlamak için ana paneli kullanın. Darbe genliği sekmesinde, faz başına 100 mikroamperlik bir başlangıç darbe genliği girin.

Beş saniye veya daha uzun bir darbeler arası aralık ekleyerek stimülasyon darbesini 0,2 hertz veya daha düşük bir değere ayarlayın. Stimülasyon parahipokampal kortekslerde interiktal benzeri olayları güvenilir bir şekilde uyandırana kadar her denemede uyaran genliğini 50 ila 100 mikroamper adımla artırın. Limbik iktogenezin elektriksel modülasyonu için, ilgili stimülasyon protokolünü sağlamak için uyaran ünitesini programlayın ve giriş/çıkış testi sırasında tanımlanan uyaran genliğini kullanın.

Stimülasyon durduktan sonra, en az dört iktal deşarj kaydederek ağın uyaran öncesi duruma geri kazanıldığını doğrulayın. Bu şekil, kontrol koşulu sırasında, bir hertz'de periyodik pacing ve uyaranın geri çekilmesi üzerine iyileşme sırasında entorinal korteks ve perirhinal kortekste 4AP ile indüklenen iktal aktivitenin kayıtlarını göstermektedir. Bu grafik, bir hertz'de periyodik pacing'in etkisinin nicelleştirilmesini gösterir, bu da stimülasyon sırasında toplam nöbet süresinde önemli bir azalma olduğunu gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, beyin dilimini MEA'ya hızlı ve doğru bir şekilde yerleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nörotransmiterlerin veya iyon kanalının epileptiform aktiviteye katkısı ve nöromodülasyonun etkisi hakkında ek soruları yanıtlamak için farmakolojik manipülasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, kültürlenmiş nöronda ve beyin dilimlerinde sağlık ve hastalıkta nöronal ağ etkileşimini keşfetmesinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, MEA'lara bağlı kemirgen beyin dilimlerinde dört aminopiridin tarafından indüklenen epileptiform aktivitenin nasıl kaydedileceğini ve elektriksel olarak modüle edileceğini iyi anlamış olmalısınız.