İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı
11 Ağustos 2018
Burada, bir gösteri emme blister kutanöz geri çekme modeli sağlamak. Model insan vivo içinde edinilmiş bağışıklık yanıtı, örneğin aşı geliştirme bağlamında incelemek basit bir erişim sağlar.
Bu videonun genel amacı, in vivo olarak adaptif immün yanıtı temsil eden antijene özgü T hücrelerini ve sitokinleri hasat etmemizi sağlayan emme blister kutanöz geri çağırma yöntemini göstermektir. Bu yöntem, insanlarda hücresel tepkileri ve adaptif bağışıklığı incelemek için kullanılabilir. Bu teknolojinin ana avantajı, antijene özgü T hücrelerini nispeten invaziv olmayan ve güvenli bir yöntem kullanarak doğrudan bağışıklık reaksiyonu bölgesinden toplamamıza izin vermesidir.
Kutanöz hatırlamanın temel prensibi, antijeni cildin dermal tabakasına bırakmaktır. Antijenin mevcut immünolojik hafızasına sahip bireylerde, T hücreleri reaksiyon bölgesine göç edecek ve spesifik T hücrelerinin klonal olarak genişlediği ve yerinde farklılaştığı lokal bir bağışıklık tepkisini indükleyecektir. Bu reaksiyon üzerine emme kabarcıklarının indüksiyonu, bu spesifik T hücrelerinin yanı sıra in vivo olarak üretilen sitokinleri hasat etmemizi sağlar.
Bu video gösteriminde, geri çağırma antijeni olarak PPD kullanıyoruz. PPD, mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun tanısı için yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu videoda göreceğiniz gibi, daha önce BCG aşısı ile aşılanmış kişilerde de cilt reaksiyonlarına neden olur.
Tüberkülin deri testi için malzemeler arasında alkollü bezler, 27 ila 30 gauge kısa iğneli bir mililitrelik şırınga ve insan kullanımı için onaylanmış bir PPD çözeltisi bulunur. Mililitre başına 20 tüberkülin biriminden oluşan bir PPD çözeltisi kullanın. Şişeyi alkollü bir bez kullanarak dezenfekte edin.
Ve lütfen bileşimin üreticiler arasında değişebileceğini unutmayın. Daha sonra gönüllünün ön kolunun ventral tarafındaki enjeksiyon bölgesini bulun ve bölgeyi bir alkollü çubuk kullanarak dezenfekte edin. 29 gauge, 12 milimetre sabit iğne ile bir mililitre steril şırınga kullanın.
Yavaşça karıştırın ve 0.1 mililitre PPD çözeltisini aspire edin. Görünür kabarcıklar olmadığından emin olun. Cildi gerin ve iğneyi, eğim yukarı bakacak şekilde beş ila on beş derecelik bir açıyla doğrultun.
İğnenin ucunu cildin dermal tabakasına sokun ve ucun epidermisten neredeyse görünür olduğundan emin olun. Yavaşça 0.1 mililitre PPD çözeltisi enjekte edin. Doğru uygulanırsa, hemen altı ila on milimetrelik bir papül görünecektir.
Papül yaklaşık on dakika sonra kaybolur. PPD'nin birden fazla birikimi mümkündür, ancak ek etik onay gerektirebilir. İki enjeksiyon uygulanırsa, dirsek ve bilek bölgesinden iyi bir mesafede dururken maksimum ayrılmayı hedefleyin.
Klinik cilt reaksiyonu ilk 24 saat içinde ortaya çıkar ve buna kaşıntı hissi eşlik eder. Enjeksiyondan 48 ila 72 saat sonra cilt reaksiyonunun boyutunu ölçün. Yanıtı değerlendirirken, eritemi değil sertleşmeyi ölçmek önemlidir.
Parmağınızı kullanarak şapka şişmesini palpe edin. Ardından, bir tükenmez kalem kullanarak sertleşmenin kenarlarını işaretleyin. Son olarak, sertleşme çapını ölçmek için yumuşak bir cetvel kullanın ve sonuçları milimetre cinsinden not edin.
Yedi gün sonra, emme kabarcığını indüklemenin zamanı geldi. Deri emme kabarcığının indüksiyonu için, ekli bir emme haznesine sahip bir vakum pompası kullanın. Piyasada bulunan veya özelleştirilmiş bir cihaz kullanın.
Daha da önemlisi, pompanın eksi 20 ila eksi 40 kilopaskal aralığında ayarlanabilir olması ve sabit ve güvenilir bir negatif basınç sağlaması gerekir. Emme haznesinin alt kısmı, cilt ile temas halinde olan küçük bir deliğe sahip bir plakadan oluşur. Plaklar tek veya çok delikli olabilir ve cilt reaksiyonuna uyacak şekilde farklı boyutlarda uygulanabilir.
Haznenin üst kısmı, kabarcığın görsel olarak izlenmesine izin vermelidir. İndüksiyondan önce cildi ve hazne plakasını dezenfekte edin. Kolun rahat bir şekilde dinlendiğinden emin olun.
Ayarlanabilir kayışlar kullanarak hazneyi buraya takın ve sabitleyin. Deri reaksiyonunun merkezi, alt plaka deliğinden görülebilmelidir. Emme cihazını açın ve negatif basıncı eksi 20 kilopaskal olarak ayarlayın.
Otuz dakika sonra, basıncı eksi 25 kilopaskal'a yükseltin. 60 dakika sonra, basıncı eksi 30 kilopaskal'a yükseltin. Ve tek bir kabarcık tamamen oluşana kadar basıncı burada tutun.
Blister indüksiyon aşaması normalde yaklaşık bir ila üç saat sürer. Burada yüksek hızda gösterildiği gibi, son 30 dakika içinde kademeli olarak meydana gelen gerçek kabarcık oluşumu ile. Kabarcık yırtılması veya kanama belirtileri varsa, basıncı yavaşça boşaltmanız ve indüksiyonu erken durdurmanız önerilir.
Kabarcıklar, tek veya çoklu birleştirme kabarcıkları olarak görünebilir. İşlem genellikle kaşıntılı bir his ile ilişkilidir. Kabarcık tamamen oluştuktan sonra, basıncı boşaltın ve emme odasını dikkatlice çıkarın.
Doğru şekilde indüklenen kabarcıklarda, epidermal tabaka cildin dermal tabakasından tamamen ayrılır ve sıvı ile dolu bir boşluk bırakır. Çevredeki cilt bölgesine yumuşak bir pansuman uygulayarak ve kabarcığın üzerine 15 mililitrelik plastik bir tüpten sert bir kapak yerleştirerek kabarcığı koruyun. Kapağı alerjik olmayan bir bantla ve ardından yumuşak, esnek bir bandajla sabitleyin.
Gönüllüye koruyucu pansumanı gece boyunca tutması talimatını verin. Ertesi gün, pansumanı dikkatlice çıkarın ve kabarcıklı alanı sprey kullanarak dezenfekte edin. Blister içeriğini hasat etmek için 23 gauge iğneli 2 mililitrelik steril bir şırınga kullanın.
İğneyi blister tavanın üst yan tarafına sokun ve sıvıyı yavaşça aspire edin. Boşluğun tabanına dokunmaktan kaçının, ancak bu örnekte olduğu gibi kabarcık hacmi düşük olabileceğinden tüm sıvıyı topladığınızdan emin olun. Çöken kabarcık iz bırakmadan iyileşir.
Kabarcığın üzerine koruyucu bir pansuman ekleyin. Daha sonra blister sıvıyı steril bir tüpe aktarın. Bir masa üstü santrifüj kullanarak 600 G'de dört dakika aşağı çevirin.
Sonra, süpernatanı hasat edin ve hücre peletini 500 mikrolitre hücre ortamında yeniden süspanse edin. Taze hücreler artık sayım ve daha fazla analiz için hazırdır. Emme blister hücreleri, akış sitometrisi gibi in vitro analizler için kullanılabilir.
BCG aşılı gönüllülerle yapılan bu deneyde, hücre verimi blister başına 15.000 ila 200.000 hücre arasında değişmektedir. Burada, hücreleri tek bir emme kabarcığından izole ettik ve hücreleri in vitro olarak PPD ile uyardık, ardından boyama ve akış sitometrisi izledik. Karşılaştırma için, aynı PCG aşılı gönüllüden PBMC'ler üzerinde paralel bir analiz yaptık.
Panellerde, TNF-alfa, interferon-gama ve IL2'nin hücreler arası üretimi için boyanmış CD4 pozitif T hücrelerinin popülasyonlarını görüyorsunuz. Bu gönüllüde, deriden izole edilen CD4 pozitif T hücrelerinin %30'undan fazlası antijene özgüydü. PBMC'lerde bu fraksiyon %1'den azdıAyrıca, blister hücrelerin bireysel sitokin profilleri, hem merkezi bellek T hücrelerini hem de efektör T hücrelerini temsil ediyordu, bu da bu yöntemin in vivo olarak üretilen uzun ömürlü bellek tepkilerini incelememize nasıl izin verdiğini gösteriyor.
Burada, şekil A, emme kabarcıklarından elde edilen sıvının in vivo üretilen sitokinler için analiz edilebileceğini göstermektedir. Şekil B'de, mikobakteri tuberculosis varlığında dört gün boyunca emme kabarcıklarından elde edilen hücreleri kültürledik, bu da emme blister hücrelerinin interferon-gama ve TNF alfa ex vivo üretebildiğini gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, kutanöz antijen birikimini takiben emme kabarcıklarından hücrelerin nasıl indükleneceği ve hasat edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Bu gösteride, tüberküloz araştırmaları alanında özel öneme sahip bir antijen kullandık. Ancak, bu metodolojinin temel ilkeleri, adaptif bağışıklık alanlarında veya T hücresi hedefleme ajanlarını araştıran denemelerde kullanılabilir. Ayrıca, insan gönüllülerle çalışırken etik ve güvenliğin birinci öncelik olduğunu lütfen unutmayın.
Ayrıca insan numuneleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve laboratuvarda her zaman güvenlik önlemlerine uyulması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu video, antijen spesifik T-hücrelerinin ve sitokinlerin in vivo olarak toplanmasına olanak tanıyan vakum blister deri geri çağırma yöntemini göstermektedir. Bu teknik, aşı geliştirme gibi süreçlerde olduğu üzere, insan adaptif bağışıklık yanıtlarının incelenmesinde özellikle yararlıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Adaptif immün yanıt
- Aşı geliştirme
Arka Plan
- Vakum blister yöntemi, bağışıklık yanıtlarını incelemek için non-invaziv bir yol sunar.
- Bağışıklık reaksiyonu bölgesinden doğrudan T-hücrelerinin toplanmasına olanak tanır.
- İmmün hafızayı değerlendirmek için bir hatırlatma antijeni olarak PPD kullanılır.
- Bu yöntem, bağışıklığın hücresel mekanizmalarının anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- İmmün hücrelerin toplanması için vakumlu blister tekniğini göstermek.
- İnsanlarda antijene özgü T-hücresi yanıtlarını analiz etmek.
- Bu yöntemin araştırmalarda uygulanması için pratik bir kılavuz sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- PPD'nin cildin dermal tabakasına enjeksiyonu.
- T-hücrelerini ve sitokinleri toplamak için vakum bülbüllerinin indüklenmesi.
- Enjeksiyon sonrası cilt reaksiyonlarının ölçümü.
- İleri analizler için bülbül sıvısının toplanması.
Ana Sonuçlar
- Vakum bülüllerinin başarılı bir şekilde indüklendiği gösterilmiştir.
- Toplanan T hücreleri ve sitokinler in vitro olarak analiz edilebilir.
- İmmün yanıtların ölçümü için net bir metodoloji oluşturulmuştur.
- Vakum bülül tekniğinin güvenliliği ve etkinliği kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Vakum bülbül yöntemi, adaptif immünitenin incelenmesinde etkilidir.
- Bu teknik, aşı araştırma ve geliştirmelerine yardımcı olabilir.
- İnsanlarda gerçekleştirilen immünolojik çalışmalar için değerli bir araç sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
İnsan T-hücresi hatırlama yanıtlarının in vivo olarak incelenmesi, aşı geliştirme ve immünoterapi hedef doğrulaması için kritik mekanistik içgörüler sağlar. Vakumlu bülle deri hatırlama yöntemi, immün reaksiyon bölgesindeki antijene özgü T-hücrelerine ve sitokin mikroortamlara doğrudan erişim sağlayarak, T-hücresi hedefli ajanların preklinik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yaklaşım, ex vivo bulguları in vivo insan biyolojisiyle ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Antijene özgü polifonkşiyonel CD4+ T-hücrelerini doğrudan insan dokusundan izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: T-hücresi hedeflerinin hastalıkla ilişkili bir sistemde fonksiyonel doğrulanması yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Stratejik Değer: Mekanistik tarama için yüksek fraksiyonda antijene özgü hücreler sağlayarak öncü madde tanımlamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Multiplex ve flow sitometrik okumalar kullanarak, sonraki analiz standartlaştırması için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Sitokin üretimi ve T-hücresi fonksiyonelliğinin ex vivo ortamda kantitatif vele tekrarlanabilir çıktılarını sunar.
- Stratejik Değer: Bileşiklerin insan bellek T-hücresi yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ölçeklenebilir platform yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyumlu olarak, tuberkulin hatırlatma yanıtının BCG aşılı insan modeli üzerinden hastalıkla olan ilişkisini kanıtlar.
- Operasyonel Değer: İn vivo ortamda oluşturulan merkezi ve efektör bellek T hücresi profillerini yakalayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hücresel immünite çalışmalarındaki mekanistik belirsizlikleri azaltarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle T-hücresi modüle eden terapiler ve aşı adayları için, erken keşim aşamasındaki hipotez testlerinden öncü bileşik belirlemesine ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: İmmün reaksiyon bölgesinden klonal olarak genişlemiş, farklılaşmış T-hücreleri toplayarak hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Alt analizler için tutarlı hücre canlılığı sağlayan standartlaştırılmış blister indüksiyonu ve sıvı toplama protokolleri aracılığıyla assay hazırlığı sunar.
- Analitikler: Karşılaştırmalı durum değerlendirmesi için antijene özgü T-hücre frekansının ve polifonksiyonel sitokin profillerinin (örneğin IFN-γ, TNF-α, IL-2) kantitatif ölçümlerini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Suction blister kaynaklı hücrelerin in vivo olarak üretilen uzun ömürlü hafıza yanıtlarını nasıl yansıttığını göstererek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Aşı ve immünoterapi programları genelinde insan adaptif immünitesini incelemek için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güveni, hedef doğrulama, insan bağışıklık yanıtlarındaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: İnsan derisinden antijene özgü T-hücresi izolasyonunun standartlaştırılması, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: İmmünoterapi geliştirmede daha iyi devam/dur kararları, sermaye verimliliği ve geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: İnsanla ilişkili bağışıklık yanıtı verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- İnsan gönüllü çalışmaları, kütanöz antijen iletimi ve vakumla bülbül oluşturma teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Ayarlanabilir vakum pompası (–20 ila –40 kPa), steril şırıngalar, PPD antijeni ve hücre işleme için santrifüj ekipmanı gereklidir.
- İmmünoloji ve klinik ekipler arasında bülbül ölçümü, hasadı ve sıvı transfer protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Tutarlı negatif basınç gradyanlarını korurken, farklı antijen modelleri ve cilt reaksiyon bölgeleri için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Değişken hücre verimi (bülbül başına 15,000–200,000 hücre) ve gönüllülerdeki mevcut immünolojik hafızaya bağımlılık gibi pratik kısıtlamaları içerir.
