Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Bu Drosophila larva duyusal nöron hasarı modelinin genel amacı, in vivo canlı görüntüleme, iki fotonlu lazer aksotomi/dendriotomi ve güçlü sinek genetik araç kutusunu, nörorejenerasyonun potansiyel destekleyicilerini ve inhibitörlerini taramak için bir platformda birleştirmektir. Bu yöntem, hem periferik hem de merkezi sinir sisteminde nörojenerasyon için yeni içsel ve dışsal düzenleyicinin tanımlanması gibi bir nörojenerasyon alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı, nörorejenerasyon için yeni adayların kolay, hızlı ve ucuz bir şekilde taranabilmesidir.

Bu sistem nörorejenerasyon hakkında bilgi sağlayabilse de, nörodejeneratif hastalıklar ve nöron-glia etkileşimleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü akson ve dendritik rejenerasyonu modellemek için farklı nöron türlerini kullanan farklı deney düzenekleri kullanılır. Larva toplama için kültür şişelerini aşağıdaki gibi hazırlayın.

Drosophila kültür şişesinin bir duvarında 1,5 santimetrelik bir delik açmak için bir bıçak kullanın ve havalandırma için deliği bir pamuk topuyla doldurun. Daha sonra bir üzüm suyu agar tabağına bir miktar maya ezmesi koyun ve şişenin ana ağzını tıkamak için plakayı kullanın. Böyle bir şişede, 10 bakire dişi ve beş erkekten oluşan bir haç oluşturun ve 25 santigrat derecede kültür yaparken plakayı günlük olarak değiştirin.

Kontaminasyonu önlemek için toplanan plakaları hafif propiyonik aside batırılmış ıslak bir doku ile kültürleyin. Kültürlenmiş plakalardan, forseps kullanarak gerekli aşamada larvaları hasat edin. Toplanan larvaları yavaşça maya macunu olmadan yeni bir üzüm suyu agar tabağına aktarın.

Etrafta sürünerek kendilerini temizledikten sonra görüntülenebilirler. Her görüntüleme seansına başlamak için görüntüleme lazerlerini ve mikroskobu açın. Yaralanma için iki fotonlu bir mikroskop kullanın.

Görüntüleme yazılımında, lazeri GFP'yi maksimum 1950 miliwatt güçle 930 nanometrede görüntüleyecek şekilde ayarlayın. Line Scan Mode (Çizgi Tarama Modu) öğesini seçin ve iğne deliğini sonuna kadar açın. Ardından, bir PNS yaralanması yapmak için lazer yoğunluğunu tam gücün yaklaşık% 20'sine veya bir VNC yaralanması yapmak için tam gücün% 50 ila% 100'üne yükseltin.

Ardından, tarama için 512 kare piksel çerçeve seçin ve mümkün olan en yüksek tarama hızını kullanın. Ortalama bir sayı ve sekiz bitlik bir bit derinliği kullanın. Ardından kazancı yaklaşık 750'ye ayarlayın ve ofseti sıfıra ayarlayın.

Şimdi bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü 2P GFP 930 Ablasyon olarak kaydedin, böylece daha sonraki deneylerde kolay yeniden kullanıma izin verin. Yaralanma sonrası görüntüleme için konfokal bir mikroskop kullanın. İlk önce argon lazeri 488 nanometrede ayarlayın.

Alım sekmesini seçin ve ardından Z Yığını'nı seçin. Lazer altında, 488 nanometre argon lazerini açın. Ardından Kanallar'a gidin, 488 nanometre lazeri seçin ve lazer gücünü %5 ila %10'a yükseltinİğne deliği için bir ila iki alan birimi seçeneğini kullanın.

Ardından kazancı 650'ye ayarlayın. Şimdi Çekim Modunda, kare taraması olarak 1024 kare pikseli seçin. Maksimum tarama hızını kullanın.

Ortalama sayıda iki bit ve sekiz bitlik bir bit derinliği kullanın. Bu ön deney protokolünü GFP Imaging olarak kaydedin. Larvaları uyuşturarak başlayın.

Çeker ocakta, 60 milimetrelik bir cam tabağı 15 santimetrelik plastik bir petri kabına yerleştirin. Sonra bir parça kağıt mendil katlayın ve cam tabağa koyun. Dietil eter eklendikten sonra üzüm agar plakasını doku üzerine yerleştirin.

Ardından, bir cam slayt üzerine, ortasına bir damla Halokarbon 27 yağı koyun ve dört köşenin her birine bir nokta vakumlu gres yerleştirin. Daha sonra bir larvayı agar plakasına aktarmak için forseps kullanın ve larvaları uyuşturmak için cam tabağı kapatın. Larva hareket etmeyi bırakır bırakmaz, başı dik olacak şekilde dikkatlice Halokarbon yağına aktarın.

Ardından sürgünün üzerine bir örtü kaydırın ve larvaya değene kadar hafifçe bastırın. Ardından, iki fotonlu lazerin onlara en kolay çarpacağı yere kesilecek hücreleri yuvarlamak için kapak kaymasını kaydırmak için hafif bir kuvvet kullanın. Konum, hangi nöronların hedeflendiğine bağlı olarak değişecektir.

Şimdi düzeneği iki fotonlu mikroskop aşamasına sabitleyin ve 40X yağa daldırma objektifi kullanarak ilgilenilen hücrelere odaklanın. Yazılımda, tarama moduna geçin ve kaydedilen protokolü yükleyin. İğne deliğinin tamamen açık olduğundan emin olun.

Ardından Canlı Mod'da, ilgilenilen bölgenin iyi bir görüntüsünü elde edin. Ardından, Kırp düğmesinin kullanılabilir hale gelmesi için canlı taramayı durdurun. Kırpma işlevini kullanarak, hedef alanı yalnızca olası yaralanma bölgesine odaklamak için tarama penceresini ayarlayın.

Ardından yeni bir görüntüleme penceresi açın. Şimdi tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Ardından, taramayı başlatmak ve durdurmak için Sürekli düğmesini değiştirin.

Dikkatlice izleyin. Çiçeklenmede ciddi bir artış olur olmaz, taramayı sonlandırın. Ardından, orijinal görüntüleme penceresine geri dönün ve Canlı Modu seçin ve odağı ayarlayarak az önce hedeflenen bölgeyi bulun.

Başarılı bir yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma bölgesinde küçük bir kraterin, halka benzeri yapının veya lokalize döküntülerin ortaya çıkmasıdır. Lazer gücü çok yüksekse, ölümcül olabilecek büyük bir hasarlı alan görünür olacaktır. Şimdi kapak fişini dikkatlice çıkarın ve yaralı larvaları maya macunu ile yeni bir tabağa aktarın.

Plakayı, propiyonik aside batırılmış bir doku ile birlikte 60 milimetrelik bir tabağa koyun. Ardından plakayı kültür sıcaklığına geri getirin. Larvaların daha sonra görüntülenmesi için, kaydedilen konfokal kurulumu kullanın ve 25X objektifle Z yığını görüntülerini toplayın.

Rejenerasyonun ölçülebilmesi için normalleştirme noktasını eklediğinizden emin olun. Açıklanan protokol kullanılarak, üçüncü ve dördüncü sınıf DA nöronlarının rejenerasyonu araştırıldı. Tipik olarak, abdominal segmentler A7 ila A2'nin sağ tarafındaki üç veya dört nöron yaralandı.

Spesifik olarak, üçüncü sınıf DDAF ve dördüncü sınıf V Prime ADA nöronları hedeflendi. Larvalar yaralanmadan 24, 48 ve 72 saat sonra görüntülendi. 24 saatte, distal aksonlar genellikle dejenerasyonu tamamladı ve akson gövdesi kolayca görülebiliyordu.

48 saatte, dördüncü sınıf DA nöronlarında rejenerasyonu değerlendirmek mümkün oldu. Bu nöronların yaklaşık% 70'i yaralanma bölgesinin ötesinde yenilendi. Bununla birlikte, 72 saat sonra bile, üçüncü sınıf DA nöronlarının yeniden büyüyemediği açıktı.

Bu, durmuş büyüme konilerinin tekrarlanan gözlemlerine dayanarak değerlendirildi. Bu videoyu izledikten sonra, deneyin nasıl kurulacağını, iki foton yaralanmasının nasıl gerçekleştirileceğini ve sonuçların nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa larva başına 15 dakika sürer.

Bu prosedürü denerken, deneysel büyümeyi ilgili kontrollerle yan yana karşılaştırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, akson hasarının protein translokasyonuna neden olup olmayacağı ve bunun sonucunda bir yol değişikliğine neden olup olmayacağı gibi daha fazla soruyu yanıtlamak için immün boyama gibi bir yöntem gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların Drosophila larva duyusal nöronlarında nörorejenerasyonu keşfetmelerinin yolunu açtı.

Son olarak, dietil eter ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken çeker ocakta larva anestezisi yapmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.