Name: Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin, Drosophila duyu nöronu hasar modelinde iki foton lazer akzotomi ve canlı görüntüleme tekniklerini kullanarak nörorejenerasyonu nasıl araştıracağınızı. Bu yöntem, periferik ve santral sinir sistemi çalışmaları için hızlı ve uygun maliyetli bir tarama platformu sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jessica Goldshteyn teknik destek için teşekkür ederiz. Şarkı laboratuvar çalışmalarında NIH grant R00NS088211 ve entelektüel ve Gelişme Bozuklukları Araştırma Merkezi (IDDRC) Yeni Program Geliştirme Ödülü tarafından finanse edilmektedir.

1. hazırlanması kültür plakaları ve şişeler
<ol><li>Üzüm suyu Ağar kaplamalar hazırlanması<ol>
<li>Agar toz, 200 mL üzüm suyu ve 192 mL GKD2O 10 g bir kabı ve mikrodalga fırında yaklaşık 4-5 dk, zaman zaman agar tamamen eriyene kadar karıştırarak ekleyin.</li>
		<li>Yaklaşık 60 ° C'ye çözüm bir duman başlık, sakin 4,2 mL % 95 etanol ve 4.0 mL buzul Asetik asit ekleyin. GKD2O. Mix ile 400 mL çözüm hacmi de ayarlayın.</li>
		<li>Her 35-mm plaka için yaklaşık 2-3 mL çözüm ekleyin. Yaklaşık 400 mL üzüm suyu agar çözüm olmak üzere toplam 120-150 tabak olun.</li>
		<li>Plakayı serin ve agar çözüm kuvvetlendirmek 10 dakika bekleyin. Üzüm suyu Ağar kaplamalar kendi kendine mühürlü kilitli torbalar içinde paketi ve ileride kullanmak üzere 4° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drosophila kültür şişe hazırlanması<ol>
<li>Bir bıçak bir 1,5 cm yan uzunluğu üçgen Drosophila kültür şişe bir duvarda delik ve pamuk havalandırma için bir 2-2.5 cm çapında top ile delik doldurmak için kullanın.</li>
		<li>Bir üzüm suyu agar plaka ile 0.5 cm3 hakkında Maya hamur takıma şişe takın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Drosophila larva topluluğu
<ol><li>Yetişkin sinekler haçlar ayarla<ol>
<li>Yer 10 bakire kadın ve 5 erkek yetişkin uçar birlikte ile üzüm suyu agar plaka takılı bir kültür şişe.</li>
		<li>Sinekler yumurta üzüm suyu agar plaka üzerinde yatıyordu olacaktır böylece şişe dipleri 25 ° C'de yerleştirin. Maya yapıştır ile plaka günde en az bir kez değiştirin. 20'den fazla bakire kadın ve 10 adım 2.1.1 erkeklerde ile homojen bir gelişimsel sahne larvaları hasat veren bir 2-h koleksiyonu süre başlar.</li>
		<li>Kültür plaka 60 mm Petri kabına ıslak peçete ile 25° c, % 0.5 propiyonik asit çözümde batırılmış. Oksijen akışını engellemek değil doku düzenleyin. Not: Propionik asit çözüm çanak nem korumak ve küf oluşumunu önlemek için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Belirli bir yaş larvaları hasat<ol>
<li>Forseps çifti Maya Yapıştır olmadan yeni bir üzüm suyu agar plakasına larva istenen sahne alanı, örneğin, 2nd 3rd INSTAR larva 48-72 saat sonra yumurta (AEL), döşeme için aktarmak için kullanın.</li>
		<li>Maya larva'nın cilt onlara izin vererek potansiyel Maya lazer axotomy ve görüntüleme ile engellemesini önlemek için yeni tabakta etrafında gezinme kaldırmak. Alternatif olarak, iyice larvalar PBS bir tabak içinde yıkama ve kısaca doku kağıt parçasına kurutma temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. İki fotonlu yaralanma ve Confocal görüntüleme
<ol><li>Mikroskop Kur Not: mikroskop ile iki fotonlu lazer tarama confocal lazer bu deneme için kullanılan, ancak eşdeğer bir kurulum diğer sistemlerle de yeterli olacaktır. İki fotonlu lazer (930 nm) yaralanma ve Argon lazer teslim etmek için kullanılan (488 nm) GFP confocal görüntüleme için kullanıldı.<ol>
<li>Her oturumun başlangıcında İki fotonlu lazer ve/veya confocal lazer ve mikroskop açın. Görüntüleme yazılımını açın.</li>
		<li>İki fotonlu yaralanma için 930 adlı iki fotonlu lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarla nm (1.950 mW).<ol>
<li>Satır tarama modu seçin. İğne deliği kadar sonuna kadar açın. ~ % 20 lazer yoğunluk artmak (390 mW).</li>
			<li>512 x 512 çerçeve tarama olarak seçin. Maksimum tarama hızı (genellikle ile piksel Işınma Zamanı, 0,77 µs) kullanın. Ortalama numarası 1'dir ve bit derinliği 8 bit olduğundan emin olun.</li>
			<li>~ 750 ve uzaklık 0 set kazanç.</li>
			<li>Deneysel protokol bırakmak için kolay 2 P GFP 930 ablasyon, olarak yeniden gelecekte bu önceden ayarlanmış deneyleri.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Confocal görüntüleme için 488, Argon lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarla nm:<ol>
<li>Satın alma sekmesini ve ardından Z-yığınıseçin.</li>
			<li>"Lazeraltında", 488 nm Argon lazer için açın.</li>
			<li>Gidin kanalları, 488 mm lazer seçin ve % 5-10 lazer gücünü arttırın. İğne deliği ve sondaj için 1-2 havadar birimi (AU) kullanın. 650 kazanç ayarlayın.</li>
			<li>Toplama modu, 1024 x 1024 çerçeve tarama kadar seçin, kullanmak en yüksek tarama hızı, ortalama sayısı 2 ve 8 Bit bit derinliği.</li>
			<li>Bu önceden belirlenmiş deneysel protokol GFP Imagingkaydedin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Larva anestezi Dietil eter ve montaj ile<ol>
<li>Bir duman başlık, 60 mm cam tabak 15 cm plastik Petri kabına yerleştirin. Kat ve doku kağıt cam tabak dibinde yatıyordu sonra doku üzerinde bir üzüm suyu agar tabak yerleştirin. Dietil eter cam tabak içine noktası burada dokulu kağıt ıslatılır ve sıvı eter tabakta kalan bir katmanı ekleyin. Ağzını her zaman tut.</li>
		<li>Halocarbon bir damla ile bir cam slayt merkezi 27 petrol hazırlayın. 4 noktalar üzerine daha sonra coverslip desteklemek için slayt, dört köşesine vakum yağ ekleyin.</li>
		<li>Forseps kullanmak kadar temizlenmiş bir larva almak ve agar plaka 60 mm cam tabak yerleştirin. Cam çanak kapağı ile kapak ve larva hareket etmeyi durdurana kadar bekleyin. PNS yaralanma/görüntülemesi için kuyruğunu seğirmesi durur larva sok. MSS için tüm larva hareketsiz, hale gelinceye kadar bekleyin özellikle baş kesimleri. Not: Eter pozlama zamanlaması çok önemlidir. Tartışma bakın.</li>
		<li>Dikkatle imzalat larva kadar almak ve kafa-dik halocarbon petrol slayt üzerinde damla içine yerleştirin. Bir coverslip slayt üzerine ekleyin. Hafif basınç larva (şekil 1A) dokunana kadar coverslip üzerinde aşağı doğru itin için kullanın.</li>
		<li>Böylece nöron/axon/dendrite ilgi en iyi ve en yakın mikroskop objektif yavaşça coverslip sola veya sağa larva, rulo doğru iterek larva'nın pozisyonunu ayarlayýn.</li>
		<li>Her iki tracheas görünecek şekilde PNS yaralanma için larva dorsal tarafta, binin. Daha sonra larva Sınıf III da nöron akson (şekil 1B ve 1 C), sınıf IV da nöron akson (şekil 1B ve 1E) yaralamak için 90 derece veya yaralanmasına sınıf IV da nöron dendrites () için ~ 30 derece yaralamak için soldaki ~ 30 derece alın Şekil 2A).</li>
		<li>CNS yaralanma için faiz mikroskop objektif z düzlemde yakın olan bölgedir (şekil 3A), mükemmel ventral taraftan olmak larva konumlandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>İki fotonlu lazer yaralanma<ol>
<li>Mikroskop altında larva içeren slaydı yerleştirin ve Sahne Alanı'nda ile slayt sahibi yerine sabitleyin. Larva bulmak için kullanım 10 X (0.3 NA) amaç.</li>
		<li>Objektif yağ coverslip üzerine 1 damla eklemek, geçiş (1.3 NA) X 40 amaç ve odağı ayarlayın.</li>
		<li>Tarama moduna geçirin ve deneysel protokol 2 P GFP 930 ablasyonyeniden kullanabilirsiniz. İğne deliği ve sondaj ta açıldığında emin olun. Not: Yapılandırma en iyi şekilde bireysel sistemlere dayalı gerekiyor.</li>
		<li>Faiz (ROI) bölge bulmak için Live modda başlatma ve uygun zoom ile iyi bir görüntü kalitesi elde etmek için ayarları ayarlama. Not: Bu adımın amacı en iyi kalitede görüntü alarak yerine zarar için nöron/axon/dendrite bulmak mümkün. Bu nedenle, en az ayarlar hedef alan görselleştirmek için yeterli dozun veya photobleaching önlemek için kullanın.</li>
		<li>Kırp düğmesini-ecek var olmak elde edilebilir Live tarama, durdurun. Yol haritası hizmet sabit görüntü ver. Ekin işlevi seçin ve hedef üzerinde yaralı olmak odaklanmak için tarama penceresi ayarlamak.</li>
		<li>Yaralanma potansiyel sitesinin olarak yatırım Getirisi azaltmak. Örneğin, bir akson veya yaralanma duyarlığını sağlamak ve komşu dokulara zarar azaltmak için bir dendrite genişliğini kapsar. İstenirse, yatırım Getirisi üzerinde kırpmadan önce daha kesin yaralanma için izin zum.</li>
		<li>Yeni bir görüntü penceresini açın. İnceden inceye gözden geçirmek hız azaltmak ve lazer yoğunluk artmak. Live modda taranan doku Floresans sinyal dayalı lazer yoğunluk artışı belirlemek.</li>
		<li>Genellikle, PNS yaralanma için % 25 ve 50-%100 VNC zarar görme başlayarak iki fotonlu lazer yoğunluğu ayarlanabilir. PNS axon yaralanma için lazer yoğunluğu ~ 480 mW ve piksel olması Işınma Zamanı 8.19 μs. VNC axon yaralanma için lazer yoğunluğu ve piksel Işınma Zamanı genellikle 965-1930 mW ve 8.19 32.77 μs, sırasıyla olması.</li>
		<li>Sürekli tarama başlatır. Sürekli düğmenin üzerine hovering imleç bırakın. Resmine bir göz kulak olun ve floresan ciddi bir artış gözlenen Taramayı durdurmak. Not: Otomatik-floresan yaralanma sitesinde Floresans iğnenin görünümü kaynaklanmaktadır.</li>
		<li>Tekrar canlı moduna ayarların yeniden kullanarak geçiş. Sadece odak noktası ayarlayarak hedef aldı faiz bölgesini bulun. Not: Küçük krater, yüzük benzeri yapıda veya yaralanma yerinde tam yerelleştirilmiş enkaz görünümünü başarılı yaralanma iyi bir göstergesidir.</li>
		<li>Sonraki nöron geçin ve birden çok tek bir hayvan nöronlarda incitmek 3.3.5, adım. Veya 3.3.5 yavaş yavaş artan gücü ve/veya ilk yaralanma yetersiz olsaydı tarama hızını azaltarak süre arasındaki adımları yineleyin. Not: Bu da lazer güç durumda yüksek, büyük hasarlı bölgeyi sonrası yaralanma canlı tarama görüntü görünür. Çok fazla yaralanma larva ölüm sebebi.</li>
		<li>Dikkatle coverslip kaldırarak ve Maya yapıştır ile yeni bir plaka üzerine yaralı larva transfer larva kurtarmak. Birkaç mağara agar plaka üzerinde Forseps ile hendek; Alternatif olarak, agar adasını bütün tabağı tabak dışarı sürünerek larva olasılığını azaltmak için kullanmak yerine tabak içinde olun.</li>
		<li>Islak mendil (% 0.5 propiyonik asit çözüm batırılmış) ve kültür oda sıcaklığında veya 25 ° c ile 60 mm kabında plaka koymak Not: Larva larva aşamasında yaklaşık, oda sıcaklığında (22 ° C) 25 ° C'de göre fazladan bir gün kalır</li>
	</ol></li>
	<li>Sonrası yaralanma confocal görüntüleme<ol>
<li>Görüntü anestezi ve montaj adım 3.2, confocal lazer ile görüntüleme gibi aynı yordam kullanılarak larva hazırlanıyor tarafından istenen saat noktalarda yaralı larva. Not: larva aksonal yaralanma onaylamak için yaralanma (AI) sonra 24 saat ve 48 h AI (sınıf IV da nöronlar) veya 72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI (sınıf III da nöronlar) görüntü.</li>
		<li>10 X amacı istimal larva bulun, sonra geçiş için bir 25 X (0.8 NA) amaç. Deneysel iletişim kuralı GFP Imagingyeniden.</li>
		<li>Live düğmesini tıklatın ve daha önce yaralı aynı nöron bulmak.</li>
		<li>İlk ve son Z pozisyonları canlı tarama penceresinde ayarlayın. Dur tuşuna basın ve Z-yığın görüntü elde etmek için deneme Başlat'ı tıklatın. Not: bir normalleştirme noktası (axon yakınsak nokta) miktar rejenerasyon mümkündür görüntüleri yakalarken dahil olduğundan emin olun (şekil 1 d, 1F) – bu anlatılan veri analiz bölümünde daha fazla.</li>
		<li>Görüntü işlemeiçin geçiş, yeni çekilen görüntüyü seçin ve en fazla yoğunluk projeksiyon oluşturmak. Z-yığın ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri kaydetmek.</li>
	</ol></li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>İşleme ve görüntüleme yazılımı veya ImageJ kullanarak görüntüleri ölçmek.</li>
	<li>Miktar PNS axon rejenerasyon<ol>
<li>Rejenerasyon yüzdeyüzde aksonlar lesioned akson arasında Yenileyici anlamına gelir, hesaplar. Yaralanma sitesi regrows sürece Yenileyici olarak bir akson puan.</li>
		<li>Axon uzunluğu artış olan ölçü rejenerasyon uzunluğu. ImageJ ile miktarının rejenere axon izlemek için Parçalı çizgi aracını kullanın ve ölçü birimi Çözümle açılır menüsünde rejenere axon temsil eden çizgiyi uzunluğunu elde etmek için kullanın.</li>
		<li>Yeniden oluşturma işlemi dizin, normalleştirilmiş axon uzunluğu artış olduğu hesaplanır. Not: Axon uzunluğu hücre beden ve noktası (DCAC)-axon uzunluğu/DCAC (şekil 1 d ve 1F) yakınsak akson arasındaki mesafeye göre normalleştirilmiş. Bu değer hesabı larva ölçekleme nedeniyle herhangi bir aksonal büyüme için yardımcı olur. Değeri yeniden oluşturma işlemi temsil eden, 0 değeri yok yenilenme anlamına gelir ve negatif bir değer geri çekilmesi anlamına gelir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Miktar dendrite rejenerasyon<ol>
<li>Açık dendrite büyütme göstermek bu kopmuş arasında da nöronların yüzde olan rejenerasyon yüzdesini, hesaplar. Not: Eğer yeni olumlu dendrites dışarı retrakte dendritik kök ve yaralanma sitesi ötesinde regrow gibi Dendrite büyütme attı. Yaralanma sitesi tarafından yerler ve bazı durumlarda belirlenir, kalan yaralanma kaynaklı autofluorescence nedeniyle kolayca görülebilir.</li>
		<li>Yeni dendritik şube noktaları eklenmesinden sonra yaralanma sayar şube noktaları artırmak, hesaplayın.</li>
		<li>Yaralanma sonra eklenen tüm yeni dendrites toplam uzunluğu olan Toplam dendrite uzunluğunu artırmak, hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Miktar MSS axon rejenerasyon Not: bir lezyon site görüntüsü ilk kez noktada (şekil 3B) dejenerasyonu gösteriyorsa, rejenerasyon uzunluk ve hızı analizinde eklenecektir.<ol>
<li>Regrowing akson uzunluğu olan ölçü rejenerasyon uzunluğu. Not: bir tek lezyon sitesinin regrowing akson yaralanma önce özgün axon yol kapalı kaynaklı olarak tanımlanır.</li>
		<li>NORMALIZED yenilenme uzunluğuolan komissür kesimin - commissures ( şekil 3A ve 3B"Y") arasındaki boyuna mesafe uzunluğu rejenerasyon uzunluğa normalleştirir, hesaplayın. Not: Bu değer doğru larva boyutu farklılıklar etkisi için yardımcı olur.</li>
		<li>Kesimleri arasında belirli bir genotip yenilenme kapasitesi yansıtacak şekilde lesioned tüm kesimlerini Yenileyici yüzde yenilenme oranı, hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Yakura, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYakura%2C+JS+%22Recovery+following+spinal+cord+injury%22">Recovery following spinal cord injury</a>. , (1996).</li>
<li>Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+regenerating+axons+recapitulate+developmental+guidance+during+recovery+from+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).</li>
<li>Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Nogo-A%2C+an+inhibitor+of+axonal+regeneration%2C+as+a+biomarker+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis.</a> Neurology. 68, 283-287 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li>
<li>Sun, F., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+intrinsic+barriers+for+axon+regeneration+in+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS.</a> Curr Opin Neurobiol. , (2010).</li>
<li>Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulators+of+axonal+growth+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).</li>
<li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+intrinsic+mechanisms+of+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).</li>
<li>Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo+limits+neural+plasticity+and+recovery+from+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nogo limits neural plasticity and recovery from injury.</a> Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).</li>
<li>He, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27151637">Intrinsic Control of Axon Regeneration.</a> Neuron. 90, 437-451 (2016).</li>
<li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN%2FmTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li>
<li>Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+Age-Dependent+Decline+in+Axon+Regeneration+in+the+Adult+Mammalian+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System.</a> Cell Rep. 15, 238-246 (2016).</li>
<li>Geoffroy, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PTEN+and+Nogo+Codeletion+on+Corticospinal+Axon+Sprouting+and+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice.</a> J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).</li>
<li>Jin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+skilled+locomotion+by+sprouting+corticospinal+axons+induced+by+co-deletion+of+PTEN+and+SOCS3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3.</a> Nat Commun. 6, 8074(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+induced+by+blockade+of+glial+inhibitors+coupled+with+activation+of+intrinsic+neuronal+growth+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways.</a> Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).</li>
<li>Fang, Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+and+regeneration%3A+insights+from+Drosophila+models+of+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury.</a> Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).</li>
<li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50, 869-881 (2006).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+regeneration+by+the+RNA+repair+and+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway.</a> Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).</li>
<li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133(2011).</li>
<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr Biol. 22, 590-595 (2012).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li>
<li>Brace, E. J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).</li>
<li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration%3A+insights+from+injured+axons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822(2004).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy%3A+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85, 1244-1256 (2015).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Buss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+and+phosphacan+are+present+in+the+astroglial+scar+after+human+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury.</a> BMC Neurol. 9, 32(2009).</li>
<li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).</li>
<li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J Microsc. 234, 1-8 (2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Phys Rev Lett. 99, 158104(2007).</li>
<li>Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Phys Rev Lett. 88, 078103(2002).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963(2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tsai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-mediated+ablation%3A+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30(2006).</li>
<li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+a+low-budget+laser+axotomy+system+to+study+axon+regeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sinek kurma geçer zaman, dişi ve erkek kullanılan sayısı genotip ve belirli deneyler için gerekli larva sayısı bağlı olarak değişebilir. WT sinekler için tipik çapraz 10 kadın ve 5 erkek kullanır. Toplama penceresi, larva yönlendirmesiyle doğruluğunu bağlı olarak daralmış. Örneğin, 2-h koleksiyon dönem larva daha homojen bir nüfus ortaya çıkarır. Bu durumda, haçlar ayarlamak için 20 veya daha fazla bakire kadın kullanmak yeterli yumurta verim yardımcı olur. İlk günden verimidir genellikle kıt, böylece yumurta ile plaka o...

Merkezi sinir sistemi (MSS), bir yaralanma sonra yeniden akson ve yetersizlik hastalarda kalıcı engelli yol açabilir ve aynı zamanda geri dönüşü olmayan nörolojik açıkları nörodejeneratif hastalıkları1,2'deki bir rol oynar ,3,4,5. CNS çevre gibi yaşarsan, içsel büyüme yetenek aksonlar travmadan sonra yeniden oluşturmak mümkün olup olmadığını belirler. Oligodendrocyte, astroglial ve fibroblastic kaynakları hücre dışı etkenler engel nöronal büyüme4,6,7,8, ama bu moleküller ortadan kaldırılması gösterilmiştir Sadece5çimlenme limited için izin verir. İçsel rejenerasyon sinyalleri rejeneratif başarı5,9 etkisi ve potansiyel tedavi hedefleri temsil, ama bu işlemler moleküler düzeyde hala iyi tanımlanmış. Trofik faktör sinyal veya Pten fosfataz10gibi endojen frenler ortadan kaldırılması artışlar aksonal rejenerasyon bazı durumlarda neden olabilir. Farklı yöntemler tek tek etkili olduğu bulundu kombinasyonları da sadece11,12,13,14bugüne kadar sınırlı genel kurtarma sağlar. Bu nedenle, ek yollar hedefe yönelik tedavi tanımlamak için umutsuz bir ihtiyaç vardır. Axon büyütme girişimi ek olarak, olup olmadığını ve nasıl aksonlar reformu synapse özgüllük, doğru hedefe yeniden tel ve elde fonksiyonel iyileşme önemli cevapsız sorular vardır.
Özet olarak, geçerli axon rejenerasyon dikte makine hala çok bölük pörçük anlaşılmasıdır. Sorunun bir parçası olduğunu axon eğitim teknik zorluk içinde gerçek-zaman memelilerde rejenerasyon, pahalı, zaman alıcı ve büyük ölçekli genetik ekranlar yürütmek için zorlu bir yaklaşım. Drosophila melanogaster, öte yandan, karmaşık biyolojik soruların incelenmesi için son derece güçlü bir sistem olduğu ispatlanmıştır. Meyve sineği genler tanımlama ve çarpıcı insanlarda korunmuş yolları sinyal vesile olmuştur ve nörodejeneratif hastalıklar, büyük moleküler genetik araçları aracılığıyla gibi insan koşulları çalışma için başarılı bir model olmuştur Gen işlev15işlemek kullanılabilir. Özellikle, meyve sinekleri genlerin sinir yaralanma ve büyütme15,16dahil keşfi için ideal bir araç olarak kabul edilir. Yetişkin kafa veya larva ventral sinir kablosu (VNC) iğneler, larva VNC veya sinir ezmek ile forseps, larva nöron lazer axotomy, koku reseptör nöron kaldırma, beyin explants yaralanma ile bıçak gibi de dahil olmak üzere birkaç sinek sinirsel hasar modelleri geliştirilmiştir, ve periferik sinir lezyonu kanat kıdem15,17,18,19,20,21,22,23tarafından. Heyecan verici, son iş kullanarak Drosophila yaralanma modelleriyle yanıt vermek için sinir yaralanmaları, bazıları24 memelilerde korunmuş gösterilen sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel ve genetik yollar bizim anlayış gelişmiş var. ,25. Yine, bu model organizma tanımlayıcı roman mekanizmaları, sinirsel onarma yardımcı programı vurgular.
Burada açıklanan bir iki fotonlu Lazer tabanlı Drosophila larva duyusal nöron yaralanma modelidir. İki fotonlu lazer ilk Zebra balığı vivo içinde 200326aksonlar kesmek için kullanılmıştır. Aynı yıl, ilk lazer dendriotomy pulsed azot lazer27kullanarak Drosophila içinde gerçekleştirildi. Kısa süre sonra birkaç C. elegans labs femtosecond lazer axon rejenerasyon28modelleri oluşturmak için kullanılan. 2007'de, Wu ve meslektaşları ile karşılaştırıldığında ve lazerler29türleri tarafından indüklenen C. elegans lazer yaralanmaları arasındaki farklar bildirdi. 2010 yılında, akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra lazer axotomy ilk Drosophila30' u gerçekleşmesi için gösterildi. Bu geniş lazer yaralanma edebiyat bina, yaralanma hedeflenen sitelere kesin indüksiyon ile komşu dokulara az pertürbasyon sağlar, İki fotonlu lazer kullanarak bir sinek sinir yaralanma modeli nispeten temiz sağlayan geliştirdiğimiz Sistem neuroregeneration tek hücreli çözünürlük ile içsel ve dışsal özelliklerini incelemek için. Özellikle, biz her iki periferik sinir sistemi (PNS) bir dizi yaralanma yöntem dendritik arborization (da) duyusal nöronlar için kurduk ve CNS. Öncelikle kendi dendrite dallanma karmaşıklığı tarafından seçkin dört farklı sınıflara da nöronların gruplandırılabilir: sınıf ı IV31. Yayımlanmış çalışmalarımız da nöron rejenerasyonu memeli yaralanma modelleri fenotipik ve moleküler düzeyde benzer gösterir: da nöronların sınıf IV ile sınıf belirli rejenerasyon özelliklerini görüntülemek ama ben veya III da nöronların yenilenme içinde sergilenmesi sınıf PNS; sınıf IV da nöron aksonlar sağlam çevre içinde yeniden ama rejeneratif potansiyellerini önemli ölçüde böylece dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar memelilerde benzeyen MSS azaltılır; mTOR etkinlik Pten yoluyla artırılması silme veya Akt overexpression akson rejenerasyon anında CNS19içinde geliştirir. Bu yaralanma modeli kullanmak, genetik ekranlar sahne olmuştur ve RNA işleme enzim Rtca akson hasarı hücresel stres ve RNA modifikasyon20 bağlanma axon rejenerasyon, evrimsel korunmuş bir inhibitör faktörü olarak belirledik .
Sunulan paradigmada, yaralanma lazer axotomy/dendriotomy yolu ile larva sınıf IV veya III da nöronların, ppk-CD4-tdGFP veya 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo Gal80, sırasıyla etiketli indüklenen. Yaralanma 3rd INSTAR larvaları yaklaşık 48-72 saat için 2nd (h AEL) döşeme yumurta sonra gerçekleştirilir. PNS için axotomy lezyon axon ~ 20-50 µm hücre vücuttan, CNS axotomy ~ 20 µm çapında komissür Kavşağı'nda VNC adlı bir alanı için ve dendriotomy için birincil dendritik şube noktaları bölümüne hedeflenmektedir. Aynı nöron 8-24 h sonra yaralanma (AI) tam transeksiyon onaylamak için ve 48-72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI görüntüsü. Hızlandırılmış confocal görüntüleme yoluyla zamanla dejenerasyon ve rejenerasyon yaralı vivo içinde olmuştur bireysel aksonlar/dendrites izlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Dietil eter, ACS reaktifi, susuz</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 27 Oil</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), 20x Konsantre, pH 7.5, tedarikçi # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar tozu, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>Üzüm suyu</td><td>Welch' s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol %95 (Reaktif Alkol %95)</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Propiyonik Asit</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Gözlükleri: Dikdörtgenler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm X 22 mm</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 lazer tarama mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir vivo drosophila yaralanma modeli

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Hasarlı nöronlar büyütme kapasitesi neuroregeneration ve fonksiyonel iyileşme sinir sistemi travmadan sonra yönetir. Son birkaç on yıl boyunca, çeşitli içsel ve dışsal inhibitör faktörleri axon rejenerasyon sınırlama içinde yer tespit edilmiştir. Ancak, sadece Bu inhibitör ipuçlarını kaldırma ek yasal makine varlığını gösteren başarılı rejenerasyon için yeterli değil. Drosophila melanogaster, meyve sineği örümceklerle korunmuş genler ve sinyal yollar insanlar da dahil omurgalılar ile paylaşır. Sineklerin Tanrısı güçlü genetik araç kutusu iki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ile birleştirerek, biz burada Drosophila duyusal nöron-dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli sistematik olarak roman için eleme için bir platform olarak tarif rejenerasyon düzenleyiciler. Kısaca, bu paradigma bir) hazırlanması larva, b) lezyon indüksiyon dendrite(s) veya axon(s) kullanarak bir iki fotonlu lazer, c) canlı confocal görüntüleme sonrası yaralanma ve d) veri analizi için içerir. Bizim modeli son derece tekrarlanabilir yaralanma tek etiketli nöronlar, akson ve periferik ve santral sinir sistemi iyi tanımlanmış nöronal türlerinden dendrites olanak verir.

Da nöronların fark rejenerasyon periferik ve santral sinir sistemi, aynı zamanda arasında sınıf özgüllük potansiyel göstermek. Bu axon rejenerasyon (sınıf IV PNS yaralanma kullanarak) yanı sıra bu yenilenme (sınıf IV merkezi sinir sistemi yaralanma ve sınıf III PNS yaralanma ile) inhibitör olduğunu için gerekli olan roman faktörleri için ekran için benzersiz fırsatlar sağlar.
PNS Axon rejenerasyon
<p class="jove_content" fo:kee...

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Bu Drosophila larval duyusal nöron hasar modelinin genel amacı; in vivo canlı görüntüleme, iki foton lazerle aksonotomi/dendritotomi ve güçlü sinek genetik araç setini, nörorejenerasyonun potansiyel promotörlerini ve inhibitörlerini taramak için bir platformda birleştirmektir. Bu yöntem, hem periferik hem de merkezi sinir sisteminde nörorejenerasyon için yeni intrinsik ve ekstrinsik düzenleyicilerin tanımlanması gibi, nörorejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, nörorejenerasyon için yeni adayların kolay, hızlı ve ucuz bir şekilde taranabilmesidir.Bu sistem nörorejenerasyon hakkında bilgi sağlayabilse de, nörodejeneratif hastalıklar ve nöron-glia etkileşimleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler zorluk yaşayacaktır; çünkü akson rejenerasyonu ile dendritik rejenerasyonu modellemek için farklı nöron türlerinin kullanıldığı farklı deneysel düzenekler uygulanır. Larva toplama işlemi için kültür şişelerini şu şekilde hazırlayın.Bir Drosophila kültür şişesinin bir duvarına bıçakla 1,5 santimetrelik bir delik açın ve havalandırma için deliği bir pamuk topuyla doldurun. Ardından

a-drosophila-vivo-injury-model-for-studying-neuroregeneration

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

Bu videoda, bir Drosophila melanogaster larvasındaki aksonların iki fotonlu lazer ablasyonu ve yaralanmayı indüklemek ve yaralanma bölgesini görüntülemek için örnek bir protokol açıklanmaktadır.

İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunu Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu video, yüksek güçlü bir lazer kullanarak Drosophila larvalarında hedeflenen nöronal hasarı indüklemek için bir yöntemi göstermektedir. Larvaları mikroskop altında konumlandırdıktan sonra, düşük güçlü bir lazer floresan nöronları tarar ve daha sonra lokalize hasarı indüklemek için lazer gücü artırılır. Yaralanma, artan floresan ve yaralanma bölgesinde bir krater ile doğrulanır.

Bir Drosophila larvasında yüksek güçlü bir lazer kullanarak hedeflenen nöronal hasarın indüklenmesi

Bu video, drosophila beyninde penetran travmatik beyin hasarının indüksiyonunu göstermektedir. Yeni çıkan sinekler seçilir, uyuşturulur ve floresan donanımlı bir stereo mikroskop altında konumlandırılır. GFP eksprese eden mantar gövdesi tanımlanır ve yaralanmaya neden olmak için bir Minutien pimi yerleştirilir. Sineklerin daha ileri çalışmalar için iyileşmesine izin verilir.

Yetişkin Drosophila Sineklerinde Penetran Travmatik Beyin Hasarına İndükleme

Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Burada, Drosophila larva'daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Bu makale, erişkin Drosophila'ya Penetrasyon Travmatik Beyin Hasarı (PTBI) uygulamak ve ortaya çıkan nörogenezleri incelemek için ayrıntılı protokoller sunmaktadır.

Drosophila Merkezi Beyninde Yetişkin Nörogenezini Uyarmak ve Analiz Etmek

Öğrenin, Drosophila duyu nöronu hasar modelinde iki foton lazer akzotomi ve canlı görüntüleme tekniklerini kullanarak nörorejenerasyonu nasıl araştıracağınızı. Bu yöntem, periferik ve santral sinir sistemi çalışmaları için hızlı ve uygun maliyetli bir tarama platformu sunar.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Daha fazla video keşfet