Name: Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Öğrenin farelerde kardiyak gen düzenleme için CRISPR ve rAAV ile distropin ekspresyonunu geri kazanma yöntemini. Bu teknik Duchenne kas distrofisi kardiyomiyopatisine kalıcı tedavi stratejisi sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.H. ABD Ulusal Sağlık hibe (R01HL116546 ve R01 AR064241) Enstitüleri tarafından desteklenir.

Bu protokol için kullanılan hayvanlar Ohio Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak muhafaza. Tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım, kullanım ve Ohio State Üniversitesi İnceleme Komitesi tarafından yetkili.
1. tasarım ve gRNAs CRISPR vektör içine klonlama
<ol><li>2 gRNAs dystrophin intron 20 ve intron 23 (i20 ve i23) SaCas9 için hedefleme seçin: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT ve i23: (PAM sıra altı çizili ve italik) 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT . Not: Hedef için i20 ve i23 hakkında 23 kilo baz çifti (kbp) uzak sitelerdir. Kodlama bir gen bozmaya, SaCas9 için iki gRNAs NNGRRT PAM ile ortak ekzonlar hedefleme sıra (tercihen NNGAAT, NNGGGT ve NNGAGT) ve 20 kbp mesafesinde önerilir.</li>
	<li>Arabellek tavlama x 1 gRNA oligos (100 µmol/L) tavlamak için aşağıdaki PCR parametrelerini kullanın (0,5 mol/L K-asetat, 150 mmol/L HEPES tampon stok tavlama x 5 içerir-KOH, 10 mmol/L Mg-asetat, pH7.4): 95 ° C 10 dk 59 95 ° C 0.4 ° C ile 90 döngüleri azaltma başına döngüsü için 20 s, 59-32 ° C 20 devir başına 0.3 ° C azalma ile 90 döngüleri s, 32-26 ° C 20 devir başına 0.3 ° C azalma ile 20 döngüleri s.</li>
	<li>Tavlanmış gRNA oligos pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA ligate BsaI ve T4 DNA ligaz bir tepki olarak kullanarak (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL komplementer oligos, 1,5 µL 10 x T4 DNA ligaz tampon, 0.5 µL T4 DNA ligaz, 1 µL BsaI, 10 µL GKD2O ), PCR cycler aşağıdaki reaksiyon koşulu: [37 ° C 5 dk ve 16 ° C 10 dk]; 5 döngüleri 37 ° C 20 dk; 80 ° C 5 dk.</li>
	<li>15 µL ligasyonu ürün 30 µL yetkili hücrelere dönüşümü, agar plaka ile 100 µg/mL ampisilin ve kültür için 24 h 37 ° C'de hücrelerde plaka.</li>
	<li>5-10 kolonileri ve Kültür 100 µg/mL ampisilin 37 ° c, 3-4 h için bir shaker kuluçka 250 d/d içeren LB ortamda almak.</li>
	<li>Koloniler tarafından PCR ekran: 10 µL PCR ana mix, 8 µL GKD2O, 1 µL E. Coli kültür, 1 µL 10 µmol/L U6 ileri astar, 1 µL i20 veya i23 gRNA ters astar x 2. PCR Bisiklete binme parametreleri: 95 ° C 5 dk, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s 35 döngüleri.</li>
	<li>5 mL kültür pozitif klonların ekleyerek 4 mL taze LB orta containing100 µg/mL ampisilin ve kültür gecede 37 ° C'de, 250 d/d hazırlayın.</li>
	<li>Plazmid DNA uygun plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak ve Sanger tarafından plazmid doğrulayın U6 ileri astar ile sıralama.</li>
	<li>%10 FBS ve % 1 ile DMEM hücrelerde C2C12 kültür kalem-Strep plazmid etkinliğinin düzenleme gen testleri için ~ %70 confluency ulaşan kadar.</li>
	<li>Electroporate 5 µg SaCas9/gRNA plazmid karışımı 1:1 molar oranı 1 x 106 C2C12 hücrelere üreticinin protokolüne göre toplam.</li>
	<li>48 saat sonrası transfection sonra C2C12 hücre hasat ve genomik DNA ayıklayın.</li>
	<li>Fare dystrophin odağı için PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için kullanım 100 ng genomik DNA şablon olarak: ileri astar 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), ters astar 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x yeşil PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomik DNA () 100 ng). Kullanmak PCR Bisiklete binme koşulları 95 ° C 5 dk 35 döngüsü [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 dk.</li>
</ol>2. rAAV üretim
<ol><li>Hücre kültür için AD293 hücreleri 20-40 cm 15 cm yemekleri üzerine tohum ve %10 FBS ve % 1 ile DMEM korumak kalem-Strep ~ %90 confluency transfection için ulaşan kadar.</li>
	<li>Seyreltik 3 Plasmid'ler ile 200 µL serum Orta (çanak) başına azaltılmış: 1) 10 µg pHelper; 2) 5 µg pXR (rh.74 veya diğer serotipleri) ve 3) 5 µg karışımı pX601 i20 ve pX601-i23 (1:1 oran) toplam. Polyethylenimine (PEI) transfection 80 µL PEI ile karıştırılarak gerçekleştirmek ve 10 dk. Ekle AD293 hücre kültürleri üzerine karışımı oda sıcaklığında dropwise bir şekilde kuluçkaya.</li>
	<li>72 h sonrası transfection sonra AAV virüs üretim için medya ve AD293 hücre topakları Santrifüjü 1100 x g 10 dakika için de tarafından toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
	<li>Kuluçka sıvı azot ve 42 ° C su banyosu içinde alternatif ile 3 donma-çözülme çevrimleri ve ardından hücre topakları 15 mL rAAV lizis arabelleği (50 mmol/L Tris Bankası, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) resuspend. Hücre lysates onlar hemen işlenmeyen Eğer gelecekte işlenmesi için-80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Kültür medya 0.45 µm ile filtre ve %40 PEG8000% 8 son bir konsantrasyon için 2.5 mol/L NaCl ekleyin. 1s için 4 ° C'de karışımı ve 1100 x g, santrifüj 15dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Granül rAAV lizis arabellekte resuspend ve benzonase (50 U/mL) tedavisi için 1 h 37 ° C'de ve ardından adım 2.3, hücre lysates ile birleştirir.</li>
	<li>Karışım 1100 x g 4 ° C'de 15 dakika içeren benzonase tedavi rAAV santrifüj kapasitesi ve süpernatant (ham rAAV hazırlık) kaydedin.</li>
</ol>3. rAAV arıtma ve toplama
<ol><li>Şu sırada bir ultracentrifuge tüp iodixanol degradede üzerine Ham rAAV hazırlık en baştan altına yük: ham AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL % 15 Iodixanol, 6 mL % 25 Iodixanol, 5 mL % 40 Iodixanol, 5 mL % 58'i Iodixanol. 1 x DPBS kullanarak üst tüp boş kalan hacmi doldurun.</li>
	<li>230,000 x g ultracentrifuge Open End 120 dk 10 ° c de örnekler santrifüj kapasitesi ve 3-4 mL 18 G iğne ile rAAV parçacıkları içeren % 40 degrade fraksiyonunun toplamak.</li>
	<li>1 x DPBS ve santrifüj filtre ünitesi (MWCO 100 kDa) kullanarak santrifüj ile rAAV parçacıklar sulandırmak. İçin bu adımı yineleyin 3 - 5 kez ve nihayet rAAV hazırlık için 300-500 µL konsantre.</li>
</ol>4. rAAV Titering
<ol><li>2 konsantre µL rAAV, etanol içinde 3 M NaOAc ve resuspend 20 µL GKD2O. ile acele genomik DNA ayıklamak</li>
	<li>RAAV Nefelometri için standart eğri pX601 plazmid seri seyreltme tarafından elde edilir: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 kopya her 10 µL GKD2O. Dilute DNAase tedavi rAAV örnek olarak 1:10, 1:50, 1: 100 ve 1: 1000.</li>
	<li>QPCR seti üreticisinin yönerge göre bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak rAAV titresi nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından belirlemek: 1 µL 10 µmol/L her astar (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC ve 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL PCR ana karışımı, 1 µL seyreltilmiş x 2 rAAV örnekleri ve 2 µL GKD2O. çalıştırmak reaksiyon aşağıdaki Bisiklete binme parametrelerle: 95 ° C 3 dk, [95 ° C 5 sn ve 61 ° C 20 sn] 45 döngüleri.</li>
</ol>5. Intravenous ve rAAVrh.74-CRISPR Neonatal mdx/utrophin+ /- fareler içine mayi enjeksiyon
<ol><li>1 dk. için buz yerleştirerek mdx/utrophin+ /- fare pups (3 gün) hareketsiz ve 1 x 1012 viral parçacıkların bir retro-orbital yaklaşım veya bir mayi enjeksiyon yoluyla sistemik fare başına 50 µL ile yönetmek.</li>
	<li>Fareyi kurtarmak ve geri ev onların kafes yerleştirmek izin. On hafta sonra rAAV yönetim, fareler CO2 maruz doku koleksiyonu için ötenazi.</li>
	<li>Ek-dokular için genomik DNA ve RNA ayıklama ve kullanma isopentane en uygun kesme sıcaklık kurcalayarak cryosectioning için bileşik dondurmak için sıvı azot soğutma donma.</li>
</ol>6. sonuçlar düzenleme hedef gen analizi
<ol><li>
Genomik DNA PCR Analizi
	<ol>
<li>Mdx/utrophin+ /- fareler kalp dokuları genomik DNA ile veya olmadan rAAV tedavi toplam yalıtmak.</li>
		<li>Aynı iletişim kuralını adım 1.12 PCR çözümleme için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RT-PCR analiz dystrophin ifade
	<ol>
<li>Toplam RNA üreticisinin takip RNA ekstraksiyon kiti ile kalp dokulardan ayıklayın.</li>
		<li>Ters transkripsiyon gerçekleştirmek için önceden bir RNase free DNaz ile toplam RNA tedavi ve tedavi RNA'ın 5 µg Ters transkripsiyon kiti ile ilk iplikçikli cDNA sentezi için şablon olarak kullanmak.</li>
		<li>RT-PCR dystrophin ifade dystrophin cDNA astar ile çözümlenmesi için Ters transkripsiyon ürün kullanın: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT ve 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
QPCR analizi ile etkinlik düzenleme gene tahmin
	<ol>
<li>Tarafından kantitatif RT-PCR ileri astar (exon 21) kullanarak exon 22 içeren transkript azalma tespit etmek için etkinlik düzenleme gene tahmin: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA ve ters astar (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Gapdh bir başvuru gen ileri astar ile kullanın: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC ve ters astar: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) qPCR seti üreticisinin yönerge göre 2-adım reaksiyon koşulları ve gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak çalıştırın: 95 ° C 3 dk, 95 ° C 5 sn ve 61 ° C 30 sn 45 döngüleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ayirt dystrophin ifade analiz etmek için boyama
	<ol>
<li>Bir cryostat bir kalınlık-in 10 µm. düzeltme kullanarak donmuş doku dondurulmuş bölümleri ile 15 dakika oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde kesti.</li>
		<li>2 x PBS ile yıkama ve 1 h için çözüm (% 10 at serum) engelleme ile kuluçkaya.</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de anti-dystrophin birincil antikor kuluçkaya.</li>
		<li>PBS ile slaytlar yıkama dakika 3 x 5 ve 1 h için oda sıcaklığında floresan ikincil antikorlar (1:500) ile kuluçkaya.</li>
		<li>Montaj orta DAPI ile kullanarak ve bir ters confocal mikroskopla Imaging slaytlar bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. kapalı-hedef analiz T7E1 tahlil tarafından
<ol><li>Online CRISPR kullanarak potansiyel hedef kapalı siteleri tasarım araçları gibi tahmin < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>5-10 potansiyel hedef kapalı siteleri PCR tarafından üst kapsayan genomik bölgeleri yükseltmek: genomik DNA 200 ng, 1 µL yüksek-sadakat DNA polimeraz, 5 µL 10 x PCR arabellek karıştırmak, 1,5 µL 10 µmol/L, siteye özgü ileriye ve geriye doğru astar ile 50 µL için toplam ses düzeyini ayarlama GKD2O.</li>
	<li>PCR ürünleri Elektroforez tarafından çalıştırmak, hulâsa ve koşmak bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA arındırmak. Spektrofotometreler kullanarak toplama ölçmek.</li>
	<li>Denaturing ve yavaş yavaş bir PCR cycler kullanarak arabellek 2.1 içinde saf amplicons yeniden tavlama tarafından heteroduplex oluşumu teşvik. 1.2. adımda açıklandığı gibi aynı Bisiklet koşullarını kullanın.</li>
	<li>Yeniden tavlanmış ürünler için 0.5 µL T7E1 enzim ile 37 ° C'de 30 dk sindirmek ve reaksiyon kullanarak % 1-2 özel jel elektroforez tarafından analiz. Not: Amplicons da hedeflenen derin sıralama tarafından analiz edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+Classification+of+CRISPR-Cas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.</a> Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163, 759-771 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy.+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264(2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+genome+editing+restores+dystrophin+expression+and+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice.</a> Mol Ther. 24, 564-569 (2015).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351, 400-403 (2016).</li>
<li>Long, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345, 1184-1188 (2014).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351, 403-407 (2016).</li>
<li>Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Bengtsson, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+CRISPR%2FCas9+dystrophin+gene+editing+ameliorates+pathophysiology+in+a+mouse+model+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 8, 14454(2017).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li>
<li>Nowak, K. J., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy+and+dystrophin%3A+pathogenesis+and+opportunities+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment.</a> EMBO reports. 5, 872-876 (2004).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).</li>
<li>Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+MDA+muscle+disease+symposium+on+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).</li>
<li>Spurney, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+understanding+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions.</a> Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).</li>
<li>Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8211986">Autopsy analyses of the muscular dystrophies.</a> Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).</li>
<li>McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+in+the+therapy+of+cardiomyopathy+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy.</a> Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approvals%2C+Submission%2C+and+Important+Labeling+Changes+for+US+Marketed+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals.</a> Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28515510">Eteplirsen.</a> Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Function+in+mdx+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circ Res. 121, 923-929 (2017).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışması bulunmaktadır.

Bu protokol için biz vivo içinde kalp gen rAAVrh.74-aracılı teslim SaCas9 ve iki gRNAs kullanma Doğum sonrası farelerde düzenleme elde etmek için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak. Yukarıda belirtildiği, bu yaklaşım bizim iş27' açıklandığı gibi dystrophin ifade distrofik farelerde geri yüklemek için kullanılabilir, ancak Ayrıca hızlı ters genetik çalışmalar uzun süreci olmadan farelerde kalp ile ilgili genlerin sağlayabilirsiniz geleneksel nakavt yaklaşım oluşturmak ve nakavt fare mod...

Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa palindromik tekrar (CRISPR) teknolojisi en son ilerleme genom Mühendisliği temsil eder ve mevcut uygulama hücrelerinde ve organizmaların genetik devrim yarattı. Genom CRISPR tabanlı düzenleme kullanır CRISPR ilişkili bir endonükleaz CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) gibi yönlendirmek için tek bir rehber RNA (gRNA) ve Cpf1 protospacer için sırayla tamamlayıcı bir genomik DNA hedef için kodlanmış ile gRNA tarafından bir belirli protospacer bitişik motifi (PAM)1,2. PAM Cas9 veya Cpf1 geni bakteriyel türler bağlı olarak değişir. Streptococcus pyogenes (SpCas9) elde edilen en sık kullanılan Cas9 nükleaz sigara hedef iplikçikteki genomik DNA doğrudan hedef dizisi aşağı akım bulunur NGG PAM dizisi tanır. Hedef sitede, sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR) yolları3de dahil olmak üzere iç hücresel DNA tamir mekanizmaları tamir iki iplikçikli sonu (DSB), Cas9 ve Cpf1 proteinleri oluşturmak, 4. Homolog rekombinasyon DNA şablon yokluğunda, DSB öncelikle eklemeleri veya silmeleri (indels) ile sonuçlanabilir hataya NHEJ yolu tarafından DSB kodlama oluşturulmuşsa frameshift mutasyonlar neden nükleotit, onarılana bölge bir gen5,6. Böylece, CRISPR sistem yaygın olarak işlev kaybı mutasyonlar çeşitli hücresel modelleri ve tüm organizmalar, mühendis bir gen işlevi araştırmak amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Ayrıca, catalytically etkin olmayan Cas9 ve Cpf1 için transcriptionally geliştirilmiştir ve epigenetically hedef genlerin7,8ifade modüle.
Daha yakın zamanlarda, SpCas9 ve SaCas9 ( Staphylococcus aureustüretilmiş) Doğum sonrası gen düzeltme, insan hastalıkları, hayvan modeli için rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektörel çizimler içine paketlenmiş özellikle, Duchenne kas distrofisi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD dystrophin protein16,17-kodlar, DMD gen mutasyonlar neden bir ölümcül X'e bağlı resesif yenidoğan tarama18 göre yaklaşık bir 3500 erkek doğumlular etkileyen bir hastalıktır , 19. progresif kas güçsüzlüğü ve israf ile karakterizedir. DMD hastaları genellikle 10 ile 12 yaş ve solunum ve/veya kalp yetmezliği ölmektedir arasında 20-30 yıl20yaşına yürüyecek yeteneğini kaybetmezsin. En belirgin olarak kardiyomiyopati gelişen > %90 DMD hastaları ve DMD hastaları21,22ölüm önde gelen neden temsil eder. Her ne kadar Deflazacort (anti-inflamasyon ilaç) ve Eteplirsen (bir exon ilacı exon 51 atlama atlama) son zamanlarda DMD için gıda ve İlaç Dairesi (FDA)23,24tarafından bu tedavilerin hiçbiri onaylanmıştır genomik DNA düzeyinde genetik kusur düzeltmek. Bir nokta mutasyon exon 23 dystrophin gen taşır, mdx fare DMD modeli25yaygın olarak kullanmıştır. Ayrıca, biz daha önce fonksiyonel dystrophin ifade çerçeve silme ekzonlar 21, 22 ve 23 Kas içi reklam-SpCas9/gRNA teslim9 kullanarak mdx farelerin iskelet kasları'kapsayan genomik DNA'ın tarafından restore edilerek gösterdi ve intravenöz ve mayi rAAVrh.74-SaCas9/gRNA teslim26kullanarak mdx/utrophin+ /- fareler Kalp kaslarının.
Bu protokol için dystrophin rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vektörler, kalp kas bölümlerde dystrophin analiz gRNA tasarım kullanarak mdx/utrophin+ /- farelerde geri yüklemek için Doğum sonrası kardiyak gen düzenleme her adımı biz ayrıntılı olarak tarif.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 keçi tavşan önleyici IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz Nükleaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Biyo Güvenlik Dolapları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Serisi A2 Sınıf II, Tip A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>Yetkili hücreler</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>Hücre kültürü kapları, 150mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Distrofin antikoru</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı İyon Midi Plazmbi Kitleri</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Ünitesi, 0.45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Karışımları</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı plazmid mini kiti</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Su Banyosu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Isı Bloğu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Ters konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 cihazı</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Enstrüman II</td></tr><tr><td>Büyük Kapasiteli Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop spektrofotometreleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; i20-F Entegre DNA Teknolojileri için 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligolar</td> i20-R <td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>için CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>i23-F</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td> için Oligolar <td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>i23-R</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td> için Oligolar <td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Mühürlü santrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radyant SYBR Yeşil Hi-ROX qPCR Kitleri</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>Tip 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktif</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Ultra santrifüj filtre ünitesi</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td> <td>ile VECTASHIELD Montaj Ortamı</td></tr></tbody></table>

virüs-aracılı teslim crispr kardiyak gene farelerde düzenleme için adeno ilişkili

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa, palindromik tekrar (CRISPR) sistemi büyük ölçüde kültürlü hücrelerinde ve canlıların çeşitli türlerin genom mühendislik kolaylaştırdı. CRISPR teknoloji aynı zamanda insan hastalıkların bir dizi roman therapeutics olarak keşfedilmeyi. Kanıtı-of-concept veri tarafından fizibilite ve gen düzenleme tabanlı tedavi yaklaşımı Duchenne kas distrofisi (DMD) bir fare modeli kullanarak için etkinliği gösteren çalışmalar olarak son derece cesaret verici. Özellikle, rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) serotip rh.74 (rAAVrh.74) intravenöz ve mayi enjeksiyon Staphylococcus aureus CRISPR ilişkili protein 9 verimli bir şekilde kalp teslim (SaCas9) ve iki sağladı exon 23 fare Dmd gen mutasyona uğramış bir kodon ile genomik bir bölgeyi silmek için (gRNA) RNA'ların yol. Bu aynı yaklaşım gen-in-faiz vurmak ve ne zaman gRNA gen Kodlayıcı bölge hedeflemek için tasarlanmıştır kendi kardiyak fonksiyon postnatal farelerde çalışma için kullanılabilir. Bu protokol için rAAVrh.74-CRISPR vektör mühendis ve yüksek verimli kardiyak teslim yenidoğan farelerde elde ayrıntılı olarak gösterir.

Hedef genomik DNA bölgenin silinmesi ikna etmek için gRNAs etkinliği hücre kültürlerinde ambalaj içinde vivo çalışmalar için rAAV içine önce değerlendirilmelidir. Bu amaçla, gRNAs ve SaCas9 ifade yapıları electroporated C2C12 hücre içine ve genomik DNA PCR tarafından hedef siteleri (Şekil 1) kanat astar ile analiz edildi. ~ 500 kan basıncı kontrol hücreleri genomik DNA'ın büyük boyutları nedeniyle bir grup verir iken gen düzenleme sonucu hedef genomik DNA'ın ...

Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Bu in vivo kardiyak gen düzenleme protokolünün genel amacı, CRISPR SaCas9 ve kılavuz RNA vektörleri ile rekombinant adeno-ilişkili virüs rh. 74 kullanarak distrofik farelerin kalbinde distrofin ekspresyonunu eski haline getirmektir. Bu yöntem, gen düzenlemenin Duchenne kas distrofisi ile ilişkili kardiyomiyopatinin kök nedenini tedavi etmek için güvenilir bir terapötik strateji olup olmadığı gibi kas distrofisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniklerin temel avantajı, düzeltilmiş distrofin geninin ekspresyonunun endojen düzenleyici kontrolü altında olması ve bu kurtarma etkisinin kalıcı olmasıdır. Bu tekniğin anlamı, mutant genin düzeltilmesinin CRISPR Cas9 gen düzenleme teknolojisi ile sağlanabildiği diğer genetik hastalıkların tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem sadece distrofik kalpte distrofin restorasyonu hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda ters genetik çalışmalar için ilgilenilen geni devre dışı bırakmak için de kullanılabilir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Yandi Gao olacak. Kılavuz RNA'ların veya gRNA'ların uygun tasarımı, bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Staphylococcus aureus CRISPR ile ilişkili protein dokuz için distrofin intron 20 ve intron 23'ü hedefleyen iki gRNA seçin.Her gRNA için protospacer bitişik motif dizisinin altı çizili ve italik yazılmıştır. gRNA oligonükleotidlerini tavlamak için, 1x tavlama tamponunda gRNA oligonükleotidlerinin litresi başına 100 mikromol içeren bir reaksiyon ayarlayın. Aşağıdaki PCR parametrelerini kullanın: 10 dakika boyunca 95 santigrat derece, 20 saniye boyunca döngü başına 0,4 santigrat derece azalma ile 95 ila 59 santigrat derece 90 döngü, 20 saniye boyunca döngü başına 0,3 santigrat derece azalma ile 59 ila 32 santigrat derece 90 döngü ve 20 saniye boyunca döngü başına 0,3 santigrat derece azalma ile 32 ila 26 santigrat derece 20 döngü.Ardından, tavlanmış gRNA oligonükleotidlerini tek bir reaksiyonda CRISP vektörüne bağlamaya hazırlanın. Aşağıdakileri bir tüpe ekleyin: mikrolitre CRISPR vektörü başına bir mikrolitre 50 nanogram, bir mikrolitre tavlanmış oligonükleotid, 1.5 mikrolitre 10x T4 DNA ligaz tamponu, 0.5 mikrolitre T4 DNA ligaz, bir mikrolitre Bsal ve 10 mikrolitre çift damıtılmış su. Aşağıdaki reaksiyonu bir termocycler'da çalıştırın: beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 16 santigrat derece, 20 dakika boyunca 37 santigrat derece ve beş dakika boyunca 80 santigrat derece beş döngü.15 mikrolitrelik ligasyon ürününü 30 mikrolitre yetkin hücreye dönüştürün ve hücreleri mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren bir agar plakası üzerine yerleştirin. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kültür. Ertesi gün, agar plakasından beş ila 10 koloni seçin ve 37 santigrat derecede ve 250 rpm'de mililitre başına 100 mikrogram ampisilin içeren LB ortamında üç ila dört saat boyunca kültürleyin.Kolonileri PCR ile taramak için, her biri 10 mikrolitre PCR ana karışımı, sekiz mikrolitre çift damıtılmış su, bir mikrolitre E.coli kültürü, bir mikrolitre U6-ileri astar ve bir mikrolitre i20 veya i23 gRNA ters astar içeren reaksiyonlar hazırlayın. Aşağıdaki PCR döngü parametrelerini kullanın: Beş dakika boyunca 95 santigrat derece, ardından 30 saniye boyunca 95 santigrat derece 35 döngü, 30 saniye boyunca 61 santigrat derece ve 30 saniye boyunca 72 santigrat derece. Pozitif klonlar tanımlandıktan sonra, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren dört mililitre taze LB ortamı ekleyerek ve gece boyunca 37 santigrat derece ve 250 rpm'de kültürleyerek her pozitif klonun beş mililitrelik bir kültürünü hazırlayın.Ertesi gün, uygun plazmit ekstraksiyon kitini kullanarak plazmit DNA'sını saflaştırın. Plazmit daha sonra U6-ileri primer ile Sanger dizilimi ile doğrulanır. Plazmitlerin gen düzenleme etkinliğini test etmek için, hücreler yaklaşık% 70 birleşmeye ulaşana kadar% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiş DMEM'deki C2C12 hücrelerini kültürleyin.Üreticinin protokolüne göre bire bir molar oranda toplam beş mikrogram SaCas9/gRNA plazmit karışımını C2C12 hücrelerine elektroporate edin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, C2C12 hücrelerini hasat edin ve metin protokolünde açıklandığı gibi genomik DNA'yı çıkarın. Fare distrofin lokusu için PCR gerçekleştirmek için genomik DNA'yı şablon olarak kullanın.İleri primer, ters primer, yeşil PCR ana karışımı, çift damıtılmış su ve 100 nanogram genomik DNA içeren reaksiyonları ayarlayın. Pozitif klonları taramak için olduğu gibi aynı PCR koşullarını kullanın. Bu prosedüre başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi rekombinant adeno-ilişkili virüsü veya rAAV'yi hazırlayın.Üçüncü gün mdx fare yavrularını viral partiküllerle intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sistemik olarak uygulayın. Farelerin iyileşmesine izin verin ve onları ev kafeslerine geri koyun. rAAV uygulamasından 10 hafta sonra, farelerden doku toplayın.Genomik DNA ve RNA ekstraksiyonu için dokuları dondurun ve kriyoseksiyon için en uygun kesme sıcaklığı bileşiği ile dokuları dondurmak için sıvı nitrojen içinde soğutulmuş izopentan kullanın. Donmuş doku bölümlerini oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile beş dakika sabitleyerek immünofloresan boyama protokolüne başlayın. 15 dakika sonra, doku bölümlerini PBS ile iki kez yıkayın.Bloke edici çözelti ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, gece boyunca dört santigrat derecede anti-distrofin birincil antikoru ile inkübe edin. Ertesi sabah, slaytları PBS ile yıkayın ve daha sonra bir saat boyunca oda sıcaklığında floresan ikincil antikorlarla inkübe edin.Slaytları DAPI ile montaj ortamını kullanarak monte edin ve ters konfokal mikroskopla görüntü alın. gRNA'ların hücre kültürlerinde hedef genomik DNA bölgesinin delesyonunu indükleme etkinliği PCR ile değerlendirildi. Yaklaşık 500 baz çiftinden oluşan bir PCR ürünü, gen düzenlemesinden kaynaklanan hedef genomik DNA'nın başarılı bir şekilde silindiğini gösterirken, kontrol hücrelerinin bir bant vermemesi gerekir.Hücre kültürlerinde gRNA'ların etkinliği doğrulandıktan sonra, gRNA'lar rAAV'ye paketlenir. rAAV viral partikülleri saflaştırılır ve saflık SDS-PAGE tarafından analiz edilir. Üç kapsid proteinine karşılık gelen sadece üç bandın varlığı, yüksek saflığı gösterir.AAV SaCas9 gRNA ile tedavi edilen vahşi tip, mdx ve mdx farelerin kalp bölümlerinin bu temsili immünofloresan görüntüleri, sistemik olarak AAV SaCas9 gRNA'nın distrofik farelerde distrofin ekspresyonunu geri yüklediğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, rAAV rh kullanarak doğum sonrası farelerde in vivo kardiyak gen düzenlemelerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. SaCas9 ve gRNA'ların 74 aracılı iletimi.

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, fare yavrusunda rekombinant adeno ilişkili virüs bazlı gen iletimini gösteriyoruz. Bu yöntem, hedeflenen hücrelerde gen ekspresyonunun incelenmesine yardımcı olur.

Rekombinant Adeno İlişkili Virüs Temelli Gen Dağıtımı: Kemirgen Modelinde Transgen Teslimi ve Kardiyak Spesifik İfade İçin Bir Teknik

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Bu makalede, fare kalbindeki gen ekspresyonunu manipüle etmek için rekombinant adeno-ilişkili virüs 9 (rAAV9) vektörlerini hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Neoplazi anlayışı için baş ve boyun kanseri hastalarında mutasyona uğramış spesifik genler ile murine modellerinin geliştirilmesi gereklidir. Burada, belirli genomik değişikliklerile murine HNC hücre hatları oluşturmak için adeno-ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanarak primer minür dil hücrelerinin in vitro dönüşümü için bir protokol salıyoruz.

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

Bu protokolde, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sisteminden yararlanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürleri açıklıyoruz. Açıklanan adımlar, sgRNA'ların tasarımını, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanmasını ve AAV'nin BAT loblarına mikroenjeksiyonunu içerir.

Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi

Bu protokol, genetiği değiştirilmiş sıçan modelleri üretmek için optimize edilmiş bir yaklaşım sunar. Adeno-ilişkili virüs (AAV), bir DNA onarım şablonu sunmak için kullanılır ve elektroporasyon, 2 hücreli embriyoda genom düzenleme işlemini tamamlamak için CRISPR-Cas9 reaktiflerini iletmek için kullanılır.

CRISPR-Cas9 Adeno-İlişkili Virüs (AAV) ve 2 Hücreli Embriyo Elektroporasyonu Kullanılarak Sıçan Embriyolarının Genom Düzenlemesi

Bu rapor, fare böbreğine etkili ve güvenli gen transferi için renal pelvis yoluyla AAV vektörlerinin lokalize enjeksiyon yöntemini detaylandırmaktadır.

Adeno ilişkili virüs vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis enjeksiyonu yoluyla fare böbreğine etkili ve güvenli gen iletimi

Öğrenin farelerde kardiyak gen düzenleme için CRISPR ve rAAV ile distropin ekspresyonunu geri kazanma yöntemini. Bu teknik Duchenne kas distrofisi kardiyomiyopatisine kalıcı tedavi stratejisi sunar.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Daha fazla video keşfet