Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Bu in vivo kardiyak gen düzenleme protokolünün genel amacı, CRISPR SaCas9 ve kılavuz RNA vektörleri ile rekombinant adeno-ilişkili virüs rh. 74 kullanarak distrofik farelerin kalbinde distrofin ekspresyonunu eski haline getirmektir. Bu yöntem, gen düzenlemenin Duchenne kas distrofisi ile ilişkili kardiyomiyopatinin kök nedenini tedavi etmek için güvenilir bir terapötik strateji olup olmadığı gibi kas distrofisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniklerin temel avantajı, düzeltilmiş distrofin geninin ekspresyonunun endojen düzenleyici kontrolü altında olması ve bu kurtarma etkisinin kalıcı olmasıdır. Bu tekniğin anlamı, mutant genin düzeltilmesinin CRISPR Cas9 gen düzenleme teknolojisi ile sağlanabildiği diğer genetik hastalıkların tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem sadece distrofik kalpte distrofin restorasyonu hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda ters genetik çalışmalar için ilgilenilen geni devre dışı bırakmak için de kullanılabilir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Yandi Gao olacak. Kılavuz RNA'ların veya gRNA'ların uygun tasarımı, bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Staphylococcus aureus CRISPR ile ilişkili protein dokuz için distrofin intron 20 ve intron 23'ü hedefleyen iki gRNA seçin.

Her gRNA için protospacer bitişik motif dizisinin altı çizili ve italik yazılmıştır. gRNA oligonükleotidlerini tavlamak için, 1x tavlama tamponunda gRNA oligonükleotidlerinin litresi başına 100 mikromol içeren bir reaksiyon ayarlayın. Aşağıdaki PCR parametrelerini kullanın: 10 dakika boyunca 95 santigrat derece, 20 saniye boyunca döngü başına 0,4 santigrat derece azalma ile 95 ila 59 santigrat derece 90 döngü, 20 saniye boyunca döngü başına 0,3 santigrat derece azalma ile 59 ila 32 santigrat derece 90 döngü ve 20 saniye boyunca döngü başına 0,3 santigrat derece azalma ile 32 ila 26 santigrat derece 20 döngü.

Ardından, tavlanmış gRNA oligonükleotidlerini tek bir reaksiyonda CRISP vektörüne bağlamaya hazırlanın. Aşağıdakileri bir tüpe ekleyin: mikrolitre CRISPR vektörü başına bir mikrolitre 50 nanogram, bir mikrolitre tavlanmış oligonükleotid, 1.5 mikrolitre 10x T4 DNA ligaz tamponu, 0.5 mikrolitre T4 DNA ligaz, bir mikrolitre Bsal ve 10 mikrolitre çift damıtılmış su. Aşağıdaki reaksiyonu bir termocycler'da çalıştırın: beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 16 santigrat derece, 20 dakika boyunca 37 santigrat derece ve beş dakika boyunca 80 santigrat derece beş döngü.

15 mikrolitrelik ligasyon ürününü 30 mikrolitre yetkin hücreye dönüştürün ve hücreleri mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren bir agar plakası üzerine yerleştirin. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kültür. Ertesi gün, agar plakasından beş ila 10 koloni seçin ve 37 santigrat derecede ve 250 rpm'de mililitre başına 100 mikrogram ampisilin içeren LB ortamında üç ila dört saat boyunca kültürleyin.

Kolonileri PCR ile taramak için, her biri 10 mikrolitre PCR ana karışımı, sekiz mikrolitre çift damıtılmış su, bir mikrolitre E.coli kültürü, bir mikrolitre U6-ileri astar ve bir mikrolitre i20 veya i23 gRNA ters astar içeren reaksiyonlar hazırlayın. Aşağıdaki PCR döngü parametrelerini kullanın: Beş dakika boyunca 95 santigrat derece, ardından 30 saniye boyunca 95 santigrat derece 35 döngü, 30 saniye boyunca 61 santigrat derece ve 30 saniye boyunca 72 santigrat derece. Pozitif klonlar tanımlandıktan sonra, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren dört mililitre taze LB ortamı ekleyerek ve gece boyunca 37 santigrat derece ve 250 rpm'de kültürleyerek her pozitif klonun beş mililitrelik bir kültürünü hazırlayın.

Ertesi gün, uygun plazmit ekstraksiyon kitini kullanarak plazmit DNA'sını saflaştırın. Plazmit daha sonra U6-ileri primer ile Sanger dizilimi ile doğrulanır. Plazmitlerin gen düzenleme etkinliğini test etmek için, hücreler yaklaşık% 70 birleşmeye ulaşana kadar% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiş DMEM'deki C2C12 hücrelerini kültürleyin.

Üreticinin protokolüne göre bire bir molar oranda toplam beş mikrogram SaCas9/gRNA plazmit karışımını C2C12 hücrelerine elektroporate edin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, C2C12 hücrelerini hasat edin ve metin protokolünde açıklandığı gibi genomik DNA'yı çıkarın. Fare distrofin lokusu için PCR gerçekleştirmek için genomik DNA'yı şablon olarak kullanın.

İleri primer, ters primer, yeşil PCR ana karışımı, çift damıtılmış su ve 100 nanogram genomik DNA içeren reaksiyonları ayarlayın. Pozitif klonları taramak için olduğu gibi aynı PCR koşullarını kullanın. Bu prosedüre başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi rekombinant adeno-ilişkili virüsü veya rAAV'yi hazırlayın.

Üçüncü gün mdx fare yavrularını viral partiküllerle intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sistemik olarak uygulayın. Farelerin iyileşmesine izin verin ve onları ev kafeslerine geri koyun. rAAV uygulamasından 10 hafta sonra, farelerden doku toplayın.

Genomik DNA ve RNA ekstraksiyonu için dokuları dondurun ve kriyoseksiyon için en uygun kesme sıcaklığı bileşiği ile dokuları dondurmak için sıvı nitrojen içinde soğutulmuş izopentan kullanın. Donmuş doku bölümlerini oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile beş dakika sabitleyerek immünofloresan boyama protokolüne başlayın. 15 dakika sonra, doku bölümlerini PBS ile iki kez yıkayın.

Bloke edici çözelti ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, gece boyunca dört santigrat derecede anti-distrofin birincil antikoru ile inkübe edin. Ertesi sabah, slaytları PBS ile yıkayın ve daha sonra bir saat boyunca oda sıcaklığında floresan ikincil antikorlarla inkübe edin.

Slaytları DAPI ile montaj ortamını kullanarak monte edin ve ters konfokal mikroskopla görüntü alın. gRNA'ların hücre kültürlerinde hedef genomik DNA bölgesinin delesyonunu indükleme etkinliği PCR ile değerlendirildi. Yaklaşık 500 baz çiftinden oluşan bir PCR ürünü, gen düzenlemesinden kaynaklanan hedef genomik DNA'nın başarılı bir şekilde silindiğini gösterirken, kontrol hücrelerinin bir bant vermemesi gerekir.

Hücre kültürlerinde gRNA'ların etkinliği doğrulandıktan sonra, gRNA'lar rAAV'ye paketlenir. rAAV viral partikülleri saflaştırılır ve saflık SDS-PAGE tarafından analiz edilir. Üç kapsid proteinine karşılık gelen sadece üç bandın varlığı, yüksek saflığı gösterir.

AAV SaCas9 gRNA ile tedavi edilen vahşi tip, mdx ve mdx farelerin kalp bölümlerinin bu temsili immünofloresan görüntüleri, sistemik olarak AAV SaCas9 gRNA'nın distrofik farelerde distrofin ekspresyonunu geri yüklediğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, rAAV rh kullanarak doğum sonrası farelerde in vivo kardiyak gen düzenlemelerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. SaCas9 ve gRNA'ların 74 aracılı iletimi.