Name: Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin, C2C12 myotüplerinde trans-plazma membran elektron taşımasını spektrofotometrik yöntemlerle gerçek zamanlı izlemeyi. Bu teknik, hücrelerin redoks dengesini anlamak için redoks biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino ve Neej Patel ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Jonathan Fisher için Amerika Birleşik Devletleri halk sağlığı hizmet Ödülü R15DK102122 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları (NIDDK) tarafından desteklenmiştir. El yazması içerik sadece yazarlar sorumludur ve mutlaka NIDDK veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Not: Resim 1 anahtar adımlar şematik bir bakış için bkz:.
1. WST-1 azaltma tahlil
<ol><li>Standart hücre kültür yordamlar7 satır A-f kullanan bir 96-şey tabak içinde kullanarak C2C12 yapışık hücreleri ayırt etmek ve büyümek<ol>
<li>İn Dulbecco'nın modifiye kartal orta (%2 at serum, 100 U/mL penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM) oluşan bir farklılaşma aracı kullanın. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
		<li>TPMET askorbat katılımı izlerken, farklılaşma medya 100 µM askorbik asit ile ek. Hücre farklılaşması medya ~ 24-48 için kuluçkaya izin h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hisse senedi WST-1 ve PMS çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Bir 10 mM hisse senedi WST-1 yapmak için WST-1 0,033 g dağıtılması (formül ağırlık (FW): 651.34 g/mol) 5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS). 4 ° C'de mağaza</li>
		<li>PMS 5 mM stokunun yapmak, PMS 0.0023 g dağıtılması (FW: 306.34 g/mol) 1,5 ml deiyonize H2O (diH2O). -20 ° C'de depolayın ve ışıktan korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İçin PBS veya HEPES 11,4 ml 5 mM son bir konsantrasyon arabelleğe alınmış serum glikoz 0.0108 g ekleyin (HBS; 20 mM HEPES sodyum tuz, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). 10 mm WST-1 400 µM son bir konsantrasyon ve 5 mm PMS 20 µM son bir konsantrasyon için 48 µL için 480 µL ekleyin.</li>
	<li>TPMET askorbat katılımı izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için Ekle diH2O 6 µL ve diğer aliquot olarak 2 kU/mL AO 2 U/mL nihai bir konsantrasyon için 6 µL ekleyin.</li>
	<li>TPMET katılımı süperoksit izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için 0,1 M KPO4 arabelleği 55 µL ekleyin ve diğer aliquot 6.5 kU/ml SOD 60 U/mL nihai bir konsantrasyon için 55 µL ekleyin.</li>
	<li>PBS hücrelerle yıkayın. Medya Aspire edin ve 150 µL PBS ekleyin. O zaman PBS Aspire edin. Not: Kaplama, ekli hücrelerle tahlil yapılır. Böylece, hiçbir aralıklarla veya tripsin yıkama işleminin kullanımı olduğunu.</li>
	<li>WST-1 çözüm (-) 100 µL eklemek SOD veya (-) AO sütunlara 1-6 ve 100 µL WST-1 çözüm (+) SOD veya (+) AO 96-şey plaka 7-12 sütuna ekleyin. G ve H satır arka plan denetimleri kullanın (değişikliği izlemek içinYani, Wells hücreleri olmadan tek başına reaktif Absorbans içinde).</li>
	<li>438, 1 h için her 10 min Spektrofotometre kullanarak Absorbans değerleri ölçmek nm.</li>
	<li>Okuma sonra medya Aspire edin ve her yıkama PBS 150 µL ile iyi. O zaman PBS Aspire edin.</li>
	<li>Her şey için Absorbans değişimi Absorbans için o kadar iyi herhangi bir zamanda noktada bir kuyudan için ilk Absorbans çıkararak hesaplar. Bu değişiklik arka plan wells (Yani, wells ile tahlil çözüm ama hiçbir hücre) gözlenen Absorbans (varsa) yapılan değişikliğin düzeltin.</li>
	<li>Analiz için 60 dk kontrol ölçüm Absorbans verileri normalleştirmek veya wells PBS veya HBS ile yıkayın ve bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil gerçekleştirin.</li>
	<li>2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) standart Ekle (aralığı 0.5-2 hücreleri izdiham derecesine bağlı olarak standart Curve µL) boş wells için (satır G ve H), sonra BCA reaktif için bütün wells ekleyin..</li>
	<li>Nmol protein µg başına WST-1 azaltılması yoluyla veri ölçmek. 37 mM-1 cm-1 22 tükenme katsayısı azaltılmış WST-1'de 438 kullanmak nm.</li>
</ol>2. DPIP azaltma tahlil
<ol><li>Büyümek ve C2C12 yapışık hücreleri ile aynı prosedürü adım 1.1 olarak ayırt etmek.</li>
	<li>Hisse senedi 10 mM DPIP çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. DPIP 0,029 g dağıtılması (FW: 290.08 g/mol) diH2O. Onayla 600 Absorbans ölçme tarafından DPIP konsantrasyonu 10 ml nm bir Spektrofotometre ile. 1 mM-1 cm-1 23 tükenme katsayısı azaltılmış DPIP 600 kullanmak nm. 4 ° C'de mağaza</li>
	<li>0.0108 g glikoz PBS 11.880 mL 5 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. 10 mm DPIP 100 µM son bir konsantrasyon için 120 µL ekleyin.</li>
	<li>TPMET askorbat katılımı izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için Ekle diH2O 6 µL ve diğer aliquot olarak 2 kU/mL AO 2 U/mL nihai bir konsantrasyon için 6 µL ekleyin.</li>
	<li>TPMET katılımı süperoksit izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için 0,1 M KPO4 arabelleği 55 µL ekleyin ve diğer aliquot 6.5 kU/ml SOD 60 U/mL nihai bir konsantrasyon için 55 µL ekleyin.</li>
	<li>Medya Aspire edin ve PBS 150 µL hücrelerde yıkayın. PBS Aspire edin ve DPIP çözüm (-) 100 µL eklemek SOD veya (-) AO sütunlara 1-6 ve 100 µL DPIP çözüm (+) SOD veya (+) AO 96-şey plaka 7-12 sütuna ekleyin. Arka plan denetimleri satır G ve H kullanarak (değişikliği izlemek içinYani, Wells hücreleri olmadan tek başına reaktif Absorbans içinde).</li>
	<li>600 nm kullanarak Absorbans ölçmek Spektrofotometre her 10 min için 1 h Absorbans 60 dk adımlara 1.9-1,13 benzer denetime göre değişiklik ölçmek.</li>
</ol>3. düşük elektron alıcısı yüzeylerde AO veya SOD için olup belirlenmesi
<ol><li>PBS veya HBS 5.436 mL için 10 mm WST-1 400 µM son bir konsantrasyon ve 5 mm PMS 20 µM son bir konsantrasyon için 24 µL için 240 µL ekleyin.<ol>
<li>DPIP için 10 mm DPIP, 100 µM, son bir konsantrasyon için 60 µL PBS veya HBS için 5.940 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her bir düz-alt 96-şey plaka yokluğunda hücreleri, iyi ve 438, Spektrofotometre Absorbans ölçmek için çözüm 100 µL eklemek için DPIP için WST-1 veya 600 nm nm.</li>
	<li>10 mM askorbat 1 µL kuyular için 100 mikron son bir konsantrasyon yarısını ekleyin. Onu stabilize kadar Absorbans izlemek.</li>
	<li>İstikrar, üzerine 200 U/mL AO 1 µL 2 U/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için veya 60 U/mL her son bir konsantrasyon iyi ve 1 h Absorbans izlemek için 6 kU/ml SOD 1 µL ekleyebilirsiniz.</li>
</ol>

<ol><li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li>
<li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li>
<li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US8239207">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li>
<li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li>
<li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01279296">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li>
<li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89(2017).</li>
<li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li>
<li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li>
<li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li>
<li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2%2B+as+second+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li>
<li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho%280%29HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).</li>
<li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li>
<li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+oxygen+consumption%3A+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li>
<li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li>
<li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li>
<li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals%3A+functional+significance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane%2C+Cell+Surface%2C+and+Serum+NADH-Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li>
<li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb1958/41/6/41_6_1118/_article">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+New+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2%2C6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).</li>
<li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+%28WST-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li>
<li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li>
<li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+%28phenazine+methosulfate%29+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li>
<li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li>
<li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0,22&cluster=5895405450791166684">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt%2C+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan%3A+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li>
<li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+%28PI3K%29+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li>
<li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+%28B-CPAP%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thyroid+research%22%5BJournal%5D)">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li>
<li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li>
<li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li>
<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz hücre dışı elektron alıcısı, WST-1 ve DPIP, C2C12 myotubes tPMET izlemek için spektrofotometrik deneyleri içinde kullanmak için iki yöntem sundu. Spektrofotometre plaka okuyucu ve hücre hatlarında standart kültür yordamlar büyüme ile tPMET bu elektron alıcısı basit Mikroplaka tahlil ile izlemek mümkündür. İyi iyi bir tahlil içinde WST-1 azaltma tekrarlanabilir değil ama gün-gün değişkenlik var. PBS arabellek olarak kullanan varyasyon (CV) günlük fark 0.18 ve arabellek 0,23 olduğu gibi HBS kullanan CV katsayısıdır.</p...

Saf plazma membran elektron alıcısı azaltma becerisini plazma zarı doğasında Redoks kapasitesi1sahip görünümüne yol açmıştır. Daha önce görüldü mantar, bitki ve hayvan, tPMET bir işlemi birden çok organizmalar2,3,4,5' e ortak var. Saccharomyces cerevisiae, havuç hücreleri, eritrositler, lenfositler, osteosarkom, Melanom, makrofajlar, iskelet kası ve nötrofil2,3, bu işlem özellikle gösterilmiştir 4 , 5 , 6 , 7. hücre dışı oksidanlar azaltmak için plazma zarı arasında elektron taşıma bir süreç içinde tPMET de dahil olmak üzere birçok hücresel işlevler ilgilenmektedir: hücre büyüme5,8, hücre canlılığı9, demir metabolizma10,11,12,13ve Reaktif oksijen türleri12,14,15koruma sinyalizasyon hücre. Pek çok hücresel fonksiyon tPMET'ın katılımı nedeniyle, tPMET bir dengesizlik kanser16, kardiyovasküler hastalık17, dahil olmak üzere bazı ciddi sağlık koşulları, gelişimine katkıda bulunmak olan ve metabolik Sendromu18.
Plazma zarı arasında elektron transferi izlemek için birden çok yolu vardır, ancak en çok kullanılan teknik ekstraselüler elektron alıcısı Renkölçer deneyleri ile azalma değerlendirmek için. Yaygın olarak kullanılan hücre dışı elektron alıcısı tetrazolium tuzları, DPIP, FeCN ve ferricytochrome c19,20dir. En sık kullanılan tetrazolium WST-119bilinen ikinci nesil bir tuz tuzudur. Bu bileşik Renkölçer deneyleri ilk nesil tetrazolium tuzlar, su çözünürlük21artırmak iki Sülfonat grup nedeniyle göre kullanmak kolaydır. WST-1, iki tek-elektron transferi olaylar ara elektron alıcısı 1-metoksi-phenazine methosulfate (MPM), ile birlikte azalır. Bu azalma WST-1 zayıf renkli oksitlenmiş şeklinde bir daha yoğun, sarı formazan20,22' ye değişir. WST-1 37 x 103 M-1cm-1, yüksek molar tükenme katsayısı bir yüksek tahlil duyarlılık21,22' ye lider vardır. DPIP da tPMET izlemek için bir hücre dışı elektron alıcısı olarak kullanılmaktadır. Bu DPIP extracellularly tPMET ara elektron alıcısı23,24yardımı olmadan tarafından azaltılabilir gösterilmiştir. Ara elektron alıcısı olmaması nedeniyle DPIP doğrudan WST-124aksine plazma zarı pick-up elektron olabilir. Benzer şekilde DPIP, extracellularly ferrocyanide için tPMET ara elektron alıcısı19,24yardımı olmadan düşülmesi için FeCN gösterilmiştir. WST-1 ve DPIP, FeCN bir alt tahlil duyarlılık9için önde gelen bir düşük molar tükenme katsayısı vardır. TPMET izlemek için başka bir sık kullanılan hücre dışı elektron alıcısı ferricytochrome c. WST-1, ferricytochrome c azaltma artar ara elektron alıcısı, MPM22kullanımı ile benzer olduğunu. WST-1 olsa da, ferricytochrome c yöntemi yüksek bir arka plan ve düşük molar tükenme katsayısı22nedeniyle daha az duyarlıdır.
Burada tPMET spektrofotometrik deneyleri aracılığıyla gerçek zamanlı analiz için bir yöntem mevcut. Ekstraselüler elektron alıcısı ferricytochrome c gibi diğer yaygın olarak karşılaştırıldığında olmak daha ucuz kullanılan iken her ikisi de yüksek molar tükenme katsayısı gibi WST-1 ve DPIP, hücre dışı elektron alıcısı yöntemi kullanılmıştır. Biz phenazine methosulfate (PMS) kullanılan MPM'ler yerine onlar-si olmak benzer kimyasal makyaj ve PMS çok daha az pahalı. MPM'ler uzun bir raf ömrü ihtiyacı bir ticari kiti için önemli bir özelliği olan photochemically stabil. İstikrar sorunu olmamalı böylece Ancak, biz PMS her tahlil için taze olun. Biz de hücre dışı elektron alıcısı ve daha fazla tPMET süreci karakterize için kullanılması gereken enzimler arasındaki olası enzimatik etkileşimler (bkz. şekil 1) değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Özellikle, AO ve SOD kullanılan enzimler tPMET kısmını askorbat taşıma veya hücre dışı süperoksit açıklaması, plazma zarı arasında taşınması elektron için iki yaygın yöntem nedeniyle belirlemek.

<table><tbody><tr><td>C2C12 miyoblastları</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartalın orta - düşük glikozu</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex hayvan serumu kompleksi</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Sigma</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>at serumu</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>tripsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>15 cm kültür kapları</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu kültür plakaları</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2- (4-İyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disülfofenil) -2H-tetrazolyum Sodyum Tuzu (WST-1)</td> <td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>fenazin metosülfat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>askorbat oksidaz ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>süperoksit dismutaz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dikloroindofenol sodyum tuzu&nbsp;</td><td>ICN Biyomedikal</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>potasyum fosfat</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave XI spektrofotometre</td><td>Biotek Insturments</td><td>durduruldu ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>PureGrade 96 oyuklu mikroplaka, F altlı, şeffaf, işlenmemiş, steril olmayan</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>Demir (II) klorür tetrahidrat</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>Demir (II) sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>hipoksantin</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>ksantin oksidaz</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>durduruldu&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-plazma membran elektron taşıma c2c12 myotubes ile ölçme

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plazma membran elektron taşıma (tPMET) hücre dışı oksidanlar ile hücre içi indirgeyici stres hücrelerden korunması hem de hasar koruma bir rol oynar. Bu işlem için hücre dışı oksidanlar hücre içi reductants elektron taşıma iyi tanımlanmış değildir. Burada hücre dışı elektron alıcısı kullanan tPMET izlemek için C2C12 myotubes tarafından spektrofotometrik deneyleri mevcut: suda çözünen tetrazolium tuz-1 (WST-1) ve 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP veya DCIP). Bu elektron alıcısı azaltılması, biz gerçek zamanlı analiz bu süreçte izlemek edebiliyoruz. Enzimler askorbat oksidaz (AO) ve süperoksit dismutaz (SOD) deneyleri için gibi eklenmesiyle, biz tPMET kısmını askorbat verme ya da süperoksit üretimi nedeniyle sırasıyla belirleyebilirsiniz. WST-1 düşük arka plan ile istikrarlı sonuçlar üretmek için gösterildi iken, DPIP AO ve spektrofotometrik analiz ile gösterilmiştir SOD eklenmesi sonra yeniden oksitlenmiş olmayı başardı. Bu yöntem bir gerçek zamanlı, çok iyi, hızlı spektrofotometrik tahlil tPMET, ferricyanide (FeCN) ve ferricytochrome c azaltma gibi izlemek için kullanılan diğer yöntemler üzerinde avantajları ile gösterilmektedir.

İstatistik ANOVA ile RStudio istatistiksel yazılım25kullanarak yinelenen ölçüleri ile gerçekleştirilmiştir. Örneklerin boyutu şekil efsanelerde gösterilir.
TPMET izlemek için C2C12 myotubes hücre dışı elektron alıcısı, WST-1 ve DPIP ile birlikte kullanılmıştır. AO WST-1 kısmını belirlemek için kullanılan ve DPIP azalma nedeniyle askorbat sızma ve SOD WST-1 azaltma kısmını ekstraselüler süperoksit yayın ne...

Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Bu prosedürün genel amacı, spektrofotometrik tahliller yoluyla trans-plazma membran elektron taşıma sürecini gerçek zamanlı olarak izlemektir. Bu yöntem, radoks biyolojisi alanında, trans-plazma zarı elektron taşıma mekanizması ve bir hücrenin redoks ortamının nasıl korunduğu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, testin gerçek zamanlı, çok kuyulu, hızlı spektrofotometrik bir test olmasıdır.Başlamak için, C2C-12 yapışma hücrelerini, 96 oyuklu bir plakanın A'dan F'ye kadar olan sıralarına santimetre kare başına iki kez 10 ila 4. hücrelere oturtun, ardından hücreleri büyüme ortamı ile kaplayın. Hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Kültürde 24 saat sonra, büyüme ortamını aspire edin, 150 mikrolitre PBS ile yıkayın, farklılaşma ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 ila 48 saat daha inkübe edin.Ardından, bir stok WST-1 ve PMS çözümleri hazırlayın. 033 gram WST-1'i beş mililitre PBS'de çözerek 10 milimolar WST-1 stok çözeltisi yapın. Ardından, çözeltiyi girdaplayın.Daha sonra, 0023 gram PMS'yi 1.5 mililitre iyonize su içinde çözerek PMS'nin stok çözeltisini hazırlayın. Çözümü girdap. Çalışma çözeltisini h

measuring-trans-plasma-membrane-electron-transport-by-c2c12-myotubes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP ° C. elegans

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3  örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur.  Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + 'nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Öğrenin, C2C12 myotüplerinde trans-plazma membran elektron taşımasını spektrofotometrik yöntemlerle gerçek zamanlı izlemeyi. Bu teknik, hücrelerin redoks dengesini anlamak için redoks biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Daha fazla video keşfet