Name: Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Öğrenin lomber dorsal kök gangliyon birincil kültür yöntemini, duyu nöronlarında NPFFR2 agonist uyarımına yanıt olarak nörotransmitter salınımını incelemek için. Bu teknik periferik nosisepsiyon mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. M. Calkins İngilizce düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu eser Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPD1F0482), Chang Gung Üniversitesi, sağlıklı yaşlanma Araştırma Merkezi (EMRPD1G0171) ve Bakanlığı Bilim ve teknoloji (105-2320-B-182-012-MY2) tarafından desteklenmiştir.

Deneysel hayvan kullanan burada açıklanan tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi (IACUC) Chang Gung Üniversitesi (CGU 13-014) tarafından kabul edildi.
1. toplamak bel DRG deneysel fareler
<ol><li>2 3 haftalık Sprague-Dawley (SD) fareler için bel DRG koleksiyon için kullanmak. Not: 4 haftadan sıçanlarından emir toplanan DRG nöronlar de burada açıklanan kültür koşullar altında büyümek değil.</li>
	<li>Bir Otoklav içinde tüm cerrahi aletler sterilize.</li>
	<li>Tiletamine ve zolazepam (20 mg/kg; mayi enjeksiyon (IP)) 1:1 karışımı fareyle anestezi ve hayvan ayak-çekilme yanıt bir ayak parmağı-çimdik testinde gösterir kadar bekleyin. Not: Farklı anestezi stratejiler başarılı bir şekilde bu protokol için kullanılabilir.</li>
	<li>Fareyi işten çıkarma tarafından ticari bir giyotin ile kurban.</li>
	<li>Giyotin fareyi forelimb ve uyluk kemiği arasında vücut bagajında belirlemek için kullanın. Şekil 1A tahsil edilecek bölgenin bir diyagram için bkz. Not: Kaudal kesme hattı femur sadece rostral olmalıdır. Kesme Makinası spinal sütunda çok yüksekse eksize bel L6 DRG.</li>
	<li>Göğüs kemiği kesmek ve tüm organları/doku diseksiyon makası ile (Şekil 2A-bir) kaldırın.</li>
	<li>Fareyi dorsal parçası toplamak ve deri kaldırmak için bagajı kenarı boyunca kesin. Şekil 1B disseke dorsal gövde bir fotoğraf için bkz.</li>
	<li>Buz üzerinde doku DRG toplama önce hazırlayın. Kürk ve eldiven kan temiz ve onları bir sonraki adıma devam etmeden önce % 75 etanol ile sterilize.</li>
	<li>Lomber kapsayan kasları kaldırın. İlk olarak, omurga (sol ve sağ) kenarlarında iki kesim ve lomber rostral ölçüde işaretlemek için bir yan kesim yapmak. O zaman, sırt kasları omurga kemik kesme forseps (Şekil 2A-b) kaldırın.</li>
	<li>Kemik kesme forseps ile vertebra sırt kısmını kaldırmak ve omuriliğe bulaşmasına neden.</li>
	<li>Omurilik diseksiyon makası (Şekil 2A-c) ve forseps (Şekil 2A-d) kaldırın.</li>
	<li>Lomber DRG omurga üzerinden son kaburga (torasik Vertebra 13) sayarak tanımlayın. Şekil 1 c bir vertebra pozisyonları için bkz: diyagramı.</li>
	<li>Mikro-makas (Şekil 2A-f) ile ikili bel DRG (L1-L6) 2 mL buz gibi serum-Alerjik orta ile bir 35 mm Kültür çanak içine toplamak. DRG bağlanmasını nöronal lifleri ( Şekil 1 ciçinde belirtildiği gibi) kaldırın, sonra saflık kültürlerin geliştirmek için kültür çanak içine aktarmak. Not: Toplanan DRG orta yaklaşık 1 h için buz üzerinde tutulabilir. Bu arada, birden çok fareler DRG daha büyük bir havuzu oluşturmak için ötenazi.</li>
</ol>2. birincil kültür sıçan kereste DRG
Not: Aşağıdaki adımları bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>Kültür % 10 fetal Sığır serum, 100 mM sodyum pyruvate ve 1 x penisilin/streptomisin 1 içeren orta hazırlamak DMEM-F12 x.</li>
	<li>Kat hücre kültürü ile 200 µg/mL poli-L-lizin için 2 h 24-şey plaka sonra steril su ile yıkama tedavi.</li>
	<li>1 mL kültür orta kullanım için en az 30 dk önce 37 ° C CO2 kuluçka ile kültür çanak önceden kuluçkaya.</li>
	<li>DRG içeren 35 mm çanak laminer kukuIeta aktarmak ve DRG serum-Alerjik orta ile 3 kez pipet ile yıkayın. Not: Kapağın aktarmadan dış yemeğin % 75 etanol ile temizlenmelidir. 35 mm çanak DRG fareler (Bu deneysel tasarım taleplerine göre değişir) bir dizi içerebilir.</li>
	<li>DRG hareket (tek bir sıçan gelen veya birden çok sıçanlarından emir kombine) yeni bir 35 mm Kültür çanak, hangi steril cımbızla (Şekil 2A-e) collagenase türü IA 2 mL (1 mg/mL serum-Alerjik orta) içerir. Not: Collagenase çözüm 0,22 µm şırınga filtreden geçirilerek sterilize.</li>
	<li>37 ° C CO2 kuluçka için 30 dk collagenase çözümünde DRG sindirmek.</li>
	<li>Collagenase çözümü kaldırmak ve yıkama DRG 3 kez 2 ml Hank'ın dengeli tuz solüsyonu (HBSS). Not: Artık lifler veya DRG çözüm içine gel dokuları olabilir. Onları pipet yıkama solüsyonu ile çıkarın.</li>
	<li>2 mL % 0.05 tripsin-EDTA DRG içeren 35 mm çanak ve Özet DRG 37 ° C CO2 kuluçka için 30 dk önceden ısınmış ekleyin.</li>
	<li>DRG içeren çözüm 2 mL Cam Pipet tarafından 15 mL santrifüj tüpü aktarın. Not: Bu adımı bakımı ile gerçekleştirilmesi gereken bu yüzden DRG Cam Pipet sopa olabilir. Cam Pipet (yaklaşık 0.5 mL) konik sonuna DRG içeren çözüm tutmak ve çözüm yavaş yavaş santrifüj tüpüne aktarma ancak duraklatma olmadan DRG kaybı önlenebilir.</li>
	<li>Belgili tanımlık eriyik vasıl 290 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın ve DRG resuspend için başka bir 2-mL serum-Alerjik orta ekleyin.</li>
	<li>2.10 2 kere ama değişiklik önceden ısıtılmış kültür ortamına serum-Alerjik orta son zamanında adımları yineleyin.</li>
	<li>El ile yaklaşık 60 kez alev cilalı Pasteur pipet kullanarak DRG triturate (uzunluk 230 mm ve ipucu baş iç çapı 1 mm). Bir fotoğraf için bir sigara cilalı pipet alev cilalı Pasteur pipet deliği karşılaştırma için 2B anlamaya görmek. Not: İç alev cilalı Pasteur pipet çapı yaklaşık % 10 kontrol pipet daha küçük ve konik sonuna içini daha yumuşak olmalıdır. Kabarcıklar hücreleri triturating zaman yaratmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>Poli-L-lizin-boyalı çanak CO2 kuluçka kaldırın. Çanak inkübe kültür ortamından Aspire edin ve boyalı çanak üzerine Disosiye hücreleri temel olarak belirler.</li>
	<li>Bir fare (ikili koleksiyonundan L1-L6, 12 toplam DRG için) DRG hücrelerden bir 24-şey plaka dört kuyu tohum; 24-şey plaka bir kuyuda yaklaşık 5 x 104 hücreleri vardır. Not: Bu yoğunluk serbest CGRP veya SP tespiti için uygun ve immunostaining için de uygundur. Western blot ya da RNA çıkarma, bir fare (ikili L1-L6) DRG hücrelerden bir 6-şey plaka bir kuyunun içine tohum.</li>
	<li>Eski yerine koymak ertesi gün 10 µM cytarabine (Ara-C) ilavesi ile kültür orta ve 100 ng/mL NGF ve orta iki günde bundan sonra yenileyin. Not: torasik omurga toplanan olduysanız torasik DRG da aynı zamanda bu iletişim kuralı tarafından kültürlü.</li>
</ol>3. transfection NPFFR2 siRNA DRG hücrelerdeki
<ol><li>NPFFR2 siRNA transfection gerçekleştirmek ve üreticinin iletişim kuralı göre siRNA kontrol. Not: Protokol seçilen transfection reaktif kullandığımız farklı ise adapte gerekir (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>Gün 3 hücre kaplama sonra orta 0.5 mL önceden sıcak serum-Alerjik orta olarak değiştirin ve DRG 37 ° C CO2 kuluçka 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>50 ekleyin (suda 1 µL RNase free) siRNA 12.5 µL serum-Alerjik orta içine nM.</li>
	<li>2.5 µL transfection reaktif 10 µL serum-Alerjik orta ekleyin.</li>
	<li>Eriyik--dan adım 3.3 ve pipet ve bu karışık transfection kuluçkaya 3.4 tarafından çözüm oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın.</li>
	<li>Transfection çözüm bir DRG içeren 24-şey plaka ve nazik sallayarak çözüm orta ile karıştırın. Not: birden fazla kuyu transfected gerekirse, aynı anda birden çok transfection çözümü dağıtılmalıdır.</li>
	<li>DRG 37 ° C CO2 kuluçka 6 h için kuluçkaya.</li>
	<li>0.5 mL ekleyin / % 20 fetal Sığır serum, 100 mM sodyum pyruvate ve 1 x penisilin/streptomisin 1'de kültür orta içeren DMEM-F12, 10 µM Ara-C ve 100 ng/mL NGF, 24-şey plaka içine ek x.</li>
	<li>Başka bir 66 h (yenileme 48 h orta) için 37 ° C CO2 kuluçka DRG kuluçkaya.</li>
</ol>4. serbest bırakmak-in nörotransmitter birincil DRG hücrelerden
<ol><li>Gün 6 hücreler (72 h siRNA transfection sonra) kaplama sonra kültür orta 200 µL serum-Alerjik orta olarak değiştirin ve 37 ° C CO2 kuluçka 30 dk için hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>1 µL stimülasyon chemical(s) ve pipetting tarafından medya yavaşça karıştırın. 37 ° C CO2 kuluçka çanak için belirlenen zaman kuluçkaya. Not: Bu makalede, kültürlü hücreleri için 1 h NPFFR2 agonist ile dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), teşvik.</li>
	<li>Kültür orta kültür çanak ve 4 ° C'de askıya alınmış herhangi bir kirleri çıkarmak için 5 min için 5000 x g , santrifüj toplamak.</li>
	<li>Süpernatant Santrifüjü toplamak ve gerektiği gibi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), örnekleriyle sulandırmak. Enzim immunoassay (ÇED) kitleri ile nörotransmitter düzeylerini tahlil. Not: Supernatants sulandırılmış 1: 100 CGRP düzeyini analiz daha önce buradaydı. Süpernatant SP. düzeyini analiz daha önce düşürülmüştü değil</li>
</ol>5. CGRP ve SP ÇED
<ol><li>Hemen CGRP veya SP ÇED seti üreticisinin protokolüne göre örnekleri analiz. Not: Protokolü kullanılan seti bağlı olarak değişir.</li>
	<li>CGRP ÇED kuyu seti içinde sağlanan yıkama arabelleği ile 5 kere yıkayın.</li>
	<li>100 µL örnek 100 µL anti-CGRP asetilkolinesteraz (AChE) kaydedici ve CGRP ÇED kuyu ekleyip 50 µL örnekler, 50 µL anti-SP ağrısı izleyici ve 50 µL anti-SP anti-serum SP ÇED kuyu içine ekleyin.</li>
	<li>CGRP ve SP wells kitleri içinde sağlanan plastik film ile kapatın.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de wells kuluçkaya</li>
	<li>Wells CGRP ile 5 kere yıkamak veya SP arabellek yıkama ve kalıntı çözüm kuyulardan kaldırın.</li>
	<li>200 µL Ellman'ın reaktif ilgili ÇED kitleri içinde sağlanan CGRP veya SP kuyu içine ekleyin.</li>
	<li>CGRP wells, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya ve SP kuyular için oda sıcaklığında 90 dk kuluçkaya. Her iki deneyleri için ışık kuyuları koruyun.</li>
	<li>Plakayı dalga boyu 414 nm, okumak ve sonuçlarına göre ilgili ÇED enstrüman hesaplayın. Not: kuyu dibinde el ile her zaman dokunmaktan kaçının ve temizlik bezleri Ellman'ın reaktif eklemeden önce objektif tarafından iyi alttan su lekeleri temizlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBear%2C+MF+%22Neuroscience%3A+exploring+the+brain%22">Neuroscience: exploring the brain</a>. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).</li>
<li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+dynamics+of+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+neural+science%22">Principles of neural science</a>. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).</li>
<li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11557989">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li>
<li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li>
<li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperalgesia+and+allodynia%3A+peripheral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Joint+Bone+Spine%22%5BJournal%5D)">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+from+form+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li>
<li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li>
<li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Anestesiol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain%3A+an+in+vivo+and+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126(2011).</li>
<li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Reg+Anesth+Pain+Med%22%5BJournal%5D)">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li>
<li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li>
<li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li>
<li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+A+transcriptomic+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li>
<li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li>
<li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670(2015).</li>
<li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li>
<li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li>
<li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut makalede, biz toplanması, enzim-ayrılma ve sıçan lomber kültürünü göstermek DRG. NGF Nörotrofik destek ile akson DRG nöron hücre tohum sonra 3 gün içinde genişletilmiş. Hücre için hücre soma sentezlenmiş ve akson lifleri taşınan CGRP protein lekeli sonra genişletilmiş aksonlar açıkça gözlemlenebilir. Uydu da genişletilmiş, hücrelerin nöronlar gün içinde çevrelemek bölen bu Gliyal hücreler izin süreçleri. Bu iletişim kuralı tarafından yetiştirilen birincil DRG hücreleri duyusal sinir hücreleri düzenleyen hücresel m...

Duyusal sinir hücreleri hücre organlarının DRG içinde yer alır. Bu nöronlar sözde tek kutuplu ve periferik doku ve merkezi sinir sistemi innervate. Periferik sinir uçlarının duyusal nöronların kas, cilt, viseral organlar ve diğer dokularda. arasında kemik bulunur Onlar sinir uçlarının spinal dorsal boynuz ve sinyalleri sonra somatik duyu1,2farklı artan yollar aracılığıyla beyne iletilir periferik hissi sinyalleri iletmek. Somatik duyu (yani, dokunmatik, ağrı ve ısı hissi) hissediyorum ve hareket ve mekansal oryantasyon (amac duyumları)1,3algıladıkları vücut sağlar. Dört birincil afferent aksonlar da dahil olmak üzere, alt sınıflarını Grup ben proprioception iskelet kas, deri mechanoreceptors için yanıt Grup II (Aβ) lifler yanıt ve Grup III (Aδ) (Aα) lifler ve acıya yanıt Grup V (C) lifler ve sıcaklık. Diğer farklı derece myelinated sadece C lifleri unmyelinated, iken.
Nociceptors doku hasarı için potansiyel taşıyan zararlı uyaranlara (mekanik, termal ve kimyasal uyarımı) tarafından etkinleştirilen birincil duyusal sinir hücreleri vardır. Bu nöronlar myelinated Aδ lifleri ile unmyelinated C lifleri1,4oluşur. Aδ lifleri sinir büyüme faktörü (NGF, trkA reseptör), CGRP ve SP. reseptörleri hızlı C lifleri peptidergic ve peptidergic C lifleri sınıflandırılır. Öte yandan, peptidergic C lifleri reseptörleri gliyal kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF, RET ve GFR reseptörleri), isolectin IB4 ve ATP-gated iyon Kanal alt türü (P2X3)5,6,7için hızlı. Nociceptors iyon kanalları ifade tarafından seçkin ve nörotrofik faktör tarafından aktive,8sitokinler, nöropeptitler, ATP veya diğer kimyasal bileşikler. Stimülasyon, nörotransmiterler, CGRP, SP ve glutamat gibi spinal dorsal boynuz nosiseptif sinyalleri2iletimi için duyusal nöron terminallerinden serbest bırakmak. DRG sadece nöronlar oluşan değildir, aynı zamanda uydu Gliyal hücreler içerir. Uydu hücreleri duyusal sinir hücreleri çevreleyen ve mekanik ve metabolik destek9,10sağlar. İlginçtir, DRG uydu Gliyal hücreler ağrı hissi11düzenlenmesinde tutulabilir gösteren kanıt büyüyen bir gövdesi vardır.
Duyusal sinir hücreleri en sık kullanılan birincil nöronal hücre12 ve Elektrofizyoloji, sinyal iletimi ve nörotransmitter yayın çalışmaları için kullanılan rapor. Bunlar da yaygın nöronal gelişim, enflamatuar ağrı, nöropatik ağrı, cilt hissi (gibi kaşıntı) ve akson akıbet12,13,14,15hücresel mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. DRG birincil kültürler deneysel bireylerde gerçekleştirilen çalışmalar gerçekleştirmek bilim adamları sağlayan biyokimyasal değişimler tek veya birden fazla hücre değerlendirmek için Disosiye nöronlar olarak kültürlü. Son zamanlarda, DRG başarıyla kültürlü insan organ bağış hangi büyük ölçüde translasyonel araştırma16yarar olabilir. DRG explants olarak Öte yandan, duyusal sinir hücreleri de kültürlü. DRG explants nöronlar Schwann hücreleri ve uydu gliyal hücrelerini de dahil olmak üzere, özgün doku mimarisini korumak ve nöronal ve nöronal olmayan hücreleri17arasındaki etkileşimler çalışma kullanışlıdır. DRG birincil kültürler içinde 2,5 h kolayca hazırlanabilir. Özellikleri ve hücre kompozisyon kaynağı DRG yüksek oranda yansıtıcı ve bu nedenle, belirli DRG (lomber veya torasik DRG) deneysel talepleri doğrultusunda toplanabilir. Embriyonik ve neonatal DRG nöronlar kültürleri NGF hayatta kalmak ve akson akıbet teşvik istemek, ama yetişkin nöronlar kültürleri medya12,17Nörotrofik faktörler eklenmesi gerekmez. Ayrıca gibi deneysel hayvan kullanımı gerektirmeyen ND7/23 ve F11, piyasada bulunan DRG-Hibridoma hücre hatları vardır. Ancak, geçici reseptör potansiyel katyon eksikliği kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) ifade (küçük duyusal nosiseptif nöronlar için önemli bir işaretleyici) ve uyumsuz gen ifade profilleri sınırlamak onların uygulamaları18. Son zamanlarda, are lâyık ölümsüzleştirdi DRG nöronal hücre satırlarını fare (50B11)19 elde edilmiş ve fare (MED17.11)20, yüksek üretilen iş ekranları için çalışmalar hedefleme ilaç kullanın. Ancak, bu hücre satırları için profil oluşturma Gen ifadesinin henüz yapılması gerekiyor. Böylece, duyusal sinir hücreleri ölümsüzleştirdi bu hücrelere karşılaştırarak doğrulama deneyler devam etmektedir.
NPFFR2 DRG sentezlenmiş ve duyusal sinir terminallere spinal dorsal boynuz21translocated. Bu makalede, biz bel DRG hücre kültürü çalışmalarının ve onları nörotransmitter, CGRP ve SP. sürümü ikna etmek için NPFFR2 bir agonist ile tedavi için bir protokol sağlar NPFFR2 bağımlılığını daha fazla olan kültürlü DRG hücrelere transfected NPFFR2 küçük müdahale RNA (siRNA), kullanılarak test edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Tiletamin ve zolazepam karışımı (Zoletil)</td> <td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>anestezik</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>04-001-1</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>sodyum piruvat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-033-1</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>12400024</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>Poli-l-lizin</td><td>Sigma</td><td>P9011</td><td>Kaplama kabı</td></tr><tr><td>Kollajenaz IA</td><td>Sigma</td><td>9001-12-1</td><td>Enzim sindirimi</td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>Tripsin EDTA</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-051-5</td><td>Enzim sindirim</td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td>Hücre öğütme</td></tr><tr><td>Sitarabin (Ara-C)</td> <td>Sigma</td><td>C6645</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td>Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>NPFFR2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-099691-02-0005</td><td>Transfeksiyon</td></tr><tr><td>Hedeflemeyen siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-001810-10-05</td><td>Transfeksiyon</td></tr><tr><td>NeuroPORTER Reaktif</td><td>Genlantis</td><td>T400150</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>dNPA</td><td>Genemed Sentez</td><td>N/A</td><td>NPFFR2 agonisti</td></tr><tr><td>CGRP ELISA</td><td>Cayman</td><td>589001</td><td>EIA</td></tr><tr><td>SP ELISA</td><td>Cayman</td><td>583751</td><td>EIA</td></tr><tr><td>CGRP antikoru</td><td>Calbiochem</td><td>PC205L</td><td>IHC</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>IHC</td></tr></tbody></table>

dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal kök gangliyon (DRG) hücre organları duyusal sinir hücreleri içerir. Sözde tek kutuplu, çevre dokular, deri, kas ve viseral organlar yanı sıra merkezi sinir sistemi spinal dorsal boynuz gibi innervate iki aksonlar ile nöron bu türüdür. Duyusal sinir hücreleri dokunma, ağrı, termal ve amac duyumlar da dahil olmak üzere somatik duyu iletim. Bu nedenle, DRG birincil kültürler yaygın duyusuna hücresel mekanizmaları, duyusal sinir hücreleri ve sinirsel gelişim fizyolojik fonksiyonları incelemek için kullanılır. Kültürlü nöronlar Elektrofizyoloji, sinyal iletimi, nörotransmitter açıklaması, ya da kalsiyum görüntüleme ile ilgili çalışmalarda uygulanabilir. DRG birincil kültürlerle bilim adamları Disosiye DRG nöronlar tek biyokimyasal değişiklikler kültür veya birden çok hücre, birçok sınırlamaları aşmak içinde vivo deneyler ile ilişkili. Ticari olarak karşılaştırıldığında kullanılabilir DRG-Hibridoma hücre hatları veya ölümsüzleştirdi DRG nöronal hücre hatları, kompozisyon ve primer hücre özelliklerini çok daha doku duyusal nöronların benzer. Ancak, sınırlı sayıda tek bir hayvan izole olabilir kültürlü DRG primer hücre olması nedeniyle, yüksek üretilen iş ekranlar için çalışmalar hedefleme ilaç yapmak zordur. Geçerli makalede, DRG toplama ve kültür yordamları açıklanmıştır. Buna ek olarak, biz kültürlü DRG hücreleri peptid nörotransmiterler (kalsitonin gen ile ilgili peptid (CRGP) ve madde P (SP)) sürümü ikna etmek için (NPFFR2) ile bir peptit FF reseptör tip 2 agonist tedavisi göstermek.

Kültürlü bir 24-şey tabak içinde sıçan bel DRG nöronlar gliyal hücre çoğalması etkisizleştirmek için ek Ara-C ve nöronal büyümeyi desteklemek üzere NGF kültür ortamında yetiştirilmiştir. Yaşam morfolojisi DRG hücreler görülmektedir. Şekil 3' te gösterildiği gibi tek bir nöron hücre gövdesi gün 1 bir tabak dibinde bağlı ve gözlem için seçili. Axon büyüme 1 – 3 gün takip. Gliyal hücreler çoğaltılamaz ve süreçleri duyusal nöron hücre gövdesi çevreleyen genişleti...

Dorsal kök gangliyon (DRG) birincil kültürler sık fizyolojik fonksiyonları veya patoloji ile ilgili olayların duyusal sinir hücreleri incelemek için kullanılır. Burada, peptit FF reseptör yazdıktan sonra 2 stimülasyon ile seçici bir agonist nörotransmitter sürümü algılamak için bel DRG kültürler kullanımını göstermektedir.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Bu yöntem, periferik nosisepsiyon gibi duyusal araştırma alanında anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik en büyük avantajı en fizyolojik duruma simüle modeli ile duyusal nöronların hücresel mekanizma incelenmesi olduğunu. 2-3 haftalık bir sıçan ın gövdesinden lomber dorsal kök gangliyonu toplayın.Omurilik kenarları boyunca iki kesik ve lomber omurgarostral ölçüde işaretlemek için bir lateral kesim yaparak başlayın. Sonra, omurganın sırt kaslarını kaldırmak için kemik kesme forceps kullanın. Sonra, omurların sırt kısmını çıkarın ve omuriliği ortaya çıkarın.Sonra omurilik kaldırmak için diseksiyon makas ve forceps kullanın. Son kaburgadaki omurları sayarak lomber DRG'yi tanımlayın. Bu diyagram omur pozisyonlarını gösterir.L1'den L6'ya kadar 12 bilateral lomber DRG toplamak için mikro makas kullanın. Kültürün saflığını artırmak için herhangi bir bağlı nöronal lifleri kaldırın. Her lomber DRG'yi iki mililitre buz gibi serumsuz ortam içeren 35 milimetrelik bir kültür yemeğine aktarın. DRG içeren 35 milimetrelik kabı laminar kaputa aktarın ve DRG'yi pipetle üç kez serumsuz orta ile yıkayın.Steril kollajenaz tip 1A iki mililitre içeren yeni bir 35 milimetre kültür çanak

dorsal-root-ganglia-isolation-primary-culture-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada dorsal kök gangliyon kültür duyusal nöronlar için kompartman odaları hazırlanması ve bakımı tekniği açıklar.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Bu video, sıçan embriyolarından dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarını izole etmek ve olgun Schwann hücreleri oluşturmak için bunları Schwann hücre öncüleri ile birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. İzole edilen DRG'ler, nöronları ve glial hücreleri izole etmek için işlenir. İzole edilen hücreler, nöronları saflaştırmak için kültürlenir ve daha sonra bir ko-kültür ortamında Schwann hücre benzeri hücreler (SCLC'ler) ile birlikte kültürlenir. DRG nöronları ile etkileşim,...

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Bu videoda, izole fare DRG dokuları kullanılarak dorsal kök gangliyonları veya DRG eksplant kültürü ve DRG ile ayrışmış hücre modelleri geliştirmek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu modeller, kontrollü bir ortamda nöron-glial etkileşimlerle çeşitli mekanizmaların incelenmesine yardımcı olur.

Dorsal Kök Ganglion Eksplant ve Disizosiyasyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Bu video, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) nöronları toplamak için bir yöntem gösterir. Bir sıçanın omurgasından DRG izole edilir, enzimlerle muamele edilir ve daha sonra tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Nöronlar, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak glial hücrelerden ayrılır ve bir büyüme ortamında kültürlenir.

Nöronal Kültürler için Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması ve Ayrıştırılması için Bir Teknik

Bu videoda, sıçan omurgasından dorsal kök gangliyon (DRG) hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Omurgadan eksize edilen DRG'ler enzimlerle muamele edilir ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Hücreler, sırasıyla glial hücre proliferasyonunu sınırlayan ve nöronal büyümeyi destekleyen inhibitörler ve büyüme faktörleri içeren bir ortamda kültürlenir.

Bir Sıçan Omurgasından Primer Dorsal Kök Gangliyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Bu video, bir nöropeptit reseptör agonisti ile uyararak nörotransmitter salınımını incelemek için transfekte edilmiş dorsal kök ganglion hücrelerinin kullanımını göstermektedir.

Dorsal Kök Ganglion Duyusal Nöronlarının Bir Nöropeptit Reseptör Agonisti Kullanılarak Uyarılması

Bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından ekilen dorsal kök ganglionunu (DRG) hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik sağlar.

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Bu protokol, fare Dorsal Kök Gangliyonlarının (DRG) tüm mount ve ayrışmış kültürlerinin oluşturulması için yöntemleri ve bunların tümör-sinir etkileşimlerini değerlendirmek için kullanımlarını açıklar.

Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Dorsal kök ganglionları (DRG), birincil duyusal nöron hücre gövdelerini içerir ve çevresel duyusal sinyalleri omuriliğe iletir. Bu protokol, yapısal olarak sağlam gangliyonların standartlaştırılmış izolasyonunu, anatomik segmental tanımlamayı, yeni başlayanlar için sezgisel rehberliği ve prosedürel doku hasarını azaltmayı destekleyen fare DRG diseksiyon yöntemini tanımlar.

Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Diseksiyonu ve İzolasyonu

Öğrenin lomber dorsal kök gangliyon birincil kültür yöntemini, duyu nöronlarında NPFFR2 agonist uyarımına yanıt olarak nörotransmitter salınımını incelemek için. Bu teknik periferik nosisepsiyon mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Daha fazla video keşfet