Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Bu lazer mikrodiseksiyon prosedürünün genel amacı, müteakip RNA izolasyonu ve aşağı akış ekspresyon analizi için lazer yakalama mikroskobu kullanılarak fare gözlerinden yüksek oranda zenginleştirilmiş bir trabeküler ağın izolasyonu için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, oftalmoloji alanında, yanlış düzenlendiğinde oküler hastalıklara yol açabilecek önemli genler ve sinyal yollarının neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, fare gözlerinin trabeküler ağından elde edilen yüksek kaliteli RNA'nın, gen ekspresyon analizi için tekrarlanabilir şekilde izole edilebilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü lazer mikrodiseksiyon tüm protokol boyunca çeşitli sorun giderme adımlarını içeren güçlü bir tekniktir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi lazer mikrodiseksiyon için en uygun doku toplama ile başlayın. RNase dekontaminasyon solüsyonunu fırçaya, forsepslere, bağlantı kavanozlarına ve montaj aynasına püskürtün.

İyice sildikten sonra cihazı nükleaz içermeyen su ile durulayın ve kurulayın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için kriyostatı %100 etanol ile silin. Montaj aynasına az miktarda OCT sıkın, ardından doku bloğunu kalıptan çıkarın ve bloğu dikkatlice montaj aynasına yerleştirin.

Montaj aynasındaki doku bloğu katı halde donduktan sonra, kriyostatın numune tutucusuna yerleştirin. Daha sonra, kriyostatı sekiz mikronluk bölümleri kesecek şekilde ayarlayın ve doku örneğine ulaşmak için OCT bloğundan dikkatlice kesit alın. Doku gözlendikten sonra, kesit almayı bırakın.

Temiz bir tıraş bıçağı kullanarak donmuş blokları her taraftan kesin ve boya fırçasıyla tutmayı sağlamak için dokuyu çevreleyen üç ila dört milimetre OCT bırakın. Gözden kesit, hızlı çalışıyor. Slaytı 60 saniye boyunca hızlı bir tek adımlı H & E boyası ile doldurarak her üç bölümü de boyayın.

Bölümü musluk suyuyla durulayın ve havayla kurutun. Kesiti bir temizleme maddesi ile temizledikten sonra, kesiti bir kapak kızağı ile şarjlı bir cam slayt üzerine monte edin, mikroskop altında inceleyin. Lekeli bölümlerde TM belirginleşene kadar bölümlere ayırmaya devam edin.

TM görünmeye başladığında, iki bölümü kesin ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile kesim için bir harita oluşturmak üzere rutin H & E boyama için şarjlı bir cam slayt üzerine monte edin. İlk H&E harita slaytından sonra, kriyostatta sekiz mikron kalınlığında altı seri kesiti kesin ve hizalayın ve bunları aynı anda PET membran slaytına monte edin. Eldivenli bir başparmağınızı zarın arkası boyunca kısa bir süre kaydırarak dokuyu yapıştırın.

Montajdan sonra, PET membran sürgüsünü hemen kuru buz üzerindeki bir slayt kutusuna yerleştirin. Gözü bölümlere ayırmaya devam edin. Her biri altı bölümlü her iki PET membran slaytından sonra, H & E boyama için başka bir harita slaytı oluşturmak için yüklü bir cam slaytta iki bölüm toplayın.

TM artık görünmeyene kadar yaklaşık 100 seri sekiz mikron kalınlığında kesitler ayırmaya devam edin. Şarjlı bir cam slayttaki bir bölümü hızlı bir şekilde boyayarak TM eksikliğini onaylayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi H&E harita lam boyamayı gerçekleştirdikten sonra, H&E slaytlarını bir mikroskop kullanarak görsel olarak inceleyin.

Harita slaytlarını, TM ile açıkça görülebilen ve kesim için erişilebilir olarak tanımlayın. LCM için bu harita slaytları arasındaki PET membran slaytlarını kullanın. Dondurulmuş doku bölümlerini içeren slayt kutusunu eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve kuru buzun üzerine yerleştirin.

Slaytları teker teker işleyin. Slaytı hemen 30 saniye boyunca RNaz inhibitörleri içeren soğuk %75 etanol içine yerleştirerek bölümleri sabitleyin. OCT'yi doku bölümlerine müdahale etmeden çözmek için slaytı 10 ila 15 saniye boyunca nükleaz içermeyen suya hafifçe batırın.

300 mikrolitre% 1.5 kresil menekşe asetat çözeltisini doğrudan bölümlere dikkatlice pipetleyin ve oda sıcaklığında 45 saniye inkübe edin. Daha sonra bölümleri 30 saniye boyunca %75 etanol banyosuna koyarak bir kez yıkayın. Bölümlere 200 mikrolitre Eosin Y solüsyonu pipetleyin ve üç ila beş saniye inkübe edin.

Slaytları daha sonra %75 etanol, %95 etanol ve son olarak her biri 30 saniye boyunca %100 etanol banyosuna yerleştirerek dokuyu kurutun. Fazla sıvıyı çıkarmak için her adım arasında sürgünün ucunu bir mendille kurulayın. Kaydırağın altında beş dakika boyunca tamamen kurumasını bekleyin.

Kuruduktan hemen sonra LCM'yi gerçekleştirin. Son temizleme adımı için ksilen kullanmaktan kaçının. Ksilen tedavisi, doku bölümünün zar slaytına yetersiz bir şekilde monte edilmesine neden olacaktır.

Ksilen ayrıca LCM tarafından doku yakalamanın verimliliğini de azaltacaktır. PET membran slaytını, lekeli doku tarafı aşağı bakacak şekilde doğrudan mikroskop tablasına yüklenmiş yeni bir cam slaytın üzerine yerleştirin. Membran ve cam sürgünün mikroskop sahnesinde sıkıca eşleştiğinden emin olun.

Önce slayt sınırlarını ayarlayarak LCM'yi başlatın. Objektif panelinde en düşük 4X büyütmeyi seçin, ardından mikroskobun XY aşamasını, metal ve zarın birleştiği sol üst köşe canlı video akışında görünene kadar hareket ettirerek membran slaytının çalışma alanını tanımlayın. Bu noktada Limit 1 düğmesine basın ve yol haritasında kırmızı bir dikdörtgen belirecektir.

Ardından, XY aşamasını karşı köşeye taşıyın ve Limit 2 düğmesine basın. Ayarlanan sınırlar arasında zar ve dokuların yol haritası görüntüsünü oluşturmak için Tara düğmesine basın. Yol haritasındaki göz bölümlerinden birinin ÇB işaretinin yanına çift tıklayın.

TM, iridokorneal açının tepesine yakın bir yere yerleştirilebilir. TM tanımlandıktan sonra, büyütmeyi 10X'e yükseltin ve manuel olarak TM'ye odaklanın. 20X ve 40X hedeflerle tekrarlayın. TM 40X objektif ile odakta olduğunda, boş bir alana gidin, serbest çizim aracını seçin ve boş bir doku alanına uzun bir çizgi çizin.

Lazer parametrelerini, kesme hızı %34, odak %58 ve güç %70 olacak şekilde ayarlayın ve ardından Kes düğmesine basın. Net ve ince bir kesme çizgisi gözlemlenene kadar hız, odak ve güç parametrelerinde ince lazer ayarlamaları yapın. Hassas kesim için, kesme işleminin çizilen çizgiyi takip ettiğinden emin olun.

Daha sonra izolasyon tüpü kapağını kapak tutucusuna yerleştirin ve tüpü açın. Kapak tutucuyu kapak kaldırıcısına takın ve borunun ters çevrildiğinden emin olun. Ayrıca, istenen dokunun düzgün bir şekilde yakalandığından emin olmak için yapışkan kapak malzemesinin kapağın ucunun dışına taştığından emin olun.

Trabeküler ağın alındığından ve izolasyon kapağına takıldığından görsel olarak emin olmak çok önemlidir. Yazılım panelinde Manuel Diseksiyon modunu seçin. TM'nin doğrudan izolasyon tüpünün altında olduğunu dikkatlice gözden geçirin.

En iyi görüntü kalitesini elde etmek için Beyaz Dengesini ayarlayın ve Parlaklığı ayarlayın. Kesmeye başlamak için odağı manuel olarak ayarlayın ve serbest el aracını kullanarak bir çizgi çizin. Toplama kapağının yukarı konumda kaldığından ve henüz membrana dokunmadığından emin olun.

TM'nin sklera ile buluştuğu yerin yakınına kısmi daireler çizin ve Kes'e basın. İlk kesimler yapıldıktan sonra, kapağı aşağı konuma getirin ve odağı yeniden ayarlayın, ardından iki kısmi daireyi birleştirmek için açık veya boş alana iki çizgi çizin ve TM'nin etrafındaki daireyi tamamlayın. Ardından Kes'e basın ve bölümden doku toplayın. TM'nin mikrodiseksiyon kapağı tarafından alındığından emin olun.

Kapağı tekrar yukarı konuma getirin ve kalan bölümlerde tekrarlayın. Kapak konumunu, izole edilmiş tüm numuneler kapağa sığacak ve üst üste gelmeyecek şekilde hafifçe ayarlayın. Bir sonraki PET membran için yeni bir izolasyon tüpü yerleştirin ve bu bölümü tekrarlayın.

Mikrodiseke edilen TM dokusunun parçalanmasını gerçekleştirmek için, toplama tüpünün kapağına 10 mikrolitre lizis tamponunu dikkatlice pipetleyin ve lizis tamponunun mikrodiseke edilen TM'yi tamamen kapladığından emin olun. Yapışkan kapağı yavaşça kapatın ve toplama tüpünü oda sıcaklığında baş aşağı 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, iki dakika boyunca 800 g'da santrifüjleyin ve lizatı kuru buz üzerine yerleştirin. Lizatları daha sonra saflaştırma ve analiz için eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Hızla bozulan RNA, aşağı akış RNA analizini etkileyebilir. RNA kalitesi, mikroakışkan tabanlı bir platform kullanılarak ölçülmeli ve niceliklendirilmelidir. Trabeküler ağdan saflaştırılan yüksek kaliteli toplam RNA'nın gen ekspresyon analizinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir.

Lazer mikrodiseksiyondan sonra göz dokusundan kalan toplam RNA için dijital jel, sonraki aşağı akış RNA analizi için gerekli olan yüksek bir RNA bütünlük numarası gösterir. Dokudan kaliteli RNA çıkarıldıktan sonra, mikro dizi, RNA-Seq ve qPCR gibi aşağı akış analizi yapılabilir. Burada, LCM ile toplanan RNA'dan trabeküler ağ ile ilişkili genlerin, miyosilin ve ACTA2'nin ekspresyonunu analiz etmek için kantitatif dijital PCR analizi kullanıldı.

Mikro dizi analizinden elde edilen verilerden elde edilen ısı haritası ile bu tekniğin, vahşi tip farelerin ve yüksek GİB fenotipine sahip nakavt farelerin trabeküler ağındaki gen ekspresyonu değişikliklerini anlamak için kullanılabileceği gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa biyolojik hayvan başına bir gün gibi kısa bir sürede yapılabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü ilgilenilen hücrelerin görselleştirilmesinin zorluğu ve bu benzersiz numuneler için standartların olmaması nedeniyle lazer mikrodiseksiyon adımlarının öğrenilmesi zordur.

Yetenekli operatöre güvenmek çok önemlidir. Bu prosedürü denerken, küçük miktarlarda dokudaki RNA'nın hızla bozulabileceğini hatırlamak önemlidir. Ekipmanın RNase'den dekontamine edilmesi, hava maruziyetinin en aza indirilmesi ve dokunun soğuk tutulması gibi önlemler alınmalıdır.

Bu yöntem, artan göz içi basıncının trabeküler ağa özgü gen ekspresyonu üzerindeki etkileri hakkında fikir verebilse de, artmış göz içi basıncının neden olduğu retinadaki gen ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, yüksek göz içi basıncına sahip farelerin trabeküler ağında hangi sinyal yollarının değiştirildiği gibi ek soruları yanıtlamak için RNA-Seq veya mikro dizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların fare modellerinde trabeküler ağ örgüsündeki gen ekspresyonu değişikliklerini daha etkili bir şekilde incelemelerinin yolunu açtı.