Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Bu yöntem, kanser de dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlarda endotel plastisite mekanizmaları gibi vasküler ve kanser biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, in vitro EndMT'nin sağlam indüksiyonunun, TGF-in MS-1 endotel hücreleri ile tedavi edilerek gerçekleştirilmesidir. İlk olarak, MS-1 hücrelerini standart kültür koşullarında büyütün ve kültürün birleşmesini önleyin.

Daha sonra, 10 cm'lik bir tabakta, MS-1 hücrelerini 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Daha sonra plakaya 1 mL tripsin ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Daha sonra, ayrılma için tripsinli hücrelere 9 mL kültür ortamı ekleyin.

Daha sonra tripsinizli hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 ila 400 x G'de santrifüjleyin. Ardından, canlı hücrelerin sayısını saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.

Daha sonra MS-1 hücrelerini uzun süreli kültür için kaplanmamış standart kültür plakaları üzerine yerleştirin. 24 saat sonra, endotel hücrelerini mililitre TGF-2 başına 1 ng'lik bir nihai konsantrasyonla uyarın. Daha sonra kültür plakasını 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.

48 saatlik tedaviden sonra, ortamı TGF-2 içeren taze, önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin Aşağı akış analizi için, MS-1 hücrelerini jelatin ile önceden kaplanmış 8 oyuklu bir kültür odası lamı üzerine yerleştirin. 24 saat sonra, hücre kültürüne 10 M ROCK inhibitörü ekleyin. Bir saat sonra, endotel hücrelerini mililitre TGF-2 başına 1 ng'lik bir nihai konsantrasyonla uyarın.

Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. 72 saatlik bir kültür için, eski besiyerini 48 saat sonra taze TGF-2 içeren besiyeri ile değiştirin. Bir günlük TGF tedavisinden sonra, ortamı çıkarın.

Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ve fosfat tamponlu salin ile sabitleyin. Sabitleme süresi bittikten sonra, hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile durulayın. Daha sonra hücreleri% 0.2 Triton X-100 ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, hücreleri üç kez 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile tekrar durulayın. Üç yıkamadan sonra, hücreleri seyreltilmiş floresan fallotoksin içeren bloke edici tampon ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyon sonrası, hücreleri üç kez 1x fosfat tamponlu salin ile yıkayın.

Daha sonra hücre çekirdeklerini siyanin nükleik asit bağlayıcı boya kullanarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca boyayın. Beş dakika sonra sürgüyü durulayın ve sürgü montaj ortamını kullanarak sürgüye bir kapak sürgüsü monte edin. Hücreleri konfokal mikroskop altında gözlemleyin.

Hücreler, TGF-2 tedavisi üzerine kalın stres liflerinin yeniden düzenlenmesini gösterir. Bu, TGF-2'nin endotel hücrelerinde EndMT'yi indüklemedeki gücünü gösterir. 72 saatlik TGF-2 işleminden sonra, ortamı atın ve hücreleri beş dakika boyunca 0,5 ila 1 ml% 50 soğuk metanol ve% 50 aseton ile sabitleyin.

Daha sonra hücreleri 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez durulayın. Üç yıkama tamamlandıktan sonra, hücreleri karanlıkta gece boyunca 4 santigrat derecede bloke edici tamponda birincil antikorlarla inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri tekrar 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın.

Daha sonra hücreleri, karanlıkta bir saat boyunca bloke edici tamponda VE-kaderine yeşil boya konjuge ikincil antikor ile inkübe edin. Hücreleri tekrar 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücre çekirdeklerini siyanin nükleik asit bağlayıcı boya kullanarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca boyayın.

Beş dakika sonra sürgüyü durulayın ve sürgü montaj ortamını kullanarak sürgüye bir kapak sürgüsü monte edin. Daha sonra hücreleri konfokal bir mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler, 48 ila 72 saat boyunca TGF-2 tedavisi üzerine VE-kaderin ekspresyonunun azaldığını ve düz kas aktin ekspresyonunun arttığını gösterir.

Kollajen jel kasılma testinden önce, MS-1 hücrelerini 72 saat boyunca TGF-2'nin varlığında ve yokluğunda kültürleyin. Daha sonra tip 1 kollajen jeli buz üzerinde hazırlayın. Daha sonra 800 l kollajen jel çözeltisini 200 mL kontrol veya TGF-2 ile muamele edilmiş endotel hücreleri ile karıştırın.

Daha sonra, 12 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna bu karışımdan 1 mL ekleyin. Jelin 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika katılaşmasına izin verin. Jelin katılaşmasından sonra, jeli yüzdürmek için% 10 fetal buzağı serumu, mililitre başına 50 birim penisilin ve mililitre başına 50 g streptomisin içeren 1 mL MEM Alpha ekleyin.

Daha sonra jeli kuyu duvarından ayırın ve yüzen jeli 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, bir tarayıcı kullanarak jelin görüntülerini plakanın altından tarayın. 72 saat boyunca TGF-2 tedavisine maruz kalma nedeniyle hücreleri parke taşından mezenkimal iğ şeklindeki mimariye dönüştüren belirgin morfolojik değişiklikler görülebilir.

İlginç bir şekilde, 48 ila 72 saat boyunca TGF beta 2 tedavisi, MS-1 hücrelerinde düz kas aktininin hem mRNA hem de protein ekspresyon seviyelerinde bir artış gösterir. Jel kasılma testi ayrıca TGF-2 tedavisi üzerine kollajen tip 1 jelin önemli ölçüde kasıldığını gösterir. İlginç bir şekilde, TGF-2'nin yoksunluğu düz kas aktinini bazal seviyeye düşürür ve hücreler parke taşı morfolojisine devam eder, bu da EndMT'nin dinamik bir süreç olduğunu gösterir.

Aslında, MS-1 hücrelerini kullanarak LNA mikroRNA inhibitörü tarafından mikroRNA 31'in inhibe edilmesi, mezenkimal belirteçlerin indüksiyonunu zayıflatır. Bununla birlikte, inhibitör, Fibronektin 1, PAI-1 ve Smad 7 gibi TGF hedef genlerinin indüksiyonunu etkilemez. Bu prosedürü takiben, EndMT'deki spesifik gen ve mikroRNA işlevi gibi ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyonu, knockdown veya mikroarray modülasyonu gibi bir yöntem gerçekleştirilebilir.