Name: Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Keşfedin, Shewanella oneidensis MR-1 bakterilerinde ekstraselüler elektron taşıma kinetiğine proton taşımanın katkısını değerlendirmek için döteryum kinetik izotop etkisi yöntemini. Bu protokol, canlı hücrelerde elektron transfer mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser mali özel olarak terfi araştırma--dan Japonya toplum için bilim promosyon (JSP'ler) KAKENHI Grant sayı 24000010, 17 H 04969 ve JP17J02602, bizi Office, deniz araştırma Global (N62909-17-1-2038) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir. Y.T. JSP'ler araştırma görevlisi ve önde gelen lisansüstü okulları (hak) için Program sayesinde JSP'ler tarafından desteklenen.

1. S. Corynebacterium Bay-1 bir Ito elektrot (şekil 1)'in Monolayer biyofilm oluşumu
Not: elektrokimyasal reaktör diğer mikroplar ile kontaminasyonu önlemek için tüm medya, uygular ve elektrokimyasal reaktör bileşenlerini önceden sterilize. Ne zaman tüm yordamları S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri kullanarak ve elektrokimyasal reaktörler inşa, temiz bir bankta yapılmalıdır.
<ol><li>S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri tarımı Not: S. Corynebacterium Bay-1 monolayer biyofilm kuruldu bir ITO koşulları aşağıdaki elektrot daha önce4bildirdi.<ol>
<li>S. Corynebacterium Bay-1 hücrelerin büyümesine S. Corynebacterium Bay-1 LB orta (20 g/L) 160 rpm'de sallayarak ile aerobik koşullarda 24 h 30 ° C'de 15 mL içine Luria-Bertani (LB) (20 g/L) ve bacto agar (15 g/L) oluşan bir agar plaka üzerinde yetiştirilen bir koloni ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyon vasıl 6000 × g 10 dk santrifüj kapasitesi ve sonuç hücre Pelet tanımlanmış orta (pH 7.8) 15 mL resuspend (DM: NaHCO3 [2.5 g/M], CaCl2·2H2O [0,08 g/M], NH4Cl [1.0 g/M], MgCl2· 6 H2O [0.2 g/M], NaCl [10 g/L] ve 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic asit [HEPES; 7.2 g/M]), 10 mM laktat ve 0.5 g/L Maya ekstresi, karbon kaynağı olarak ilave ve eser elementler S. Corynebacterium Bay-1 için , sırasıyla.</li>
		<li>Daha fazla 160 rpm'de sallayarak ile hücre süspansiyon tükenmesiyle 30 ° C'de 12 h için yetiştirmek ve tekrar 6000 × g 10 dk. yıkama için de sonuç hücre Pelet DM orta ile iki kez 6000 × g elektrokimyasal önce de 10 dakika aralıklarla tarafından santrifüj kapasitesi deneme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üç elektrot elektrokimyasal reaktör (şekil 1) İnşaatı<ol>
<li>ITO substrat reaktör altındaki çalışma elektrot olarak koymak.</li>
		<li>Daha sonra bir cam silindir (çapı 2 cm) ve politetrafloroetilin (PTFE) kapak yerleştirin. Sonra Ag/AgCl (doymuş KCl) ve platin tel santraline başvuru ve sayaç elektrotlar, sırasıyla ekleyin. Not: çözüm ve hava kaçağı önlemek için her bir bileşen arasındaki Bütil kauçuk sayfası ekleyin.</li>
		<li>DM 4.0 mL 10 mM laktat ile desteklenmiş ve 0.5 g/L Maya elektrokimyasal santraline ayıklamak ekleyin.</li>
		<li>Elektrokimyasal reaktör üzerinden hiçbir sızıntı olduğunu onayladıktan sonra azot gazı elektrokimyasal reaktör üzerinde 20 dk anaerobik koşullar elektrokimyasal reaktör içinde korumak için içine akışı. Not: elektrokimyasal santraline akar önce diğer mikroplar ile kontaminasyonu önlemek için gaz filtre.</li>
		<li>Elektrokimyasal reaktör bir potansiyostat bağlamak ve 0,4 V uygulamak (Standart hidrojen elektrodu karşı o) ITO elektrot için elektrokimyasal reaktör sıcaklığı 30 ° C'de bir harici su dolaşım sistemi kullanarak tutmak. Not: harici elektrik alan etkisini önlemek için elektrokimyasal reaktör Faraday kafesi içinde yer almalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S. Corynebacterium Bay-1 hücreleri (Resim 1 ve Şekil 2) elektrokimyasal ekimi<ol>
<li>Adım 1.1 1.43 600 optik bir yoğunluğunun elde süspansiyon hücre yoğunluğu ayarlamak nm (OD600) 10 mM laktat ve 0.5 g/L Maya tarafından desteklenen DM ile ayıklayın. Not: doğru OD600elde etmek için OD600 ≤ 0,8 hücre süspansiyon 1.43 OD600 ayarlama önce UV-VIS Spektrometre için geçerli.</li>
		<li>Bir Ģırınga kullanarak enjeksiyon bağlantı noktası üzerinden elektrokimyasal reaktör içine hücre süspansiyon 0.3 mL ekleyin: reaktör içinde OD600 0,1 için değiştirir. Not: 0.3 mL hücre süspansiyon OD600 ile eklenmesi elektrokimyasal reaktör 4.3 ml 4.0 mL orta sonuçlarını bir OD600 ile çözüm içeren içine 1.43 = 0,1 =. Diğer reaktörler farklı birimleri ile kullanırken, hücre yoğunluğu hesaplanması gereklidir.</li>
		<li>0,4 V (SHE karşı) 25 h ITO elektrot, potansiyel uygulama devam. Not: üretilen geçerli Şekil%2 50 daha az bir sapma sergileyen bir ITO elektrot üzerinde monolayer biyofilm oluşumu için emin olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yedek süpernatant ile 10 mM laktat (şekil 3) ile taze DM orta
<ol><li>Potansiyel uygulamayı durdurmak ve elektrokimyasal reaktör potansiyostat ve su dolaşım sistemi çekin.</li>
	<li>Süpernatant ile 10 mM ile taze DM orta yerine laktat<ol>
<li>Oksijen ortamından kaldırmak için 10 mM laktat 20 dk ile DM içeren bir şişe içine azot gazı akışı.</li>
		<li>Yavaş yavaş tüm süpernatant akan altında bir Ģırınga kullanarak elektrokimyasal reaktör içinde kaldırmak azot gazı (şekil 3a, b). Not: biyofilm ITO elektrot azot gazı tarafından bozulmaması için gaz sıvı yüzeyi üzerinde akışı gerekir.</li>
		<li>Taze DM 10 mM laktat (şekil 3 c) kullanarak içeren 4.0 mL ekleyin. Not: ITO elektrot biyofilm bozulmaması için yavaş yavaş elektrokimyasal reaktör duvar boyunca orta enjekte et. Islak biyofilm tutmak için orta hemen kaldırılması süpernatant sonra eklenmesi gerekir. Orta upto 1dk enjeksiyon süpernatant çıkarıldıktan sonra biyofilm geçerli üretimden S. Corynebacterium Bay-1'in etkisi yoktur.</li>
		<li>Tüm elektrokimyasal reaktör duvarına bitişik süpernatant kaldırmak için elektrokimyasal reaktör eğik.</li>
		<li>Adımları 2.2.2-2.2.4 toplamda üç kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gaz akışını durdurmak ve yeniden, 303 K., ITO elektrot 0,4 V (SHE karşı) uygulamak potansiyostat elektrokimyasal reaktör bağlanmak</li>
</ol>3. KIE EET süreci (şekil 4) ölçmek için döteryum su ilavesi
<ol><li>S. Corynebacterium Bay-1 monolayer biyofilm geçerli üretimden kararlı ve hızlı bir şekilde artırmaz onaylayın. Geçerli dik artarsa, geçerli bir %5 artış 10 dk içinde stabilize kadar bekleyin. Not: Diğer mikrobiyal suşları kirlenme olmadan bir ITO elektrot üzerinde monolayer biyofilm oluşumu rDNA dizileri ve biyofilm bir ITO elektrot üzerinde bir tarama elektron mikroskobik görüntü olarak daha önce4rapor doğrulandı. Hızı sınırlama EET işlem tarafından onay için mekik elektron arabulucu 100 µM anthraquinone-1-Sülfonat (α-AQS) gibi ekleme etkisini izlemek. Temsilcisi sonuçları bölümüne bakın ve15 daha fazla bilgi için başvuru.</li>
	<li>Anoksik (v/v) % 50 D2O 40 µL konsantrasyonu % 0,5 (v/v) D2O reaktör içinde öyle ki bir Ģırınga kullanarak elektrokimyasal reaktör içine ekleyin. Not: D2O Ayrıca biyofilm için zarar görmesini önlemek için D2O drop-wise enjekte.</li>
	<li>Cari sağlamlaştırmak bekleyin ve daha sonra D2O kadar %4.0 (v/v) ekler. Not: aynı birimin H2O ek geçerli üretim üzerinde etkisini KIE değer (D2O ve H2O geçerli üretim oranı) elde etmek için kontrol edin.</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance%2C+Physiology%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Bretschger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+production+and+metal+oxide+reduction+by+Shewanella+oneidensis+MR-1+wild+type+and+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants.</a> Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).</li>
<li>Richter, H., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/EE/B816647A">Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer.</a> Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Strycharz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ee/c0ee00260g">Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400.</a> Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Coursolle, D., Gralnick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+extracellular+respiratory+pathways+for+iron%28III%29+reduction+in+Shewanella+oneidensis+strain+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1.</a> Front. Microbiol. 3, (2012).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlehtml/2009/ee/b816445b">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+biofilm+imaging%2C+transport+and+metabolism+measurements+via+combined+nuclear+magnetic+resonance+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy.</a> ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).</li>
<li>Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+cytochromes+wire+electricity-producing+bacteria+to+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).</li>
<li>Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Absorption+Spectra+and+Redox+Properties+of+C+Type+Cytochromes+in+Living+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-Linked+Proton+Translocation+Coupled+to+Anaerobic+Reduction+of+Manganese%28IV%29+and+Iron%28III%29+in+Shewanella+putrefaciens+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1.</a> J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.light.t.u-tokyo.ac.jp/e/2015/12/10/sp2015-9/">Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation-limited+kinetic+model+for+microbial+extracellular+electron+transport+via+an+outer+membrane+cytochrome+C+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+and+physicobiology%22%5BJournal%5D)">Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex.</a> Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+Transport+in+the+Outer-Membrane+Flavocytochrome+Complex+Limits+the+Rate+of+Extracellular+Electron+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).</li>
<li>Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+Coupled+Electron+and+Proton+Transfer+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions.</a> Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).</li>
<li>Cleland, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+isotope+effects+to+determine+enzyme+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.</a> J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).</li>
<li>Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catabolic+and+regulatory+systems+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+involved+in+electricity+generation+in+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells.</a> Front. Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+uses+and+perspectives+of+heavy+water+and+deuterated+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J+Physiol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.</a> Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).</li>
<li>Xie, X. S., Zubarev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Low-Level+Deuterium+Enrichment+on+Bacterial+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth.</a> Plos One. 9 (7), e102071(2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+enhancement+of+bacterial+extracellular+electron+transport+involves+bound+flavin+semiquinones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).</li>
<li>Edwards, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677(2015).</li>
<li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468616318898">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li>
<li>Guo, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+Cr%28VI%29+by+Escherichia+coli+BL21+in+the+presence+of+redox+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators.</a> Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).</li>
<li>Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167701294900051">A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions.</a> J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).</li>
<li>Myers, C. R., Myers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+the+outer+membrane+cytochromes+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).</li>
<li>Lower, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Recognition+Force+Microscopy+Shows+that+Outer+Membrane+Cytochromes+OmcA+and+MtrC+Are+Expressed+on+the+Exterior+Surface+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).</li>
<li>Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la0204794">Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation.</a> Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).</li>
<li>McMillan, D. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+enzyme+orientation+and+electrode+topology+on+the+catalytic+activity+of+adsorbed+redox+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes.</a> Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/celc.201402151/abstract">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcc.6b00349">Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1.</a> J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/14/116475">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bizim bütün hücreli elektrokimyasal tahlil protein elektrokimya ile karşılaştırıldığında çeşitli teknik avantajları vardır. Protein saflaştırma Multi-step zaman alıcı yordamlar gerektirir, bizim bütün hücreli yöntemi hücre kültürü sonra kendi kendine organize biyofilm oluşumu bir gün alır. OM carasında istikrarlı bir etkileşim elde etmek için - Cyts ve elektrot, biz sadece sterilizasyon ve elektrot yüzeyi Temizleme proteinler4, örneğin, Corynebacterium S. Bay-1 yönünü öz...

Doğrudan sağlam bir bakteri hücre bir Redoks protein karakterize etmek için elektrokimyasal teknikler S. Corynebacterium Bay-1 veya Geobacter sulfurreducens PCA gibi metal azaltarak mikrobiyal suşları keşfinden beri son zamanlarda ortaya çıkmıştır, hangi dış membran c tipi sitokrom kompleksleri (OM c-Cyts) hücre dış1,2,3,4,5' e maruz var. COM - Cyts solunum zinciri elektron taşıma extracellularly bulunan katı yüzeyler için aracılık. Bu aktarım için hücre dışı elektron taşıma (EET)1,6 adlandırılır ve mikrobiyal yakıt hücreleri6gibi gelişmekte olan biyoteknoloji için kritik bir süreçtir. Bu nedenle, temel EET kinetik ve mekanizmaları ve mikrobiyal Fizyoloji onun bağlantı anlamak için OM c -Cyts araştırdık mikroskobu ile birlikte bütün hücreli elektrokimya4,7, kullanma 8 , 9, spektroskopi10,11ve moleküler biyoloji2,4. Buna ek olarak, katyon EET ilişkili taşıma, Örneğin, proton, canlı hücreler EET Kinetik üzerinde etkisini araştırmak için yöntemleri pek, proton taşıma bakteri membranları kritik bir rol almakla genelinde rağmen kurulmuştur sinyal, Homeostazı, enerji üretim12,13,ve14. Mevcut çalışma, biz proton taşıma EET Kinetik hızı sınırlaması adımda tanımlaması gerektirir bütün hücreli elektrokimyasal ölçüler kullanarak S. Corynebacterium Bay-1 hücrenin üzerinde etkisini incelemek için bir teknik tarif mikrobiyal geçerli üretim15.
Proton taşıma ilişkili EET Tarih katkısını değerlendirmek için bir doğrudan döteryum Kinetik izotop etkisi (KIE) yoludur. KIE elektron transferi Kinetik proton taşıma elektron transferi Kinetik16etkisini temsil eden yedek proton döteryum iyonları ile üzerine değişiklik gözlemlenebilir gibidir. KIE kendisi teori de arıtılmış enzimler17ile elektrokimyasal ölçüler kullanarak kurulan olmamıştı. Geçerli üretim S. Corynebacterium Bay-1 birden çok, farklı ve dalgalanan işlemleri18sonuç beri Ancak, biri sadece EET hızı sınırlaması işlem olarak belirleyemez. KIE proton taşıma süreçleri EET ile birleştiğinde gözlemlemek için biz mikrobiyal geçerli üretim ile elektron taşıma OM cile sınırlıdır onaylamanız gerekir - Cyts elektrot için. Bu amaçla, biz taze orta laktat yüksek bir konsantrasyon en uygun pH ve sıcaklık koşullarında KIE ölçüm önce bir elektron donör olarak içeren süpernatant çözüm yerine; Bu değiştirme iki rolden servis: (1) için EET göre ters yönde metabolik süreçleri oranı gelişmiş ve (2) S. Corynebacterium Bay-1 üzerinde çalışma elektrot (monolayer biyofilm serbest süpernatant Yüzme hücrelerde ihmal indiyum teneke katkılı oksit (ITO) elektrot). Sunulan ayrıntılı iletişim kuralı korumak ve EET işlem oranı belirleme adım olduğunu doğrulayın yeni uygulayıcıları yardımcı olmak içindir.

<table><tbody><tr><td>Cam silindir</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ismarlama, elektrokimyasal reaktör olarak kullanılır</td></tr><tr><td>PTFE kapak ve taban</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ismarlama, elektrokimyasal reaktörün kapağı ve temeli olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Buthyl kauçuk</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ismarlama, elektrokimyasal reaktörün her bir bileşeni arasına yerleştirilir</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Elektrokimyasal reaktörün enjeksiyon portu olarak kullanılır</td></tr><tr><td>İndiyum kalay katkılı oksit (ITO) elektrot</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Çalışma elektrotu olarak kullanılır, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl doymuş elektrot</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Referans elektrot olarak kullanılır, &Phi; 0,30 mm</td></tr><tr><td>Platin tel</td><td>Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Karşı elektrot olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson ve Şirketi</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antrakinon-1-sülfonat (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Flavin mononükleotid (FMN)</td> <td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Tanımlanmış ortam (DM)</td></tr> <tr><td>CaCl2 ve orta nokta için kullanılır 2H 2 O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>DM için kullanılır</td></tr><tr><td>NH 4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>DM</td></tr> <tr><td>için kullanılırMgCl<alt>2</alt> ve orta nokta; 6H < > 2 O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td> için <td>kullanılır DM</td></tr><tr><td>2 - [4- (2-hidroksietil) -1-piperazinil] etansülfonik asit (HEPES)</td> <td>için kullanılır DOJINDO</td><td>346-08235</td> DM <td></td></tr><tr><td>Sodyum Laktat Çözeltisi</td> için kullanılır <td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Maya Özü</td><td>Becton, Dichkinson ve Şirket</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum oksit (D, %99,9)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Kinetik izotop etkisi deneyleri için katkı</td></tr> maddesi <tr><td>İnkübatör</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Ön yetiştirme için kullanılır</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>Ön yetiştirme için kullanılır</td></tr><tr><td>Otoklav makinesi</td><td>TOMY SEIKO CO., LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Elektrokimyasal reaktörün ve ortamın sterilizasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Temiz tezgah</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Elektrokimyasal reaktörün ve ortamın diğer mikroplarla kirlenmesini önlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Santrifüj ayırıcı</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>6000 kata kadar dönme hızı; g gereklidir</td></tr><tr><td>Azot gazı jeneratörü</td><td>Puequ CO., LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Azot gazı silindiri gaz jeneratörü yerine de kullanılabilir</td></tr><tr><td>UV-vis spektrometresi</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Hücre yoğunluğunun optimizasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Potansiyostat</td><td></td><td>BioLogic VMP3</td><td>Biyofilm oluşumu ve kinetik izotop etkisi deneyleri için kullanılır</td></tr><tr>BIR <td>TR-1A</td><td>GİBİ</td><td>TERMAL SU SIRKÜLATÖRÜ</td><td>Elektrokimyasal reaktörün sıcaklığının korunması için kullanılır</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Elektrokimyasal deneyler için kullanılır</td></tr></tbody></table>

elektrokimyasal algılama döteryum kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma shewanella corynebacterium bay-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Doğrudan celektrokimyasal tespiti-yazın bakteriyel dış membran gömülü sitokrom kompleksleri (dış membran c-sitokrom kompleksleri; yazın OM c- Cyts) son zamanlarda roman bütün hücreli analitik yöntem bakteriyel hücre dış elektron ulaşım solunum zincirindeki karakterize olarak ortaya, ekstrasellüler elektron taşıma (EET) anılacaktır. Yol ve Kinetik elektron akışı EET reaksiyon sırasında araştırdık iken, katyon taşıma EET ile ilişkili etkisini incelemek için bir bütün-hücre elektrokimyasal yöntem henüz oluşturulmadı. Bu da çalışmanın, döteryum Kinetik izotop etkisi (KIE) EET OM cile incelemek için biyokimyasal bir teknik - Cyts modeli mikrop, Shewanella Corynebacterium Bay-1, kullanarak açıklanan örneğidir. EET ile OM c- Cyts mikrobiyal geçerli üretim hızı sınırlaması adım olarak davranıyorsa KIE EET süreci üzerinde elde edilebilir. Bu amaçla, D2O, eklenmesi önce süpernatant çözüm elektron verici ters yönde metabolik reaksiyonların hızı desteği ve planktonik hücreleri bir üniforma kaldırmak için yeterli miktarda içeren taze medya ile değiştirildi monolayer biyofilm çalışma elektrot üzerinde. Hızı sınırlaması onaylamak için alternatif yöntemler adım mikrobiyal geçerli üretimde EET OM caracılığıyla olarak - Cyts da açıklanmaktadır. Proton taşıma Kinetik soruşturma için bütün hücreli elektrokimyasal testin bizim tekniği diğer electroactive mikrobiyal suşları için uygulanabilir.

0,4 V (SHE karşı) potansiyel uygulamasının 25 h sonra monolayer biyofilm çalışma elektrot daha önce bir tarama elektron mikroskobu ya da bir confocal mikroskobu4tarafından doğrulandı ITO cam kuruldu. S. Corynebacterium Bay-1'den geçerli üretim monolayer biyofilm oluşumu sırasında temsilcisi zaman tabii Şekil 2' de gösterilmiştir. Her ne kadar mevcut her ölçüm değiştirir, eğer monolayer biyofilm eşit oluşturulur üretilen geçerl...

Burada bir protokol proton taşıma dış membran cytochromes Shewanella Corynebacterium Bay-1'karmaşık yoluyla ekstraselüler elektron taşıma oranı katkısını çalışmaya bütün hücreli elektrokimyasal deneyler mevcut.

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Bu protokolün genel amacı, döteryum kinetik izotop etkisinin tespiti yoluyla proton taşınımının bakteriyel hücre dışı elektron taşıma hızına katkısını gözlemlemektir. Yöntemimiz, proton taşınmasının, dış zar c-tipi sitokromlar yoluyla bakterilerden bir elektrota hücre dışı elektron taşınması veya EET kinetiği üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Testimiz, EET'deki doğal proton yönetimini yansıtıyor çünkü saflaştırılmış enzim yerine canlı bakteriler kullandık.Bununla birlikte, bizim zorluğumuz, gürültüleri diğer hücresel süreçlerden uzaklaştırmaktı. KIE olarak adlandırılan döteryum kinetik izotop etkisi, proton taşınmasının ilgili elektron taşıma süreci üzerindeki katkısını incelemek için en iyi tekniklerden biridir. Shewanella MR-1 hücrelerini büyütmek için, bir agar plakası üzerinde büyütülen hücrelerin bir kolonisini 15 mililitre LB ortamına aktarın.Hücreleri aerobik koşullarda 24 saat boyunca 30 santigrat derecede büyütün ve 160 rpm'de çalkalayın. Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca yerçekiminin 6.000 katında santrifüjleyin. Daha sonra, elde edilen hücre peletini, karbon kaynağı olarak 10 milimolar laktat ve hücreler için eser elementler olarak litre başına 0.5 gram maya ö

electrochemical-detection-deuterium-kinetic-isotope-effect-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Kaynak: Tokunou, Y., ve diğerleri, Shewanella oneidensis MR-1'de Hücre Dışı Elektron Taşınması Üzerindeki Döteryum Kinetik İzotop Etkisinin Elektrokimyasal Tespiti. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, proton transferinin elektroaktif bakterilerde hücre dışı elektron taşınmasını (EET) nasıl etkilediğini değerlendirmek için tam hücre elektrokimyasal yöntemini göstermektedir. Yöntem, döteryum oksit kullanarak protonları döteronlarla değiştirerek, kinetik bir izotop etkisini ortaya çıkarmak için akımdaki...

Döteryum Oksit Kullanılarak Mikrobiyal Elektron Taşınması Üzerindeki Kinetik İzotop Etkisinin Ölçülmesi

Kaynak: Tokunou, Y. ve ark., Shewanella oneidensis MR-1'de Deuteryum Kinetik İzotopunun Elektrokimyasal Tespiti Hücre Dışı Elektron Taşınımına Etkisi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, elektrot yüzeylerinde biyofilm oluşumunu simüle etmek için tasarlanmış bir elektrokimyasal reaktör modelinin montajını ve çalışmasını gösteriyor. Kontrollü elektrokimyasal uyarım, mikrobiyal yapışmayı teşvik eder ve bu da bakteriyel monotabakalı biyofilmin kademeli gelişimine yol açar.

Elektrokimyasal Reaktör Kullanarak Bakteriyel Tek Katmanlı Biyofilm Geliştirilmesi

Eksozomlar, potansiyel olarak önemli hastalık ayırıcı biyobelirteçler taşıyan biyosıvılar içinde bulunan mikroveziküler yapılardır. Burada, eksozomları spesifik olarak çıkarmak ve tekdüze olmayan elektrikli döngüsel kare dalgalar kullanılarak eksozomların parçalanmasını takiben her iki RNA/protein hedefi için ekzozomal yükü hızlı bir şekilde test etmek için yeni bir yöntem kullanılmaktadır.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Bu makale bir biyofilm in situ uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi sulu durumda, kimyasal eşleştirmesi bir mikrosıvısal reaktör, sıvı vakum arabirimi analiz için sistemi tarafından etkinleştirilmiş için için büyüyen bir yöntem sunar. Shewanella Corynebacterium Bay-1 yeşil Floresans protein ile bir model olarak kullanıldı.

Situ Shewanella Corynebacterium MR1 biyofilmler SALVI ve ToF-SIMS tarafından karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Otel bünyesindeki mikrobiyal zenginleştirme veya in situ yetiştirme teknikleri kültür zor mikrobiyal özellikleri, özellikle düşük-biyokütle veya geochemically aşırı ortamlar üzerinden Yalıtım kolaylaştırabilir. Burada, biz yeteneğine sahip hücre dışı elektron taşıma (EET) mikrobiyal suşları zenginleştirmek için bir harici güç kaynağı'nı kullanmadan bir elektrokimyasal set-up tanımlamak.

Anot respiring bakteri yerinde zenginleştirmek için kendini ayakta elektrokimyasal Set-up

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Burada, üç elektrotlu, iki odacıklı bir biyoelektrokimyasal sistem kullanarak laktik asit bakterilerinde aracılı hücre dışı elektron transferini (EET) karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemi Lactiplantibacillus plantarum ve redoks aracısı 1,4-dihidroksi-2-naftoik asit ile gösteriyoruz ve aracılı EET'yi değerlendirmek için kullanılan elektrokimyasal tekniklerin kapsamlı bir tanımını sunuyoruz.

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Burada, Shewanella oneidensis'teki hücre dışı elektron transferi (EET) aktivitesini elektrik sinyallerine çevirmek için organik elektrokimyasal transistörlerin (OECT'ler) kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Hibrit OECT sistemi, hızlı, yüksek verimli testler için gelişmiş sağlamlık, hassasiyet ve potansiyel sağlayarak onu EET ölçümleri için etkili bir araç haline getirir.

Organik Elektrokimyasal Transistörler ile Hücre Dışı Elektron Transfer Aktivitelerinin Çevrilmesi

Keşfedin, Shewanella oneidensis MR-1 bakterilerinde ekstraselüler elektron taşıma kinetiğine proton taşımanın katkısını değerlendirmek için döteryum kinetik izotop etkisi yöntemini. Bu protokol, canlı hücrelerde elektron transfer mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Daha fazla video keşfet