A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi
22 Mayıs 2018
Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.
Bu yöntem, nörofarmakolojik alandaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beta-amiloid oligomer oluşturmak için basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasıdır. Beta oligomer hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin gösterilmesinin kritik olduğunu gösteriyoruz.
İlk olarak, tüpe 900 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyerek A-beta monomer çözeltisinin konsantrasyonunu mililitre başına 0.25 miligrama ayarlayın. Daha sonra, monomer çözeltisini yüksek saflıkta nitrojen gazı ile buharlaştırmaya devam edin, hacim mililitre başına yaklaşık 0.29 miligram konsantrasyonla yaklaşık 850 mikrolitreye ulaşana kadar. HR5P'nin varlığı, A-beta oligomerinin oluşumunu etkiler.
Bu nedenle, mümkün olduğu kadar buharlaştırmak bu prosedürün kritik bir adımıdır. Daha sonra, 0.2 ve iki mikromolar çalışma çözeltisi hazırlamak için kurkumin stok çözeltisini seyreltmek için çift damıtılmış su kullanın. Bire bir oranını koruyun ve 0.1 ve bir mikromolar'da nihai kurkumin konsantrasyonunu elde etmek için A-beta çözeltisini kurkumin ile karıştırın.
Ardından, çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde bırakın. Manyetik karıştırıcıya plastik bir bölücü kutu takın. Kutunun iki köşesine iki manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin, ardından tüpleri numunelerle birlikte kutunun ortasına yerleştirin.
Kutuyu oda sıcaklığında dakikada 60 devirde 48 saat çalkalamaya devam edin, ardından tüpü dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı toplayın. Nokta lekeleme analizi için, bir nitroselüloz membran alın ve bir santimetre genişliğinde şeritler halinde kesin, ardından numunenin iki mikrolitresini, her nokta aralığı 0,5 santimetre olacak şekilde bir ve iki şeritlerin üzerine eşit şekilde yerleştirin.
Numuneyi membran üzerine püskürtülürken, eşit şekilde yayılmak ve farklı damlacıkların kontrol edilmesi gerekir, böylece farklı numuneler birbirine bağlanmaz. Daha sonra, damlacıkların kuruması için şeritleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, şeritleri oda sıcaklığında% 5 sığır serum albümini ile 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyon bittiğinde, şeritleri TBST tamponu ile beş dakika yıkayın. Yıkama yapıldıktan sonra tamponu aspire edin, ardından bir şeridi anti-oligomer antikoru A11 ile inkübe edin ve ikinci şeridi anti-A-beta antikoru 6E10 solüsyonu ile bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, şeritleri TBST ile her üç kez beş dakika boyunca yıkayın, daha sonra tamponu aspire edin ve şeritleri 40 dakika boyunca ikincil antikor çözeltisi ile inkübe edin.
İkincil antikor inkübasyonundan sonra, şeritleri her üç kez beş dakika boyunca TBST ile tekrar yıkayın. Ardından, nemli şeritlerin yüzeyine yaklaşık 300 mikrolitre karışık ECL sıvısı ekleyin, ardından şeritleri otomatik bir kemilüminesans görüntüleme sisteminde açığa çıkarın. TEM çalışmaları, HFIP ile çözünmüş A-beta monomer çözeltisinde herhangi bir görünür agreganın olmadığını göstermektedir, ancak 48 saatlik inkübasyondan sonra, aynı monomer, esas olarak 10 ila 80 nanometre çapında küresel agregalar olan oligomerleri oluşturur.
A-beta monomer ve oligomerden zengin numuneler nokta leke analizine tabi tutulduğunda, A-beta oligomerden zengin numunelerde A11 pozitif A-beta oligomerlerinin varlığını gösterir. İlginç bir şekilde, A-beta 6E10 pozitif A-beta peptitleri hem A-beta monomerinde hem de oligomer açısından zengin örneklerde bulunur. Daha sonra, spesifik antikor pozitif A-beta monomer ve oligomer açısından zengin numuneleri kontrol yüzdesi olarak ifade etmek için yarı kantitatif analiz de yapılır.
A11 pozitif A-beta peptitler, A-beta oligomer açısından zengin örneklerde monomerlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. Aksine, A-beta 6E10 pozitif A-beta peptit hem monomer hem de oligomer açısından zengin örneklerde bulunur. Aslında, A-beta oligomerleri ayrıca kurkumin ve A-beta oligomer inhibitörü ile birlikte inkübe edilir.
Kurkumin, kurkumin ile birlikte inkübe edilmiş A-beta oligomer örneklerinde azalmış A11 boyaması ile A11 pozitif A-beta oligomerinin nispi miktarında önemli bir azalmaya yol açar. Bununla birlikte, değişen kurkumin konsantrasyonları, A11 pozitif numunelerle karşılaştırıldığında, 6E10 pozitif monomer ve oligomer açısından zengin numunelerdeki A-beta peptitlerinin sayısını etkilemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik araştırmacıların Alzheimer Hastalığı gibi nörodejeneratif bozukluklar için ilaç adaylarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, A-beta oligomerinin nasıl hazırlanacağını ve miktarını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, sentetik bir peptitten in vitro Aβ oligomerlerinin hazırlanmasını ve dot blotting analizi kullanılarak göreceli miktarlarının değerlendirilmesini açıklamaktadır. Bu yöntem basit, güvenilir ve tekrarlanabilirdir; bu nedenle nörofarmakolojik araştırmalar için temel teşkil eder.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nörofarmakoloji
- Biyokimya
Arka Plan
- Aβ oligomerlerinin nörodejeneratif hastalıklarda rol oynadığı düşünülmektedir.
- Bu oligomerlerin oluşumunu anlamak, terapötik geliştirme için kritik öneme sahiptir.
- Bu oligomerlerin hazırlanması için kullanılan mevcut yöntemler karmaşık olabilir.
- Bu protokol, araştırmacılar için süreci basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Aβ oligomerlerini hazırlamak için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Oligomer konsantrasyonlarının değerlendirilmesini kolaylaştırmak.
- Nörofarmakolojik deneylerde tekrarlanabilirliği artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- A-beta monomer konsantrasyonunun 0.25 mg/mL'ye ayarlanması.
- Çözeltinin yüksek saflıktaki nitrojen gazı ile evaporate edilmesi.
- HR5P'nin oligomer oluşumu üzerindeki etkilerinin izlenmesi.
- Değerlendirme için dot blotting analizinin kullanılması.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, Aβ oligomerlerini başarıyla üretmektedir.
- Dot blotting analizi, oligomer miktarlarını etkili bir şekilde nicelleştirmektedir.
- HR5P varlığı, oligomer oluşumunu önemli ölçüde etkilemektedir.
- Protokol, yüksek güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik sergilemektedir.
Sonuçlar
- Bu protokol, Aβ oligomerlerinin hazırlanmasını kolaylaştırır.
- Nörofarmakolojik araştırmalar için değerli bir araç sunar.
- Gelecekteki çalışmalar, bu güvenilir yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Sektör Uygunluğu
A11-pozitif β-amiloid oligomerlerin güvenilir şekilde hazırlanması ve kantifikasyonu, Alzheimer hastalığı araştırmalarında erken evre nörodejenerasyon hedef doğrulaması ve inhibitör taraması için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, toksik oligomerik türlerin tekrarlanabilir şekilde üretilmesini ve yarı kantitatif değerlendirilmesini sağlayarak, terapötik hipotez testlerinde öngörüsel güveni destekler. Yöntem, nörofarmakolojik Ar-Ge'de mekanistik risk azaltma ve portföy önceliklendirmesi için temel bir kırılma noktasını doğrudan ele almaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Alzheimer patolojisinde mekanistik bir itici güç olan β-amyloid oligomer oluşumunun incelenmesine olanak tanır.
- A11 antikor özgüllüğünü kullanarak nörotoksik türlerin fonksiyonel doğrulamasını destekler.
- Oligomer inhibasyonunu hedefleyen terapötik hipotezlerin risklerinin azaltılmasını kolaylaştırır.
- Aday inhibitörlerin karşılaştırmalı analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Ardıl inhibitör tarama kampanyaları için valide edilmiş oligomer açısından zengin örnekler hazırlar.
- Standartlaştırılmış analiz okumaları için yarı nicel dot blot çıktıları sağlar.
- Bileşik değerlendirmesi için A11-pozitif oligomerlerin tekrarlanabilir tespitini sağlar.
- Nörodejenerasyon tarama hatlarında ölçeklenebilirliği ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- İn vitro oligomer karakterizasyonunu, hastalıkla ilişkili nörotoksik türlerle uyumlu hale getirir.
- Keşif aşamasındaki doğrulamadan preklinik inhibitör değerlendirmesine kadar süreklilik sağlar.
- Aday moleküllerin mekanistik kanıtlara dayalı olarak risk ayarlı şekilde ilerletilmesine olanak tanır.
- Oligomer hedefli müdahaleler için translasyonel biyobelirteç gelişimini destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, erken keşif ve öncü bileşik tanımlama arayüzünde entegre olarak, nörodejeneratif hastalık portföyleri için güçlü hipotez testleri ve analiz geliştirme imkanı sağlar.
- Keşif Biyolojisi: β-amiloid oligomer toksisitesinin ve inhibitör etkilerinin mekanistik doğrulamasını destekler.
- Tarama: Bileşik tarama iş akışları için standartlaştırılmış, yarı nicel dot blot çıktıları sağlar.
- Analitik: Veriye dayalı karar verme süreçleri için A11- ve 6E10-pozitif türlerin karşılaştırmalı kantifikasyonuna olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İn vitro oligomer değerlendirmesini hastalıkla ilgili nörotoksisite modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Devam eden nörodejenerasyon araştırma girişimleri için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Alzheimer hastalığı için hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltmadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir oligomer hazırlama ve kantifikasyon sağlar.
- Stratejik Değer: Güçlü inhibitör taramasına olanak tanıyarak devam/dur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Nörodejenerasyon terapötik adaylarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Peptit işleme ve immünodeteksiyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Dot blotting cihazlarına ve kemilüminesans görüntüleme sistemlerine erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilir örnek hazırlama ve analiz için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Çeşitli inhibitör adaylarına ve oligomerik peptit sistemlerine uyarlanabilir.
- Antikor özgüllüğüne ve yarı kantitatif analiz kısıtlamalarına bağlıdır.
