Name: İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin fare pankreas progenitörlerinden iskele-free 3D insülin ifade eden pancreatoid üretimini. Bu yöntem endokrin hücre gelişimini ve diyabet araştırmalarını ilerletmek için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jolanta Chmielowiec Protokolü ve el yazması ile ilgili yararlı tartışma için teşekkür ediyoruz. Biz de Benjamin Arenkiel erişim confocal mikroskop için teşekkür ederim. Bu eser NIH (M.B. için P30-DK079638) ve T32HL092332-13 M.A.S ve M.B., McNair tıbbi Vakfı (M.B.) ve confocal özünde BCM fikri ve gelişme bozuklukları Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir (NIH U54 HD083092 Eunice üzerinden Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan gelişimi).

Bu yöntemde açıklanan tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Baylor Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. fare embriyonik gün 10,5 pankreas ataları hazırlanması
Not: diseksiyon .aletleri sterilize ve kullanmadan ile % 70 etanol önce sprey uygunudur ancak bu protokolü kadar adım 2, steril koşullarda izlenecek gerekmez.
<ol><li>Diseksiyon için ayarlamak için bir buz kovası doldurun ve buzun içinde bir kap fosfat tamponlu tuz (PBS) yerleştirin. İki ince uçlu forseps ve diseksiyon makası % 70 etanol ile temizleyin. Yakın olan diseksiyon alanına ayarla, en az üç borosilikat kapiller içeren bir kapsayıcı, bir ağız pipet, bir çakmak, tüpler ve 1000 µL pipet ipuçları filtre.<ol>
<li>En az 1 mL steril su ve buz üzerinde 12 iyi plaka ikinci iyi yerde seyreltilmiş 1.25 mg/mL soğuk dispase hazırlayın. PBS birinci, üçüncü ve dördüncü koymak wells 12 de plaka. Yer 1 mL % 0.05 tripsin 1,5 ml tüp buz üzerinde. 37 oC. titreyen bir kuluçka önceden ısıtmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 zaman aşımına uğradı-hamile fareler IACUC kurallar uyarınca ötenazi. Karın bir V şeklinde kesi genital bölge, makas ve forseps kullanarak fare yapmadan önce bölgenin temiz ve diyafram kadar devam etmek için % 70 etanol ile sprey. Not: Bu protokol vajinal bir eklenti görünümü gün 0,5 belirtir. 5 - 6-hafta-yaşlı fareler, kullanma daha--dan 2 g bir kilo alımı başarılı emprenye ikincil bir ölçüsü olarak davranır.<ol>
<li>Dikkatli bir şekilde rahim, rahim, karşı tarafta tekrarlanmadan önce yukarı doğru uzak fare ve bu kesi aşağıdaki organ genital bölge aşağı çekerek en üst lateral bölümlerini bir kesi yaparak tüketim. 10 cm soğuk PBS ile Petri kabına yerleştirin. Not: E10.5 pancreatoids, aksine bu organoids değil henüz karakterize edilmektedir ve bu nedenle tüm üç büyük pankreas soy ayırt etmek için kapasite tutmamayı ancak organoids ayrışmış e11.5 hücrelerinden elde etmek mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir ışık diseksiyon mikroskop altında Petri kabına yerleştirin ve dikkatle her embriyo arasında iki forseps yerleştirip doku sarısı sac uzak soyulması rahim dokusu açın. Sarısı sac forseps ve yeri 10 cm ile taze, Petri kabına yavaşça ile açgözlü tarafından embriyo transfer soğuk PBS. Petri kabına buza koyun. Not: Heedfully embriyo, tercihen güçlü kaldırma doku embriyo sökük ve yapısal bütünlüğü tehlikeye göbek kordonu, indirebiliriz sarısı sac içinde muhafaza kaldırmak önemlidir.</li>
	<li>Birden çok PBS damla bir 10 cm Petri kabına kapağını yerleştirin. Bu damlacıkları extraembryonic dokularının görünürlük sağlamak için kaldırılır gibi embriyo diseksiyon sırasında aktarmak için kullanın. Bir PBS damla için bir embriyo transfer ve kalan embriyolar PBS buz (Şekil 1A) içinde kalırken forseps, kullanarak sarısı sac yavaşça kaldırın. Baş hafifçe, embriyonun doku (Şekil 1B) hasar için kepçe forseps kullanarak yeni bir PBS damla embriyo geçmeden önce kaldırın. Not: Doku daha sık taze PBS damlacıkları için burada, sıvı opaklık bağlı olarak açıklanan aktarılması gerekir.<ol>
<li>Yeni bir PBS düşüş forseps (Şekil 1B) kullanarak forelimb tomurcukları kaldırın. Yer forseps açılış içine nerede kol bud mevcuttu ve yavaşça sadece en dış doku anteriorly gözyaşı (Şekil 1B). Embriyo döndürmek ve hindlimb bud durdurma arka yönde tekrarlayın. Bu noktada, gastrointestinal sistem görünür (Şekil 1B) olmalıdır.</li>
		<li>Gastrointestinal sistem arka bölge (Şekil 1F) hafif bir viraj var. Bu bend arkasında forseps açılış gastrointestinal sistem ve vücut duvar spinal bölge arasında ekleyin. En ön bölge nerede kalp bölge (Şekil 1B-E) bağlanan ulaşılana kadar yavaş yavaş yukarı doğru çalışma gastrointestinal sistem bağlantısını kesin. İsteğe bağlı: ilkel kalp ve karaciğer tomurcukları gastrointestinal sistem sadece sürekli gut tüp bırakarak, ventral bölgelerden kaldırma. Bu iletişim kuralı gerçekleştirilir ilk birkaç kez kalp ve karaciğer morfolojisi, gastrointestinal sistem ve dorsal pankreas tomurcuk kadar ventral yerlerinden daha fazla olduğu gibi bırakmak daha kolay olabilir tanıdık (Şekil 1C ve D ).</li>
		<li>Gastrointestinal sistem taze PBS damlacık aktarın.</li>
		<li>Forseps alıp hafifçe çıkıntılı bud ve bağırsak altında doku çimdik ve biraz (Şekil 1D-F) kapalı dış doku kaldırın. Not: Dorsal pankreas bud mide ve bağırsak (Şekil 1C-G) arasında yer almaktadır. Altında belgili tanımlık pankreas gonca gibi yuvarlak, budaklı yapı (Şekil 1G) bakmak gerekir.</li>
		<li>Forseps nereye belgili tanımlık gonca bağırsak ve yukarı doğru bud (Şekil 1G) gevşetmek için çimdik bağlanır koyun. Bir kez yeni bir PBS balonun içinde belgili tanımlık gonca soğuk PBS 12 iyi plaka ilk kuyunun içine buzda aktarmadan önce yıkayın. Tüm tomurcukları embriyo toplanan ve 12 iyi plaka ilk kuyuda yerleştirilir kadar yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işık diseksiyon mikroskop altında 12 iyi çanak yerleştirin. Pankreas tomurcukları başarıyla sonra split oranını hesaplamak için disseke saymak.<ol>
<li>Yer bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu içine ağzını pipet kılcal tüp ile bağlı. Alev kılcal tüp sterilize ve kullanım kolaylığı için tüp viraj oluşturun. Kılcal temiz PBS (Şekil 1G) ile üçüncü de aktarmadan önce ikinci de içeren soğuk dispase çözüm için 2 dk tomurcukları aktarmak için kullanın. Not: tomurcukları dispase PBS'ye aktarma sırasında doku Kılcal boru ucuna dokunmaktan kaçının. Eğer doku tüpün ucunda takılıyor, yukarı ve aşağı pipet veya gevşetti kadar temiz PBS çözümde sallamayın.</li>
		<li>Tomurcukları yukarı ve aşağı pipet ve temiz PBS ile dördüncü de aktarın. Son olarak, kapiller aygıt aktarması kullanarak tomurcukları 1,5 mL tüp ile % 0.05 tripsin. Önceden ısıtılmış 37 oC shaker tüpü yerleştirin ve 4 dk için 1500 rpm'de sallamak.</li>
		<li>Yaklaşık 10 için girdap s sonra hemen yer tüp bir santrifüj ve spin 200 5 min için g. kaldırmak ama yaklaşık 50 µL çözüm dikkatli centrifuged hücreleri (Şekil 1G) rahatsız değil gibi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kültür Disosiye ataları Pancreatoids oluşturmak için
Not: Aşağıdaki standart steril prosedürler kullanarak standart doku kültürü Hood, steril bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>Toplanan her bud için 400 µL organogenesis medya16,17 (Tablo 1) centrifuged hücrelere ekleme. Girdap üç kez darbe ve plaka 100 µL düşük ek 96 kuyu başına iyi tomurcukları (Şekil 1G) 1:4 oranında bölme plakası.</li>
	<li>Mikroskop altında ilişkisini görselleştirmek için (resim 1H) serbestçe yüzen hücreleri denetleyin. 37 oC kuluçka %5 CO2 orta hızda bir rocker kültür çanak yerleştirin.</li>
	<li>Her gün pancreatoids ilerlemesini izlemek. 100 µL taze medya her 3 günde hood pancreatoid kuyuda bırakarak kaldırmak için mikroskobik kontrol altında dikkatle pipetting medya ile değiştirin. Alternatif olarak, medya taze 100 µL yeni iyi ve pancreatoid kullanarak transfer ağzını pipet ve 1000 µL bağlı borosilikat kılcal tüp pipet ucu filtre ekleyebilirsiniz.</li>
</ol>3. işlem Pancreatoids immünfloresan görüntüleme için
<ol><li>Pancreatoids immünfloresan görüntüler için işlemek için ilk %4 paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) çözüm hazırlamak. Yer 50 µL % 4'lük PFA 96 Wells de plaka.<ol>
<li>Borosilikat kılcal tüpler ve ağzını pipet 1000 µL süzülmüş pipet ucu ile kullanarak, kültür % 4 ile taze kuyuya mümkün olduğu kadar az medya alarak orta pancreatoids transfer PFA. 15 dakika oda sıcaklığında rocker üzerinde ayarlayın.</li>
		<li>Pancreatoids 4'den % aktarım PFA taze PBS, 100 µL ile bir kuyuya rock, oda sıcaklığında 5-10 dakika tekrar olmak üzere toplam üç taze PBS yıkar, için. Not: Protokol burada, pancreatoids bir hafta kadar PBS 100 µL 4 oC, depolanan ile duraklatılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount görüntüleme için (antikorlar bölümünde 3.3 uygun, alternatif bir yaklaşım olup tavsiye. ve 3.4 mikroskobu.), PBS 1 x PBS % 0,1 Noniyonik deterjan (PBST) ile 50 µL % 5 eşek serum içine engellemek için transfer. Gecede 4 oC rock ya da alternatif olarak, oda sıcaklığında 4 h için.<ol>
<li>Birincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. En iyi şekilde, rock 4 oC 24 h (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için. Not: Malzeme tablo Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) ve Pdx1 karşı antikorlar listelenen (1: 100) uygun wholemount boyama için; diğer antikorlar optimizasyonu gerektirebilir.</li>
		<li>Pancreatoids yıkama ve oda sıcaklığında 30 dakika rock taze PBST 100 µL içeren bir de aktarın. Toplam üç taze PBST yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
		<li>İkincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. Plaka ışıktan korumak ve 4 oC, en iyi şekilde 24 saat (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için sallanan yer. Not: Malzeme tablo ve DAPI nükleer counterstain listelenen tüm ikincil antikorlar wholemount boyama için uygundur.</li>
		<li>1 x PBST ve kaya, oda sıcaklığında 1'deki üç yıkar, toplam 30 dk. tekrar 100 µL içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. Üçüncü ve son yıkama eklemek 300 nM DAPI.</li>
		<li>Son olarak, temiz PBS ve 4 oC confocal mikroskobu tarafından Imaging önce bir haftaya kadar ışık için en iyi sonuçları görüntüleme hemen sonra boyama geldi rağmen korunuyorsunuz mağazasında 100 µL yerleştirin. Görüntüleme sırasında pancreatoids hareketi engellemek, ancak kurumasını önlemek için her pancreatoid PBS 20 µL damlacık yerleştirin. Pancreatoids hala kalmaz, PBS ses azaltın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Donmuş bölümleri için pancreatoids PBS % 30 sükroz çözüm gecede 4 EyC. içine transfer<ol>
<li>Bir kabarcığın diseksiyon mikroskop altında gömme medya ekleyin. Mikroskobik kontrol altında forseps kullanarak, pancreatoids hafifçe gömme medya yoluyla birkaç kez bir doku blok dondurulmuş gömme medya ile aktarmadan önce kalan sükroz kaldırmak için iterek emmek.</li>
		<li>Kuru kadar donmuş buz blokta doku ve Bölüm 8 µm, cryostat yerleştirin. Not: Bölümler-80 oC veya immunostained hemen depolanabilir.</li>
		<li>Kuru kadar yaklaşık 5 min için oda sıcaklığında erimek için-80 oC bölümleri sağlar. Hidrofobik pap kalemi doku ve % 5 eşek serum 1'seyreltilmiş kullanarak blok etrafında bir hidrofobik bariyer çizmek için oda sıcaklığında 30 dk x PBST.</li>
		<li>Medyayı çıkarın ve birincil antikorlar % 5 eşek serumda PBST gecede 4 EyC. 1 x seyreltilmiş seyreltilmiş hemen yerine</li>
		<li>Birincil çözümü kaldırmak ve yıkama doku üç kez ile 1 x PBST 10 dk için. Bunu 1'seyreltilmiş %5 eşek serumda seyreltilmiş ikincil antikor çözüm ekleyin x PBST oda sıcaklığında 1 h için ve slaytlar ışıktan korumak.</li>
		<li>İkincil çözümü kaldırmak ve yıkama slaytlar üç kez 1 ' x PBST 10 dk için. Son yıkama 300 eklemek nM DAPI.</li>
		<li>Medyayı çıkarın ve montaj medya ve bir coverslip ekleyin. Mağaza 4 oC ışıktan uzak görüntü için hazır kadar slaytlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. transkript analiz için Pancreatoids gelen RNA izolasyon
<ol><li>Borosilikat kılcal bir ağız pipet ile bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu kısırlık ve yer için 500 µL asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm bir 1,5 mL tüp içine bağlı kullanarak pancreatoids toplamak. -80 oC depolamak veya hemen RNA izolasyon için ilerlemek.</li>
	<li>RNA izolasyonu için gerekirse örnekleri buz çözme ve kloroform 100 µL ekleyin. Girdap iyi ve yerinde 4 oC 15 dakika süreyle santrifüj 4 oC. önceden serin<ol>
<li>Tüpler santrifüj ve 20 dk 4 oC., 12.000 g de tur içine koyun</li>
		<li>Tüpler katmanları ayrılması değil rahatsız etmek için dikkatli bir şekilde çıkarın. 200 µL pipet kullanarak, açık sulu çözüm toplamak ve küçük bir miktar beyaz protein katman ve pembe DNA katmanı arabelleğe bırakarak yeni bir 1,5 mL tüp içine yerleştirin. Bu süreçte bir şey için pipet ucu dokunma ve 1,5 mL tüp duvarlara dokunma.</li>
		<li>% 100 isopropanol 500 µL sulu katman ve girdap içeren yeni tüp ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dk, buz üzerinde daha uzun veya en fazla yağış oturmak izin bırakın gecede-20 oC.</li>
		<li>RNA cips için 4 oC de 15 dakika 12.000 g, santrifüj kapasitesi. İsopropanol Pelet bozmadan kaldırın. Not: pancreatoids küçük olduğu için bu pelet görünür olmaması olasıdır.</li>
		<li>Soğuk, % 75 etanol ekleyin ve tüp birkaç kez tersine çevirin. Santrifüje yerleştirin ve 9000 x g 10 dk 4 oC. Kaldır az için etanol ve spin 9000 x g de 2 min için spin.</li>
		<li>200 µL pipet Pelet bulunan bölge bağlantı kurmadan tüpte kalan herhangi bir etanol kaldırmak için kullanın. Kap buharlaşma kalıntısı etanol sağlamak için oda sıcaklığında 5-10 dk Tube açık bırakın.</li>
		<li>Pelet içinde temiz, nükleaz ücretsiz su 20 µL vortexing tarafından resuspend. İsteğe bağlı: Isı RNA, 65 oC 3 dk ve hemen buz için dönün. RNA-80 oC depolanan veya hemen ters transkripsiyon ve qPCR için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dawn+of+the+organoid+era%3A+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li>
<li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li>
<li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).</li>
<li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444236">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23995685">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).</li>
<li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+signals%2C+and+lineages+in+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li>
<li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li>
<li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li>
<li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1%2B+pancreatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li>
<li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li>
<li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromogranins+A+and+B%3A+the+first+25+years+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li>
<li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).</li>
<li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hormone+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li>
<li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).</li>
<li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).</li>
<li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Hücre kültür modelleri ilerlemesini düzgün geliştirme modeli, klinik hücre tipleri, test ilaç etkinliğini veya hastalara bile nakli üretmek için çok önemlidir. Biz hala organogenesis ve Fizyoloji mekanizmaları anlama çok uzak olduğu gibi ancak, yapay bir tabak içinde kalkınma recapitulating meydan okuyor içinde vivo. Böylece vitro hücre verimsiz oluşturulan, tam olarak fonksiyonel değil, uzun bir süre için muhafaza edilmesi veya diğer anormallikler vücuttaki karşılaştırılabilir hücrelerden liman. Gelişt...

Normal gelişim ve fizyolojisi mekanizmaları operasyona hastalığı nedenleri anlamak ve sonuçta tedavi yöntemleri yetiştirmek için her şeyden önemlidir. Kültür ve kök hücre ayırt gelişimin hızlı ve yüksek üretilen iş analizi olanak sağlarken, bilgi ile ilgili hücre kader düzenleyen mekanizmalar mevcut vücut ile sınırlıdır ve yapay olarak gelişiminde beyannamedir bir nispeten homojen, iki boyutlu durum1,2. Sadece dışsal etkiler, farklı hücre tipleri niş ve çevre ile etkilenen vivo içinde geliştirme sağlayan parakrin sinyalleri ve örgütsel destek organogenesis rehberlik etmek, ama Ayrıca bu hücrelerin işlevini kullanır onların çevresi için rehberlik3,4,5. Bu dış yardımlar önemi, farklılaşma protokolleri sınırlamalar ve in vivo fare modelleri zahmetli doğası göz önüne alındığında, yeni sistemleri temel gelişimsel süreçleri ve Fizyoloji deneysel olarak araştırmaya ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu, karmaşık organoids oluşturmak için iletişim kuralları ortaya çıkması organogenesis, fizyoloji, uyuşturucu etkinlik ve hatta patogenezinde. eğitim için uygun ve uyumlu bir sistem sağlar Mide ve bağırsak6 7 gibi farklı sistemleri organogenesis anlayışımızı genişlettik için fare organoids kurulması, gelişimsel karmaşıklığı vivo içinde daha az kısıtlamalarla çalışma için bir araç sağlayan ve vitro modelleri. Fare organoid bu gelişmeler nedeniyle oluşumu ve insan pluripotent gelişiyle kök hücreleri, insan bağırsak8, Retina9, böbrek10,11ve serebral12 organoids üretilen ve bu repertuar sadece gelişiminin mekanizmaları ile ilgili mevcut bilgi ile sınırlıdır.
Pankreas farklı hücre tipleri, ekzokrin pankreas yetmezliği13, pankreatit14, acinar hücrelerde acinar hücreleri ve kanalları dahil olmak üzere sayısız hastalıklar veba gibi özel ilgi pankreas organoids olduğunu ve Beta hücreleri diyabet15dakika sonra. Bu farklı hücre tipleri geliştirilmesi ile ilgili bilgi kazanıyor onların patoloji anlamada yardımcı olabilir ve ayrıca, kişiselleştirilmiş uyuşturucu tarama veya nakli için bir platform olarak hareket edebilir. Daha önce Greggio ve ark. vivo içinde morfogenez özetlemek ve tüm büyük pankreas epitel hücre oluşur organize, üç boyutlu, karmaşık yapıları geliştirmek fare pankreas organoids oluşturmak için bir yöntem geliştirdi 16,17türleri. Bu pankreas alanında önemli bir adım, özellikle yapım hücreleri vitro beta-hücre gelişimi biyolojik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ancak, organoids nerede etkileşim burnu ile Öğretim İpuçları17sağlamak dokusu içine nakledilen sürece bir kıtlık endokrin hücre bu protokol için kurdu. Mezenşim ağır endokrin delaminasyon ve farklılaşma3,4de dahil olmak üzere daha sonraki aşamaları için organogenesis erken aşamalarında gelen epitel gelişmekte olan Zarflama niş, en büyük kısmını teşkil eder, 18. Mezenşim etkileşim gelişmekte olan pankreas henüz dışsal sinyal ve in vivo hücresel karmaşıklık sürdürmenin önemini organogenesis çalışmak için başka bir örnektir.
Burada, pancreatoids, Disosiye e10.5 fare pankreas ataları olarak adlandırdığı üç boyutlu pankreas organoids oluşturmak nasıl açıklar. Bu pancreatoids yerel Mezenşim korumak, serbest dalgalı koşullarda kendini birleştirin ve endokrin beta hücreleri19sağlam bir dizi de dahil olmak üzere tüm büyük pankreas hücre tipleri oluşturmak. Önceki iletişim kuralları sağlam endokrin farklılaşma bulunmadığından bu yaklaşım endokrin geliştirme, analiz için uygundur. Ancak, pankreas organoids için iletişim kuralını kullanarak vd. daha iyi pankreas epitel dallanma ve morfogenez, analiz için uygun Greggio tarafından açıklandığı gibi dallanma olarak daha pancreatoids içinde sınırlıdır.

<table><tbody><tr>Kalibre Edilmiş Mikrokapiler Pipetler için <td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratör Borusu Tertibatları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Nükleaz içermeyen su</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Kılpiller Borular</td><td>Sutter Aletleri</td><td>GB1007515</td><td>OD 1mm, ID 0.75mm, 1.5cm uzunluk</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Hücre İtici 96 Kuyulu Mikroplaka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U-dip</td></tr><tr><td>Santrifüj 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Kromogranin-A antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt, Modüler Stereo Mikroskop M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayacı Slaytları</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ',6-Diamidin-2'-fenilindol-dihidroklorür)</td> <td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Toz</td></tr><tr><td>DBA antikoru</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispas II, Toz</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm; Titanyum; Biyoloji ucu</td></tr><tr><td>EGF (Epidermal büyüme faktörü)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Kanıt</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Döngüsü CO2 İnkübatörleri</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-271408</td><td>Poliklonal Fare IgG</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>İzothesia İzofluran, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin Antikoru</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Poliklonal Kobay</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Evrensel</td><td>KAPA Biyosistemleri</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasman</td><td>İnvitrojen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE Yüksek Çözünürlüklü Spektral Konfokal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Fare C-Peptid ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Fare Ultra Duyarlı İnsülin ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Mikrotom Bıçakları</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson İmmüno Araştırmaları</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 antikoru</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Monoklonal Fare MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Tek Kullanımlık Gömme Kalıpları</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13- Asetat</td><td>)Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5 mL Kapasiteli</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-10 Protein R</td><td>& D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-Asidik</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan R-Spondin I Protein</td><td>R& D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Süper Pap Kalem</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Termomikser R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Doku Tek OCT Bileşik</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktif</td><td>İnvitrojen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), Hücre</td></tr><tr><td>sayımı slaytları için</td>Fenol Kırmızı<td>Tripan Mavi Leke</td><td>İnvitrojen</td><td>15250061</td></tr><tr><td>yok Tripsin-EDTA (% 0.05) )</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Fenol Kırmızısı</td></tr><tr><td>Ultra Düşük Eklenti 24 Kuyulu Plaka</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Düşük Bağlantılı Küresel Plaka 96 Kuyulu</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Antikoru EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Poliklonal Tavuk IgY</td></tr><tr><td>Vorteks Cini</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihidroklorür</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>1254</td><td>ROCK inhibitörü olarak da bilinir</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade pancreatoids fare pankreas ataları vitro gelen nesil

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Pankreas karmaşık bir organ kan glikoz homeostazı ve sindirimi düzenler için birlikte çalışan birçok farklı hücre türleri modülüdür. Bu hücre türleri acinar hücreleri, bir arborized duktal sistem gut ve hormon üreten endokrin hücrelere sorumlu enzimleri ulaşım için enzim salgılayan içerir.
Endokrin beta hücreleri tek hücre tipi vücuttaki insülin kan şekeri düzeylerini düşürmek için üretmek vardır. Diyabet, bir kayıp veya beta hücre fonksiyon bozukluğu ile karakterize bir hastalık salgın boyutlarına ulaşıyor. Böylece, araştırmak amacıyla filtreleme için ilaç ve tedavi hücre tabanlı türetmek için kullanılan beta-hücre gelişimi için iletişim kuralları kurmak için önemlidir. Fare geliştirme deneysel incelenmesi gerekli olmakla birlikte, in vivo çalışmalar zahmetli ve zaman alıcı vardır. Kültürlü hücreleri filtreleme için daha uygun bir platform sağlamak; Ancak, hücresel çeşitlilik, mimari organizasyon ve hücresel etkileşimlerin bulundu korumak edemiyoruz içinde vivo. Böylece, pankreas organogenesis ve Fizyoloji araştırmak için yeni araçlar geliştirmek esastır.
Hücreleri düzenleyebilir ve karmaşık, fizyolojik olarak yetkili yetişkin organ ayırt pankreas epitel hücreleri Mezenşim organogenesis başlangıcından ile yakın ilişki içinde geliştirmek. Pankreas Mezenşim birçoğu de henüz, böylece sırasında vitro kültür özetlemek zor anlaşılır değil önemli sinyalleri endokrin gelişmesi için sağlar. Burada, biz pancreatoids olarak adlandırdığı Mezenşim korumak kültür üç boyutlu, hücresel karmaşık fare organoids için bir iletişim kuralı tanımlamak. E10.5 fare pankreas bud disseke, ayrışmış ve iskele-Alerjik bir ortamda kültürlenir. Bunlar yüzen hücreleri gelişmekte olan pancreatoid ve endokrin beta hücreleri gelişmekte olan acinar ve kanal hücreleri ile birlikte sağlam bir dizi Zarflama Mezenşim ile kendini topla. Bu sistem organogenesis sırasında ya da uyuşturucu, küçük molekül veya genetik tarama için hücre kader tayini, yapısal organizasyonu ve morfogenez, hücre-hücre etkileşimleri eğitim için kullanılabilir.

Fare embriyolar rahim boynuz dan e10.5, dikkatli diseksiyon PBS hasarsız embriyo için daha fazla diseksiyon (Şekil 1A) verim. Gastrointestinal sistem verimli bir şekilde dorsal pankreas bud bağırsak ve mide (Şekil 1C-F), muhakeme izin embriyo (Şekil 1B), kaldırılabilir. E10.5 pankreas bud daha önce karakterize; ataları Pdx1, Sox9, Ptf1a ve <...

Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Bu yöntem, endokrin hücrelerin mimari ve hücresel olarak karmaşık bir ortamda nasıl oluştuğunu anlamak için bu pankreatoidleri kullanarak pankreas alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, pankreatoidlerin, çevredeki mezenşimin dahil edilmesi nedeniyle endokrin hücreler geliştirmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, pankreas e10.5'te çok küçük olduğu için mücadele edecektir.Ve diseksiyon, yeterli kontamine olmayan doku elde etmek için pankreatoidlerin oluşumu için çok önemlidir. Diseksiyon için ayarlamak için bir buz kovası doldurun ve buzun içine bir kap fosfat tamponlu tuzlu su yerleştirin. İki ince uçlu forseps ve diseksiyon makasını %70 etanol ile temizleyin.Diseksiyon alanının yakınında, en az üç borosilikat kılcal tüp, bir çakmak ve filtrelenmiş 1000 mikrolitre pipet ucu içeren bir kap yerleştirin. Daha sonra, buz üzerinde 12 oyuklu bir plakanın ikinci kuyusunda sterilize edilmiş suda seyreltilmiş mililitre başına en az bir mililitre 1.25 miligram pipetleyin. PBS'yi 12 oyuklu plakanın birinci, üçüncü ve dördüncü kuyucuklarında pipetleyin.Ayrıca, buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe bir mililitre% 0.05 tripsin pipetleyin. IACUC yönergelerine uygun olarak e10.5 zamanlı hamile farelere ötenazi yaptıktan sonra, bölgeyi temizlemek için karın% 70 etanol püskürtün. Daha sonra makas ve forseps kullanarak farenin genital bölgesinde V şeklinde bir kesi yapın ve diyaframa kadar kesiye devam edin.Uterusun en üst yan kısımlarında bir kesi yaparak, organı fareden yukarı doğru çekerek ve bu kesiyi takip ederek genital bölgeye inerek uterusu dikkatlice çıkarın. Eksize edilen uterusu soğuk PBS ile 10 santimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Işık diseksiyon mikroskobu altında, petri kabını yerleştirin ve her embriyo arasına iki forseps yerleştirerek ve dokuyu yumurta sarısı kesesinden uzaklaştırarak rahim dokusunu dikkatlice açın.Embriyoları, yumurta sarısı kesesini forseps ile nazikçe kavrayarak ve taze, soğuk PBS ile 10 santimetrelik bir petri kabına yerleştirerek transfer edin. Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, 10 santimetrelik petri kabı kapağına birden fazla PBS damlası yerleştirin.Görünürlüğü sağlamak için ekstra-embriyonik dokular çıkarılırken diseksiyon sırasında embriyoyu transfer etmek için bu damlacıkları kullanın. Bir embriyoyu bir PBS damlasına aktarın ve kalan embriyolar buz üzerinde PBS'de kalırken forseps kullanarak yumurta sarısı kesesinden nazikçe çıkarın. Dokuya zarar vermeden embriyoyu hafifçe kepçelemek için forseps kullanarak embriyoyu yeni bir PBS damlasına taşımadan önce kafayı çıkarın.Yeni bir PBS damlasında, forseps kullanarak dört uzuv tomurcuğunu çıkarın. Forsepsleri uzuv tomurcuğunun bulunduğu açıklığa yerleştirin ve sadece en dış dokuyu öne doğru nazikçe yırtın. Embriyoyu döndürün ve arka bacak tomurcuğunda durarak arka yönde tekrarlayın.Bu noktada, gastrointestinal sistem görünür olmalıdır. Gastrointestinal sistemin arka bölgesi hafif bir bükülmeye sahiptir; Gastrointestinal sistem ile vücut duvarındaki omurga bölgesi arasındaki açıklıkta bu kıvrımın arkasına forseps yerleştirin. Gastrointestinal sistemi ayırın, kardiyak bölgenin bağlandığı en ön bölgeye ulaşılana kadar yavaşça yukarı doğru çalışın.Aşağıdaki adımlarda, pankreatoidleri pankreas dışı doku ile kontamine etmemek için kültürdeki çevre dokudan kaçınmak çok önemlidir. Bununla birlikte, tüm pankreas tomurcuğunu tutmazsanız, pankreatoidlerin sayısı ve boyutu bozulacaktır. Gastrointestinal sistemi taze PBS damlacığına aktarın.Gastrointestinal sistemi çevreleyen dış dokuyu çıkarmaya devam edin. Bu dış doku çıkarıldıktan sonra, pankreas tomurcuğu karaciğer tomurcuklarının arkasında, mide ve bağırsak arasında görüntülenebilir. Daha sonra forseps alın ve bağırsaktaki çıkıntılı tomurcuğun altındaki dokuyu nazikçe sıkıştırın ve pankreas tomurcuğunu hafifçe kaldırın.Tomurcuğun bağırsağa bağlandığı bölge sıkıştırıldıktan sonra tomurcuk ayrılır. Tomurcuğu 12 oyuklu plakanın ilk kuyusuna aktarmadan önce yeni bir PBS kabarcığında bir kez yıkayın ve PBS'yi buz üzerinde soğutun. Tüm tomurcuklar embriyolardan toplanana ve 12 oyuklu plakanın ilk oyuğuna yerleştirilene kadar tekrarlayın.Daha sonra, 12 kuyulu çanağı ışık diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra bölünme oranını hesaplamak için başarıyla diseke edilen pankreas tomurcuklarının sayısını sayın. Filtrelenmiş 1000 mikrolitrelik bir pipet ucunu, kılcal boru takılıyken pipete yerleştirin.Kılcal boruyu alevle sterilize edin ve kullanım kolaylığı için tüpte bir kıvrım oluşturun. Tomurcukları, temiz PBS içeren üçüncü oyuğa aktarmadan önce iki dakika boyunca soğuk dispas çözeltisi içeren ikinci oyuğa aktarmak için kılcal damarı kullanın. Tomurcukları yukarı ve aşağı pipetleyin ve temiz PBS içeren dördüncü kuyucuğa aktarın.Son olarak, kılcal cihazı kullanarak, tomurcukları% 0.05 tripsin içeren 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü önceden ısıtılmış 37 santigrat derece çalkalayıcıya yerleştirin ve dört ila beş dakika boyunca 1.500 RPM'de çalkalayın. Yaklaşık 10 saniye girdaplama yaptıktan sonra, tüpü hemen santrifüje yerleştirin ve 200 g'da beş dakika döndürün.Santrifüjlenmiş hücreleri rahatsız etmemek için yaklaşık 50 mikrolitre çözelti dışındaki tüm çözeltileri dikkatli bir şekilde çıkarın. Santrifüjlenmiş hücrelere 400 mikrolitre organogenez ortamında toplanan her tomurcuk için, üç kez girdap atın ve düşük bağlantılı 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 100 mikrolitre plaka koyun, tomurcukları bir ila dört oranında bölün. Ayrışmış hücrelerin serbestçe yüzdüğünü görselleştirmek için mikroskop altında kontrol edin.Daha sonra kültür kabını orta hızda bir külbütör üzerinde% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Rahim boynuzundan e10.5'teki fare embriyolarının dikkatli bir şekilde diseksiyonu, daha fazla diseksiyon için PBS'de hasarsız embriyolar vermelidir. Gastrointestinal sistem embriyodan verimli bir şekilde çıkarılabilir, bu da bağırsak ve midenin birleştiği yerde dorsal pankreas tomurcuğunun ayırt edilmesine izin verir.Organogenez ortamında, bu serbest yüzen iskele içermeyen hücreler kendi kendine bir araya gelir ve kültürde en az 10 gün boyunca büyüyen ve devam eden üç boyutlu pankreatoidler halinde organize olur. Bir protein kinaz C aktivatörünün yüksek konsantrasyonlarda uygulanması, gelişmekte olan pankreatoidlerin morfolojisini değiştirerek gevşek bir şekilde ilişkili epitel hücrelerine ve artan dallanmaya yol açar. Ek olarak, transgenik hayvanların kullanılması, hücrelerin gerçek zamanlı olarak farklılaştıkça görselleştirilmesine izin verir.Pankreas mezenşim dokusunun pankreas epitel hücreleri ile ilişkisini değerlendirmek için, her dokunun belirteçleri için immün boyama yapılabilir. Bir kanal markörünün bir endokrin markör ve çekirdeklerle immün boyanması, pankreatoidlerde çok soylu oluşumu ortaya çıkarır. Bir pankreatik progenitör markörü ile birlikte boyanmış bir mezenşim markörü, mezenşimin pankreatoidi sardığını gösterir.Beta hücre gelişimi, epitel belirteci ve beta hücre belirteci için boyama ile ortaya çıkar. Kantitatif PCR analizi kullanılarak, progenitör genler ve farklılaşmış belirteçler gibi progenitörlerin ve farklılaşan hücrelerin transkriptleri değerlendirilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, hazırlık süresi de dahil olmak üzere yaklaşık bir saat içinde yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, pankreatoid oluşturmak için 10.5 fareden pankreas dokusu elde etmek için diseksiyonun nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, GI yolunu embriyolardan dikkatlice çıkarmayı unutmamak önemlidir, aksi takdirde pankreas tomurcuğunu bulmak çok zor olacaktır. Bu prosedürü takiben, glikoz stimülasyonundan sonra ne kadar insülin veya C-peptid üretildiği gibi ek soruları yanıtlamak için GSIS ve ELISA gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Geliştirildikten sonra, bu teknik, küçük moleküller kullanarak PKC aktivasyonunun morfolojik sonuçlarını keşfetmemizin yolunu açtı. İfadenin transkripsiyon faktörünün etkisini incelemek ve hatta önemli epistasis deneyleri yapmak için bu sistemi daha fazla uygulamanın bir yolu.

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve...

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir...

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin fare pankreas progenitörlerinden iskele-free 3D insülin ifade eden pancreatoid üretimini. Bu yöntem endokrin hücre gelişimini ve diyabet araştırmalarını ilerletmek için değerli bir model sunar.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Daha fazla video keşfet