İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Bu yöntem, endokrin hücrelerin mimari ve hücresel olarak karmaşık bir ortamda nasıl oluştuğunu anlamak için bu pankreatoidleri kullanarak pankreas alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, pankreatoidlerin, çevredeki mezenşimin dahil edilmesi nedeniyle endokrin hücreler geliştirmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, pankreas e10.5'te çok küçük olduğu için mücadele edecektir.

Ve diseksiyon, yeterli kontamine olmayan doku elde etmek için pankreatoidlerin oluşumu için çok önemlidir. Diseksiyon için ayarlamak için bir buz kovası doldurun ve buzun içine bir kap fosfat tamponlu tuzlu su yerleştirin. İki ince uçlu forseps ve diseksiyon makasını %70 etanol ile temizleyin.

Diseksiyon alanının yakınında, en az üç borosilikat kılcal tüp, bir çakmak ve filtrelenmiş 1000 mikrolitre pipet ucu içeren bir kap yerleştirin. Daha sonra, buz üzerinde 12 oyuklu bir plakanın ikinci kuyusunda sterilize edilmiş suda seyreltilmiş mililitre başına en az bir mililitre 1.25 miligram pipetleyin. PBS'yi 12 oyuklu plakanın birinci, üçüncü ve dördüncü kuyucuklarında pipetleyin.

Ayrıca, buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe bir mililitre% 0.05 tripsin pipetleyin. IACUC yönergelerine uygun olarak e10.5 zamanlı hamile farelere ötenazi yaptıktan sonra, bölgeyi temizlemek için karın% 70 etanol püskürtün. Daha sonra makas ve forseps kullanarak farenin genital bölgesinde V şeklinde bir kesi yapın ve diyaframa kadar kesiye devam edin.

Uterusun en üst yan kısımlarında bir kesi yaparak, organı fareden yukarı doğru çekerek ve bu kesiyi takip ederek genital bölgeye inerek uterusu dikkatlice çıkarın. Eksize edilen uterusu soğuk PBS ile 10 santimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Işık diseksiyon mikroskobu altında, petri kabını yerleştirin ve her embriyo arasına iki forseps yerleştirerek ve dokuyu yumurta sarısı kesesinden uzaklaştırarak rahim dokusunu dikkatlice açın.

Embriyoları, yumurta sarısı kesesini forseps ile nazikçe kavrayarak ve taze, soğuk PBS ile 10 santimetrelik bir petri kabına yerleştirerek transfer edin. Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, 10 santimetrelik petri kabı kapağına birden fazla PBS damlası yerleştirin.

Görünürlüğü sağlamak için ekstra-embriyonik dokular çıkarılırken diseksiyon sırasında embriyoyu transfer etmek için bu damlacıkları kullanın. Bir embriyoyu bir PBS damlasına aktarın ve kalan embriyolar buz üzerinde PBS'de kalırken forseps kullanarak yumurta sarısı kesesinden nazikçe çıkarın. Dokuya zarar vermeden embriyoyu hafifçe kepçelemek için forseps kullanarak embriyoyu yeni bir PBS damlasına taşımadan önce kafayı çıkarın.

Yeni bir PBS damlasında, forseps kullanarak dört uzuv tomurcuğunu çıkarın. Forsepsleri uzuv tomurcuğunun bulunduğu açıklığa yerleştirin ve sadece en dış dokuyu öne doğru nazikçe yırtın. Embriyoyu döndürün ve arka bacak tomurcuğunda durarak arka yönde tekrarlayın.

Bu noktada, gastrointestinal sistem görünür olmalıdır. Gastrointestinal sistemin arka bölgesi hafif bir bükülmeye sahiptir; Gastrointestinal sistem ile vücut duvarındaki omurga bölgesi arasındaki açıklıkta bu kıvrımın arkasına forseps yerleştirin. Gastrointestinal sistemi ayırın, kardiyak bölgenin bağlandığı en ön bölgeye ulaşılana kadar yavaşça yukarı doğru çalışın.

Aşağıdaki adımlarda, pankreatoidleri pankreas dışı doku ile kontamine etmemek için kültürdeki çevre dokudan kaçınmak çok önemlidir. Bununla birlikte, tüm pankreas tomurcuğunu tutmazsanız, pankreatoidlerin sayısı ve boyutu bozulacaktır. Gastrointestinal sistemi taze PBS damlacığına aktarın.

Gastrointestinal sistemi çevreleyen dış dokuyu çıkarmaya devam edin. Bu dış doku çıkarıldıktan sonra, pankreas tomurcuğu karaciğer tomurcuklarının arkasında, mide ve bağırsak arasında görüntülenebilir. Daha sonra forseps alın ve bağırsaktaki çıkıntılı tomurcuğun altındaki dokuyu nazikçe sıkıştırın ve pankreas tomurcuğunu hafifçe kaldırın.

Tomurcuğun bağırsağa bağlandığı bölge sıkıştırıldıktan sonra tomurcuk ayrılır. Tomurcuğu 12 oyuklu plakanın ilk kuyusuna aktarmadan önce yeni bir PBS kabarcığında bir kez yıkayın ve PBS'yi buz üzerinde soğutun. Tüm tomurcuklar embriyolardan toplanana ve 12 oyuklu plakanın ilk oyuğuna yerleştirilene kadar tekrarlayın.

Daha sonra, 12 kuyulu çanağı ışık diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra bölünme oranını hesaplamak için başarıyla diseke edilen pankreas tomurcuklarının sayısını sayın. Filtrelenmiş 1000 mikrolitrelik bir pipet ucunu, kılcal boru takılıyken pipete yerleştirin.

Kılcal boruyu alevle sterilize edin ve kullanım kolaylığı için tüpte bir kıvrım oluşturun. Tomurcukları, temiz PBS içeren üçüncü oyuğa aktarmadan önce iki dakika boyunca soğuk dispas çözeltisi içeren ikinci oyuğa aktarmak için kılcal damarı kullanın. Tomurcukları yukarı ve aşağı pipetleyin ve temiz PBS içeren dördüncü kuyucuğa aktarın.

Son olarak, kılcal cihazı kullanarak, tomurcukları% 0.05 tripsin içeren 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü önceden ısıtılmış 37 santigrat derece çalkalayıcıya yerleştirin ve dört ila beş dakika boyunca 1.500 RPM'de çalkalayın. Yaklaşık 10 saniye girdaplama yaptıktan sonra, tüpü hemen santrifüje yerleştirin ve 200 g'da beş dakika döndürün.

Santrifüjlenmiş hücreleri rahatsız etmemek için yaklaşık 50 mikrolitre çözelti dışındaki tüm çözeltileri dikkatli bir şekilde çıkarın. Santrifüjlenmiş hücrelere 400 mikrolitre organogenez ortamında toplanan her tomurcuk için, üç kez girdap atın ve düşük bağlantılı 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 100 mikrolitre plaka koyun, tomurcukları bir ila dört oranında bölün. Ayrışmış hücrelerin serbestçe yüzdüğünü görselleştirmek için mikroskop altında kontrol edin.

Daha sonra kültür kabını orta hızda bir külbütör üzerinde% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Rahim boynuzundan e10.5'teki fare embriyolarının dikkatli bir şekilde diseksiyonu, daha fazla diseksiyon için PBS'de hasarsız embriyolar vermelidir. Gastrointestinal sistem embriyodan verimli bir şekilde çıkarılabilir, bu da bağırsak ve midenin birleştiği yerde dorsal pankreas tomurcuğunun ayırt edilmesine izin verir.

Organogenez ortamında, bu serbest yüzen iskele içermeyen hücreler kendi kendine bir araya gelir ve kültürde en az 10 gün boyunca büyüyen ve devam eden üç boyutlu pankreatoidler halinde organize olur. Bir protein kinaz C aktivatörünün yüksek konsantrasyonlarda uygulanması, gelişmekte olan pankreatoidlerin morfolojisini değiştirerek gevşek bir şekilde ilişkili epitel hücrelerine ve artan dallanmaya yol açar. Ek olarak, transgenik hayvanların kullanılması, hücrelerin gerçek zamanlı olarak farklılaştıkça görselleştirilmesine izin verir.

Pankreas mezenşim dokusunun pankreas epitel hücreleri ile ilişkisini değerlendirmek için, her dokunun belirteçleri için immün boyama yapılabilir. Bir kanal markörünün bir endokrin markör ve çekirdeklerle immün boyanması, pankreatoidlerde çok soylu oluşumu ortaya çıkarır. Bir pankreatik progenitör markörü ile birlikte boyanmış bir mezenşim markörü, mezenşimin pankreatoidi sardığını gösterir.

Beta hücre gelişimi, epitel belirteci ve beta hücre belirteci için boyama ile ortaya çıkar. Kantitatif PCR analizi kullanılarak, progenitör genler ve farklılaşmış belirteçler gibi progenitörlerin ve farklılaşan hücrelerin transkriptleri değerlendirilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, hazırlık süresi de dahil olmak üzere yaklaşık bir saat içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, pankreatoid oluşturmak için 10.5 fareden pankreas dokusu elde etmek için diseksiyonun nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, GI yolunu embriyolardan dikkatlice çıkarmayı unutmamak önemlidir, aksi takdirde pankreas tomurcuğunu bulmak çok zor olacaktır. Bu prosedürü takiben, glikoz stimülasyonundan sonra ne kadar insülin veya C-peptid üretildiği gibi ek soruları yanıtlamak için GSIS ve ELISA gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, küçük moleküller kullanarak PKC aktivasyonunun morfolojik sonuçlarını keşfetmemizin yolunu açtı. İfadenin transkripsiyon faktörünün etkisini incelemek ve hatta önemli epistasis deneyleri yapmak için bu sistemi daha fazla uygulamanın bir yolu.