Name: Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Öğrenin polisom profilleme tekniğini Leishmania major, insan hücreleri ve fare testisinde protein sentezi düzenlemesini incelemek için. Bu yöntem translasyon aktivasyonu ve baskılanması mekanizmalarını ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Ching Lee ses kaydı ile yardım için teşekkür. Araştırma Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Start-up fonlarından desteklenen bir durumdu ve Center of Excellence translasyonel Neuroscience ve tedavi (CTNT) tarafından PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K. için vermek; NIH grant tarafından kısmen K.Z. James C. Huffman ve Kristen R. Baca R01AI099380 CISER (kök Tümleştirme eğitim ve Araştırma Merkezi) bilim adamları vardı ve program tarafından desteklenen edildi.

Tüm hayvan tedaviler ve işleme dokuların çalışmada elde edilen Kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Enstitüleri uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı Sağlık hayvan refahı kuralları, protokol numarası 96005. Lütfen omurgalı hayvanlar kurban ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi doku yönergelere göre hazırlayın. Böyle bir komite eksik, lütfen Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere bakın. Yetişkin (> 60 gün eski) C57BL/6 fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanlar ve doku kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre elde edilmiştir. Ötenazi için tek bir fare küçük bir odaya yerleştirildi ve hava yavaş yavaş ile yaklaşık % 30 yerinden karbondioksit anestezi ve hayvan kırılmasını en aza indirmek için. Nefes kesilmesi ölüm hayvan dokuları hasat önce onaylamak için servikal çıkığı kullandık.
Dikkat: Tüm iş ile canlı LEISHMANIA ve kültürlü insan hücreleri Biyogüvenlik BSL-2 sertifikalı dolap yapıldı.
1. hazırlanması sitoplazmik Lysates LEISHMANIA büyük , kültürlü insan hücreleri ve fare dokular
Not: Farklı kaynak malzemelerden lysate müstahzarları çeşitli farklar vardır. Sükroz degrade hazırlık ve polysomal ayırma da dahil olmak üzere diğer adımlar aynıdır ve örnek kaynağında bağlı değildir.
<ol><li>
LEISHMANIA büyük sitoplazmik lysate hazırlık
	<ol>
<li>LEISHMANIA büyük (FV1 zorlanma) hücrelerin % 10 Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin karışımı içeren 1 x M199 orta29 30 ml aşılamak (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak), 1 x 105 hücre/mL yoğunluğu . Not: LEISHMANIA büyük hücreleri içeren tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yürütülmelidir.</li>
		<li>Hücreleri da kuluçka makinesine koyun ve onları büyümek 27 ° C'de logaritmik faz kadar (5 x 106 hücre/mL günlük karşılık gelir). Genellikle büyümeye yaklaşık iki gün sürer.</li>
		<li>Sikloheksimit LEISHMANIA büyük kültür 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklamak için son bir konsantrasyon için ekleyin. Kuluçka makinesi 27 ° C'de 10 dakika geri hücreleri yerleştirmek</li>
		<li>Sikloheksimit tedavi tamamlandıktan sonra hücre 50 mL konik tüp aktarmak ve onları 1800 x g ve 8 dk. atma süpernatant için 4 ° C, spin.</li>
		<li>Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 30 mL hücrelerle yıkayın. 8 dk santrifüj 1800 x g ve 4 ° C.</li>
		<li>Süpernatant atmak. 1 mL DPBS hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Bir aliquot hücre alıp % 3,5 formaldehit çözüm ile karıştırın.</li>
		<li>Hemasitometre tarafından hücreleri saymak ve onların konsantrasyonu belirlemek. Hücreler için istediğiniz sayıyı microfuge tüp içine aktarın. Lysate 0.5x108-2 x 108 hücre/mL hazırlanmış bir Sükroz degrade yükleme için yeterli olur.</li>
		<li>Hücreleri 1800 x g de spin ve 4 ° C 8 dakika süreyle süpernatant atın.</li>
		<li>Hücre Pelet lizis arabellek proteaz inhibitörleri ve RNase inhibitörü (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, %1 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 200 adet/mL RNase inhibitörü) içeren 1 ml buzda resuspend.</li>
		<li>Lysate 23'lik iğne ile üç kez geçmek. Lysate iğne geçitten sonra şeffaf hale gelmelidir.</li>
		<li>Santrifüj 11,200 x g ve 4 ° C lysate açıklamak için 10 dakika için. Açıklanan transfer lysate için yeni bir tüp ve sukroz degrade ultrasantrifüj kadar buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Toplamak, lysate (daha sonra analiz etmek için) giriş olarak 400-500 μL hemen gelecekteki protein analizi için sıvı azot Dondur veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kültürlü insan HeLa hücreleri sitoplazmik lysate hazırlık
	<ol>
<li>HeLa hücreleri bölme ve onları 20 mL % 10 FBS ve penisilin/streptomisin karışımı içeren DMEM orta tohum (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak) hücre ile 2 x 105 hücre/mL bir 15 cm tabak içinde saymak.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 20-24 h. gerçekleştir plazmid DNA transfection göre üreticinin iletişim kuralları için HeLa hücreleri büyümek.</li>
		<li>Transfection 37 ° c, % 5 CO2sonra hücreler 24 h için yaymak.</li>
		<li>Sikloheksimit 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklayın ve hücreler için 10 dk. 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya son konsantrasyonu için yetiştirilen HeLa hücreleri ekleyin. Orta Aspire edin. Buz soğuk DPBS iki kez hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>Lizis arabelleği (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA-free), 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin) 500 μL plakasına eklemek ve hücreleri üzerinde buz kazımak.</li>
		<li>Lysed hücre microfuge tüp aktarın. NP-40 konsantrasyonu % 0,5 ve MgCl2 ' ye göre örnek artan hacmi 5 mM için ayarlayın.</li>
		<li>Lysate 23'lik iğne ile 3 - 6 kez geçmek.</li>
		<li>11,200 x g de ve 4 ° C lysate netleştirmek 8 min için spin. Santrifüjü sonra yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bir Spektrofotometre hücre lizis etkinliğini değerlendirmek ve yükleme için örnek miktarına geçişin belirlemek için kullanın. 10 μL örnek %0,1 0.5 mL için eklemek Sodyum Lauryl Sülfat (SDS). % 0.1 SDS karşı boş. Ölçmek Absorbans 260 nm. Beklenen Absorbans değerdir etrafında 15-20 adet/mL.</li>
		<li>Tüm örnekleri ile lizis arabelleğe Sükroz degrade Santrifüjü önce aynı Absorbans değeri oranında seyreltin. Buz üzerinde örnekleri Sükroz degrade Santrifüjü kadar tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare testislerden sitoplazmik lysate hazırlık
	<ol>
<li>Fare testis incelemek. Küçük bir insizyon attım tunica albuginea yapmak ve testis seminifer tübüllerin toplamak ve 5 mL 0,1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile birlikte DPBS de içeren bir 15 mL konik tüp aktarmak.</li>
		<li>Doku birkaç kez ters çevirme tarafından kuvvetle karıştırın. Doku birim ağırlık buz üzerinde 5 min için yerleşmek izin verir.</li>
		<li>Kaldırmak ve bağ hücre ve doku parçaları içeren bulutlu arabellek atın. Yordam 2-3 kez daha tekrarlayın. Kalan beyaz Pelet seminifer tübüllerin ve germ hücreleri için zenginleştirilmiştir.</li>
		<li>Seminifer tübül Pelet 2 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve 500 x g 1 dk. spin süpernatant atın.</li>
		<li>Lizis arabelleği (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 1 mg/mL heparin veya RNase inhibitörü 200 adet/mL) 500 µL tübüllerin için ekleyin. Doku triturate için bir pipet kullanın.</li>
		<li>Süspansiyon küçük ve aktarım (0.5-1.0 mL) Dounce homogenizer. Yedi ya da sekiz darbeleri cam havaneli ile doku bozabilir.</li>
		<li>Lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
		<li>Örneği 12.000 x g ve lysate temizlemek 8 dk 4 ° C'santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni tüp ve mağaza buza Sükroz degrade yükleme kadar aktarın.</li>
		<li>Lysate giriş örnek olarak, 50 μL toplamak, bu hemen gelecek protein analizi için-80 ° C'de dondurmak; veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sükroz degrade hazırlık ve ultrasantrifüj
<ol><li>% 10 Sükroz veya % 50 Sükroz içeren iki Sükroz degrade Çözümleri (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl), hazır olun. (Tris-HCl, pH 7.4, HEPES yerine kullanılabilir). 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin deneysel tasarım göre ekleyin. Bir ultracentrifuge tüp SW 41 rotor için işaretleyici bloğu içine yerleştirin ve blok üst düzey çizgi çizin. Tüp istikrarlı bir raf aktarın.</li>
	<li>Bir 10 mL şırınga bağlı katman aygıtı ile almak ve % 10 Sükroz çözüm (yukarıdaki gibi hazırlanmış) ile şırıngaya doldur. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar ultracentrifuge tüp alt kısmında bõrakõn.</li>
	<li>% 50 Sükroz çözüm ile başka bir şırıngaya doldur ve dikkatle tüpün dibine % 10 Sükroz katmanı yoluyla onun katmanlama aygıtını takın. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar Alttan başlayarak Sükroz çözüm serbest bırakın. Sağlanan kapaklı tüp kapatın.</li>
	<li>Sükroz degrade hazırlamak için degrade makinesi aygıtı ONaçın. Yukarı veya aşağı düğmelerini kullanarak plaka seviye ve DONEtuşuna basın. Tesviye geçişin doğrusallık için önemlidir.</li>
	<li>Plaka tesviye sonra GRAD degrade menüsünü açmak için tuşuna basın. Degrade menüsünden liste gidin ve SW 41 Ti rotor seçin. Sonra istenen Sükroz degrade yukarı ve aşağı düğmelerini kullanarak menü listesinden seçin. Basın kullanın.</li>
	<li>Degrade boru tutucu degrade makinesi tabağa yerleştirin. Tüp tutucu aktarın. Aynı anda en fazla 6 degradeler hazırlanabilir. Basın çalıştırmak. Degrade makinesi programlanmış hızlı ve doğrusal gradyan oluşturan açıları tüpler döner. Degrade hazırlamak için sadece birkaç dakika sürer.</li>
	<li>İşlem tamamlandığında, tüpler bir rafa yerleştirin. Kapaklar çıkar. Aynı birim numune hacmi olarak ultracentrifuge tüpler tepesinden kaldırın.</li>
	<li>Dikkatle lysate 15-20 A260 adet polizomlar üst içeren 400-500 μL yükleyin. Tüpler rotor kovaları getirin ve onları dengesi.</li>
	<li>Santrifüj 260.000 x g ve 4 ° C 2 h SW 41 rotor kullanarak için.</li>
</ol>3. polysome ayırma ve örnek koleksiyonu
Not: lysate hazırlıklar kaynağına bağlı olarak bazı farklar varken, degrade hazırlık ve polysome ayırma iletişim kuralları her türlü lysates aynıdır.
<ol><li>Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra rotor kova tüpler ile Buza koyun. Kesir toplayıcı ve degrade fractionator ONaçmak. İnceden inceye gözden geçirmek fractionator menüsünde'i tıklatın. Bir raf 24 koleksiyonu tüpler kesir toplayıcı koymak.</li>
	<li>Yan tarafında fractionator deiyonize su ile durulama su deposu doldurmak. 10 için DURULAMA tuşuna basın s fractionator üzerinde pompa durulayın. Pistonu kalibrasyon için su ile dolu şırınga ile durulama adaptörü takın.</li>
	<li>Fractionator yazılım bilgisayar açın. Basın kalibre. Varsayılan ayarları kullanın ve OKtuşuna basın. Şırıngadan suyu enjekte etmeye hazır ol.</li>
	<li>Kalibrasyon yapmak için Tamam tuşuna basın. Hemen sonraki 5 için su enjekte başlatmak s. Bu süre içinde su UV dedektörü akışı cep akacaktır ve enstrüman kalibre. İşareti Sıfır Kalibrasyon tamamlandı görünür. Araç ayırma için hazırdır.</li>
	<li>Durulama adaptör şırınga ile kaldırın. Bir ipucu fractionator piston için ekleyin.</li>
	<li>Pirinç hava Vana ve basın hava anahtarı 10 için aç s kuru boru ve akış hücre. Hava vanayı kapat.</li>
	<li>Yavaşça rotor kova degrade tüpü çıkarması ve rafa yerleştirin. Boru tutucu kap tüp uygulamak ve dikkatle tüp tüp yuvasına taşımak ve konumda kilit.</li>
	<li>Yer tutucu fractionator piston altında. Çoğu zaman, polysomal bantları gözle görülebilir. Kesir sayıları ve birim için istenen ayarları tanıtmak (500 μL/kısmını 24 kesirler genellikle yeterlidir). Dosyayı uygun şekilde adlandırın. Tamam, sonra Gitmek için grafik düğmesini tuşuna basın. Bir sonraki pencerede Başlat taramatuşuna basın. Ayarları görünür, Tamam'ıtıklatın. Toplayıcı ilk kesir için cilt payı hareket edecek ve piston tüpün içine taşınır. Piston üst geçişin ulaştığında seçili hızını yavaşlatır ve kesirler toplanacaktır. Rapor tamamlandığında, piston degrade tüp dışına taşır.</li>
	<li>Pirinç hava Vana ve basın hava anahtar son kesir almak için fractionator üzerinde açın.</li>
	<li>Tüpler raf buz üzerinde hareket ettirin.</li>
	<li>2 cilt RNA arıtma reaktif her kesir ve flash için sıvı azot RNA arıtma kadar dondurmak ekleyin. Alternatif olarak, protein çözümlenmesi gerekiyorsa, onları Western Blot (bkz. Bölüm 8) konsantre için % 10 son konsantrasyon trichloroacetic asit ekleyin.</li>
</ol>4. mRNA'ların seviyeleri sırasında RT-qPCR veri analizi normalleştirme için sentetik RNA In Vitro hazırlanması
Not: E. coli OmpA mRNA normalleştirme için bu protokol için kullanılır. MRNA'ların okudu organizmanın ile kapsamlı kimlik yok diğer RNA (memeli veya LEISHMANIA) kullanılabilir.
<ol><li>Standart bir PCR reaksiyon gelen OmpA gene30içeren bir plazmid tarafından SP6 organizatörü içeren OmpA DNA parçası hazırlamak.</li>
	<li>100 µL karışımı hazırlayın: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase inhibitörü, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA polimeraz , 0.005 U/μL pyrophosphatase.</li>
	<li>2 h için 40 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>RNA, RNA arıtma paketi tarafından arındırmak.</li>
	<li>Konsantrasyon Spektrofotometre tarafından ölçmek ve özel Jel Elektroforez tarafından inceleyin.</li>
</ol>5. RNA izolasyonu degrade kesirler ve cDNA hazırlık
Not: bir RNase inhibitörü ribonükleaz inhibitör kullandıysanız doğrudan bu iletişim kuralı için RNA arıtma ile devam edin. Ancak, ribonükleaz inhibitör kullanıldığında, heparin transkriptaz cDNA hazırlanmasında kullanılan yapılmasını engeller. Bu nedenle, heparin lizis tampon ve degrade kullanıldıysa RNA'ın ek arıtma gerekli olacaktır. Bkz. Bölüm 6 heparin kullandıysanız RNA cDNA sentezi için hazırlamak için.
<ol><li>RNA arıtma reaktif içeren örnekleri çözülme, 20 eklemek ng RT-qPCR sonuçları normalleştirme için iç kontrol olarak sentetik RNA'ın. Bir değişiklik dışında üreticinin protokolüne göre RNA hazırlık ile devam edin. RNA sınıf glikojen (20 µg) önceki isopropanol bulutlu 1 µL ekleyin. 20-25 µL RNase free su RNA granül geçiyoruz. Not: Glikojen bir taşıyıcı olarak hizmet vermektedir ve kayıpları önlemek ve arıtma sırasında RNA Pelet görselleştirmek için yardımcı olur. OmpA mRNA daha fazla normalleştirme RT-qPCR reaksiyonlarda kullanılır.</li>
	<li>RNA konsantrasyonu yeterli verim sağlamak için Spektrofotometre kullanarak ölçmek. 40'lı, 60'ların ve monosomes prepolysomes olarak içeren RNA kesirler eşit miktarda birleştirin. 2-4 ribozomlara içeren kesirleri ışık polizomlar birleştirmek ve 5-8 ribozomlar olan kesirleri ağır polizomlar birleştirir.</li>
	<li>5-10 µL RNA kombine kesirler üzerinden bir seti kullanarak ve üreticinin önerilerini takip cDNAs hazırlamak için kullanın.</li>
	<li>Nükleaz boş su 80 µL cDNA 20 µL için ekleyin. CDNA örnekleri-20 ° C'de dondurmak</li>
</ol>6. RNA arıtma Heparin kontaminasyonu üzerinden
Not: Heparin nükleik asit enzimler transkriptaz gibi işleme engeller. Heparin lizis arabellek ve/veya Degrade kullanıldığında bu nedenle, bu ek arıtma iletişim kuralını kullanın.
<ol><li>LiCl 1 M son konsantrasyonu arıtılmış RNA örnekleri için ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri mix ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>16.000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika örnekleri spin.</li>
	<li>Süpernatant mümkün olduğu bir pipet kullanarak tamamlanmış olarak kaldırın.</li>
	<li>Yaklaşık 5 dakika için granül kuruması.</li>
	<li>Granül RNase free su ilk hacmi yeniden askıya alma.</li>
	<li>260 spektrofotometrik ölçüm gerçekleştirmek nm RNA konsantrasyonu belirlemek için. Genellikle, örnek kaybı en az düzeydedir.</li>
</ol>7. RT-qPCR ve mRNA dağıtım veri analizi
<ol><li>Birleştirmek su, 20 μL SYBR yeşil, gen belirli astar (2,5 μM kümesi) 4,8 μL 10.2 μL, cDNA 5 μL, iyice karıştırın ve triplicates bir kuyu başına 10 μL 384-şey plaka yüklemek.</li>
	<li>Levha yapıştırıcı film ile sıkı bir şekilde kapak ve 1800 x g 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak qPCR reaksiyon Tablo 1' de gösterilen şartlar altında ayarlayın.</li>
	<li>Döngüsü eşik (CT) kullanarak değerleri ve karşılaştırmalı CT (ΔΔCT) yöntemi31 yüzdesi (%) olarak açıklanan32 bir değişiklik ile prepolysomes, hafif ve ağır polizomlar mRNA dağılımının hesaplama. Sentetik RNA (burada OmpA) veri normalleştirme RT-qPCR veri analizi için kullanın. Sentetik RNA göreli mRNA'ların düzeylerini hesaplama ve karşılaştırmak onları bir degrade farklı kesirler görüntüleyen bir normalleştirme denetimi sağlar.</li>
</ol>8. analiz Western Blot tarafından Polysomal kesirler proteinlerin
<ol><li>%100 (w/v) stoktan seçilen kesirler (500 μL) son konsantrasyonu % 10, trichloroacetic asit (TCA) eklemek almak için en az 15 dk, bir microfuge santrifüje 5 min için buz üstünde, süpernatant atmak, iki kez buz gibi soğuk aseton ile yıkayın ve S 25 μL içinde erimesi DS-sayfa örnek yükleme arabellek Elektroforez için.</li>
	<li>SDS-sayfa yükleme ve PVDF membran için aşağıdaki transferi ile standart Elektroforez kuralları. Western Blot33için devam edin.</li>
</ol>

<ol><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Capewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Trypanosoma+brucei+Total+and+Polysomal+mRNA+during+Development+within+Its+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.</a> PLoS One. 8 (6), e67069(2013).</li>
<li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).</li>
<li>Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+immune+responses%3A+from+transcripts+to+translatomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes.</a> Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).</li>
<li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycloheximide%3A+Aspects+of+Inhibition+of+Protein+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li>
<li>Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Zuccotti, P., Modelska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Translatome+with+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying the Translatome with Polysome Profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).</li>
<li>Arava, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+translation+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoCAGE+reveals+5%27+UTR+features+that+define+specific+modes+of+translation+of+functionally+related+MTOR-sensitive+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs.</a> Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).</li>
<li>Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+shows+that+miR-430+reduces+translation+before+causing+mRNA+decay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish.</a> Science. 336 (6078), 233-237 (2012).</li>
<li>Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nip7p+interacts+with+Nop8p%2C+an+essential+nucleolar+protein+required+for+60S+ribosome+biogenesis%2C+and+the+exosome+subunit+Rrp43p%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p.</a> Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Gkogkas, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism-related+deficits+via+dysregulated+eIF4E-dependent+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control.</a> Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).</li>
<li>Robichaud, N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+and+the+cancer+cell+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control and the cancer cell response to stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).</li>
<li>Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+protein+synthesis+and+the+effects+of+catabolic+states%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).</li>
<li>Ishimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+function.+Ribosome+stalling+induced+by+mutation+of+a+CNS-specific+tRNA+causes+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration.</a> Science. 345 (6195), 455-459 (2014).</li>
<li>Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+RNAs+repress+translation+after+initiation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells.</a> Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 14 (11), R128(2013).</li>
<li>De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation in trypanosomatids.</a> Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).</li>
<li>Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+related+to+stress+response+and+differentiation+in+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa.</a> World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).</li>
<li>De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+differentiation+in+Leishmania+lifecycle+progression%3A+post-transcriptional+control+conducts+the+orchestra%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra.</a> Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).</li>
<li>Soto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-dependent+translation+of+histone+mRNAs+is+the+key+control+point+for+regulation+of+histone+biosynthesis+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum.</a> Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).</li>
<li>McNicoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3+%27-untranslated+region+elements+regulate+stage-specific+mRNA+accumulation+and+translation+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).</li>
<li>Folgueira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+efficiencies+of+the+two+Leishmania+infantum+HSP70+mRNAs%2C+differing+in+their+3+%27-untranslated+regions%2C+are+affected+by+shifts+in+the+temperature+of+growth+through+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).</li>
<li>Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+class+of+developmentally+regulated+noncoding+RNAs+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania.</a> Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+SecA+association+with+signal+sequences+in+ribosome-bound+nascent+chains%3A+a+potential+role+for+SecA+in+ribosome+targeting+to+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Fractionation+to+Analyze+mRNA+Distribution+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles.</a> Bio Protocols. 7 (3), (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+CFTR+transmembrane+span+integration+by+disease-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+Controls+Mitochondrial+Dynamics+and+Cell+Survival+via+MTFP1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1.</a> Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Polysome ayırma Sükroz degrade tarafından RNA ile kombine ve kesirler protein analizi bireysel mRNA'ların veya tüm translatome translasyonel durumunu yanı sıra translasyonel düzenleyen protein etkenler rolleri analiz etmek için güçlü bir yöntemdir makine normal fizyolojik veya hastalık durumu sırasında. Polysomal profil oluşturma nerede transkripsiyon kontrolü büyük ölçüde yoktur ve gen ifade düzenlemesi çoğunlukla oluşur LEISHMANIA de dahil olmak üzere trypanosomatids gibi organizmalar translasyonel yönetmelikt...

Hücrelerde gen ifadesinin düzenlenmesi transkripsiyon, posttranscriptional ve ardından mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Derin RNA sıralama gelişmeler genom geniş ölçekli bir benzeri görülmemiş düzeyde kararlı durum mRNA düzeylerinin çalışma izin. Ancak son bulgular kararlı durum mRNA düzeyi her zaman protein üretim1,2ile ilişkilendirmek değil ortaya. Bireysel bir transkript kaderi çok karmaşıktır ve iç/dış uyaranlara, stres, vbgibi birçok faktöre bağlıdır. Protein sentezi sırasında gen ifade Yönetmeliği ifade kontrol değişen koşullarına hızlı bir yanıt için gerekli bir başka bir katmanı sağlar. Polysome (ya da "polyribosome") profil oluşturma, ayrılık ve görselleştirme aktif ribozomlar, çeviri tür protein sentezi ile çalışmak için güçlü bir yöntemdir. Rağmen ilk deneysel uygulamaları 1960'larda3' te çıktı, polysome profil oluşturma şu anda en önemli teknikler protein çeviri çalışmaları4biridir. Tek mRNA'ların bir polysome oluşumu için önde gelen birden fazla ribozom tarafından tercüme edilebilir. Transkript ribozomlara sikloheksimit5 üzerinde durdu ve mRNA'ların polizomlar farklı numaralar içeren polysome ayırma sürecinde Sükroz degrade ultrasantrifüj6,7 tarafından ayrılabilir , 8 , 9. polysomal kesirler RNA analiz sonra genom geniş ölçekte ve farklı fizyolojik şartlarda4,7, sırasında değişiklik translasyonel bireysel mRNA'ların durumlarında ölçüm sağlar 10. yöntem da kullanılmıştır 5' UTR ve 3' UTR serilerinde mRNA translatability11kontrolünü rollerini ortaya çıkarmak, miRNAs translasyonel baskı12rolünü incelemek, ribozom biyongenezi13 kusurları ortaya çıkarmak için ve ribozom ilişkili proteinler ile insan hastalıkları14,15rolünü anlamak. Son on yılda, büyüyen bir rol için çeviri sırasında gen ifade Yönetmeliği insan hastalıkları önemini gösteren ortaya çıkmıştır. Kanser, metabolik translasyonel denetiminde ve nörodejeneratif hastalıklar için kanıt ezici15,16,17,18' dir. Örneğin, bozukluk eIF4E bağımlı translasyonel denetiminin katkıda otizm ile ilgili açıkları15 ve FMRP, ribozom mRNA'ların otizm14' e bağlı üzerinde durdurduklarını ilgilenmektedir. Böylece, polysomal profil oluşturma birden çok insan hastalıkları translasyonel yönetmelikte hataları incelemek için çok önemli bir araçtır.
Protein analizi farklı fizyolojik koşullar altında polysomal kesirler çeviri sırasında ribozomlar ile ilişkili faktörler fonksiyonunun olduğu inceliyor. Maya, memeli hücreleri, bitkiler ve tek hücreli10,19,20,21de dahil olmak üzere birçok canlı türünün polysome profil çıkarma tekniği kullanılmıştır. Protozoon parazitler Trypanosoma ve LEISHMANIA gibi gen ekspresyonu sınırlı transkripsiyon kontrolü sergi. Onların genleri organizatörü düzenlenir transkripsiyon22eksikliği polycistronic gen kümeler halinde düzenlenir. Bunun yerine, gelişimsel gen ekspresyonu ağırlıklı olarak protein çeviri ve mRNA istikrar trypanosomatid türler23,24düzeyinde kontrol edilir. Bu nedenle, transkripsiyon yönetmelik yokluğunda translasyonel kontrol anlayışı bu organizmalar için özellikle önemlidir. Polysomal profil oluşturma posttranscriptional düzenleme LEISHMANIA25,26,27,28gen ifadesinde, eğitim için güçlü bir araçtır.
Bireysel mRNA'ların düzeyleri gerçek tarafından algılanması son sürüyor kantitatif PCR (RT-qPCR) ve yeni nesil sıralama yanı sıra proteomik teknolojileri tarafından tam transcriptome zaman, çözünürlük ve polysomal yeni bir seviyeye profil oluşturma avantajlarını getiriyor. Bu yöntemlerin kullanımı daha da derin RNA sıralama hücreleri bir genom geniş ölçekte translasyonel durumunu izlemek için proteomik analizi ile birlikte bireysel polysomal kesirler analizi ile genişletilebilir. Bu çeviri farklı fizyolojik ve patolojik şartlar altında düzenleyen yeni moleküler oyuncular tanımlamasını sağlar. Burada, üç farklı modellerde kullanılan iletişim kuralı profil oluşturma bir evrensel polysome mevcut: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları. Biz mevcut tavsiye farklı organizmalar, degrade koşullardan optimizasyonu, seçim RNase inhibitörleri ve RT-qPCR, Western blot ve RNA Elektroforez polysome kesirler bu çalışmada analiz etmek için uygulama üzerinden cep lysates hazırlanması.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Aletler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gradyan ustası</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Pistonlu Gradyan Fraksiyonlayıcı</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Kesir koleksiyoncusu</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Bir</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop Bir</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Termal</td><td>Döngüleyici Life Technologies tarafından Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM kuluçka makinesi</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabini, sınıf II, tip A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco dondurucu</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Döner kova rotoru</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Sabit açılı rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR makinesi 285880228</td><td>Yaşam teknolojilerine göre Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Yazılım&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax yazılımı&nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Malzemeler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sayma slaytları, hücre sayacı için çift bölmeli</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Üstü açık policlear santrifüj tüpleri, (14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 5 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td>309646</tr><tr><td>BD Şırınga 3 mL23 Ölçer 1 İnç İğne</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Yüzey plakası, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Yüzey plakası, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene hızlı akışlı 90 mm filtre ünitesi, 500 mL, 0,2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3 şişeleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasallar: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Yaşam Teknolojileri</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma baz</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozu (DMEM)</td> <td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (P / S)</td> <td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin ( DPBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2x6H2O)</td> <td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td> <td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td> <td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Rnasin Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyokreitol (DTT)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum dehidrat (EDTA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Kapasite cDNA Ters Transkriptaz Kiti</td> Yaşam Teknolojileri <td>4368814</td><td></td>Power <td>ile Uygulamalı Biyosistemler</td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Yaşam teknolojileri ile Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RPL11 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Ribozomal protein S6 (C-8) antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Lityum klorid</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Jel Yükleme Tamponu II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Triklorasetik asit (TCA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS kemilüminesan substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td> <td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5 asal, -trifosfat disodyum tuzu hidrat (ATP)</td> <td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat (CTP)</td> <td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Üridin 5'-trifosfat trisodyum tuzu hidrat (UTP)</td> <td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidrat (GTP)</td> <td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfataz</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome leishmania, insan hücreleri ve fare testis profil oluşturma

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Uygun protein ifade doğru zamanda ve doğru miktarda normal hücre işlevi ve hızla değişen bir ortamda hayatta kalma temeli budur. Uzun süre, gen ifade çalışmalar araştırma transkripsiyon düzeyde hakim. Ancak, mRNA'ların kararlı durum düzeyleri de protein üretimi ile ilişkilendirmek değil ve mRNA'ların translatability büyük ölçüde koşullarına göre değişiklik gösterebilir. LEISHMANIA, parazit gibi bazı organizmalarda protein ifade çoğunlukla translasyonel düzeyinde düzenlenmiştir. Son çalışmalar bu protein çeviri bozukluk kanser, metabolik, nörodejeneratif ve diğer insan hastalıkları ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polysome profil oluşturma protein çeviri düzenleme eğitim için güçlü bir yöntemdir. Bu çeviri bir genom geniş ölçekte incelemek veya bireysel mRNA'ların translasyonel durumunu ölçmek için sağlar. Bu teknik polizomlar, ribozom, onların alt birimleri ve ücretsiz mRNA'ların sırasında Santrifüjü bir sitoplazmik, sukroz degrade lysate ayrılması temelidir. Burada, üç farklı modellerde - kullanılan bir evrensel polysome profil oluşturma iletişim kuralı parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları mevcut. LEISHMANIA hücrelerin serbestçe süspansiyon büyümesine ve fare testis bir hayvan doku örneği temsil ederken kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer içinde büyür. Böylece, bu kaynakların tümüne adapte bir tekniktir. Protokolü polysomal kesirler analizi için algılama düzeylerinin bireysel mRNA tarafından RT-qPCR, proteinler tarafından Western blot ve Elektroforez tarafından ribozomal RNA'ların analizini içerir. Yöntemi daha da derin RNA-seq tarafından transcriptome düzeyde bir ribozom mRNA'ların ilişkilendirmesiyle incelenmesi ve analiz ribozom ilişkili proteinlerin tarafından kesirler kütle spektroskopisi tarafından uzatılabilir. Yöntem diğer biyolojik modelleri kolaylıkla ayarlanabilir.

Bu çalışmada, biz üç farklı kaynaklardan polysomal profil çıkarma tekniği uygulamaya tarif: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve fare testis. Süspansiyon içinde sıvı ortamda serbestçe LEISHMANIA hücrelerin büyümesine, kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer Tabaklarda büyümek ve fare testis doku örneği temsil eder. Yöntem, süspansiyon, farklı dokuların veya başka bir organizmadan ve kültürlü hücrelerinin farklı türleri serbestçe yetişkin hücrelerinde ...

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Bu tekniğin genel amacı, translasyon sırasında inferdual mRNA'ların polizomlarla etkileşimini incelemektir. Polizom profillemesi, ribozomlar ve polizomlarla mRNA etkileşimini incelemek için güçlü bir teknolojidir. Teknik, protein sentezi regülasyonu, translasyon aktivasyonu ve baskılama çalışmaları için önemlidir.Burada ekibimiz, polisomal fraksiyonasyon tekniklerini ve üç organizma örneğinde fraksiyonların analizini sunmaktadır. Parazit Leishmania majör, kültürlenmiş insan hücreleri ve bir hayvan dokusu. Bu yaklaşım, lizat hazırlama, sükroz gradyan hazırlama ve ultrasantrifüjleme, polizom fraksiyonlama ve numune toplama olmak üzere dört ana adımdan oluşur.Fraksiyonların analizi. Farklı kaynaklardan gelen hücreler, bir iğne veya Dounce homojenizatörden geçirilerek lizis tamponunda toplanır, yıkanır ve parçalanır. Santrifüjleme, lizatı berraklaştıran hücre kalıntılarını gidermek için kullanılır.Bir gradyan yapıcıda %10 ve %50 sükroz çözeltilerinin karıştırılmasıyla sürekli bir sükroz gradyanı oluşturulur. Lysate, gradyanın üstüne yüklenir. Ultrasantrifüjleme, farklı sayıda ribozomla ilişkili mrNA'ları ayırır.Fraksiyonlama sırasında bir UV Dedektörü tarafından izlenir ve farklı emici spektrumlar oluşturur. Lizat hazırlığı. Kaynağa bağlı olarak lizatın hazırlanmasında bazı farklılıklar vardır.Lizat hazırlandıktan sonra, numune orijininden bağımsız olarak prosedürler aynıdır. Leishmania majör Sitoplazmik Lizat hazırlığı. Leishmania ana hücrelerini, mililitre başına 100.000 hücre yoğunluğunda 30 mililitre ortama yerleştirin.Bu adım bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Leishmania kültürü içeren şişeyi inkübatöre yerleştirin ve logaritmik faza kadar hücreleri 27 santigrat derecede büyütün. Büyümesi genellikle yaklaşık iki gün sürer.Leishmania majör hücreleri mikroskop altında kolayca görülebilir. Translasyonlanmış mRNA'lardaki ribozomları durdurmak için yetiştirilen Leishmania kültürüne mililitre başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar Sikloheksimid ekleyin. Hücreleri 27 santigrat derecede on dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Sikloheksimid tedavisi tamamlandıktan sonra, hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 8 dakika boyunca 1.800 g döndürün. Süpernatanı atın. Hücreleri 30 mililitre pbs ve santrifüj ile yıkayın.Süpernatanı atın ve hücreleri bir mililitre pbs içinde yeniden askıya alın. Bir dizi hücre alın ve formaldehit çözeltisi ile karıştırın. Sonra hücreleri hemositometre ile sayın.İstenilen sayıda hücreyi mikrofüj tüpüne aktarın. Hücreleri dört santigrat derecede 8 dakika boyunca 1.800 g'da döndürün. Sonra süpernatanı atın.Hücre peletini proteaz inhibitörleri ve RNAsin içeren bir mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri 23 gauge iğneden üç kez geçirin. İğneden geçtikten sonra lizat şeffaf hale gelir.Lizatı berraklaştırmak için dört santigrat derecede on dakika boyunca 11, 200 g'da santrifüjleyin. Arıtılmış lizatı yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın ve sakaroz gradyan ultrasantrifüjlenmesine kadar buz üzerinde tutun. Kültürlenmiş insan hücrelerinden sitoplazmik lizat preparasyonu.HeLa hücrelerini inkübatörde 37 santigrat derecede büyük bir plakada,% 5 CO2 ile büyütün. Translasyonlu mRNA'lardaki ribozomları tutuklamak için büyüyen HeLa hücrelerine mililitre başına 100 mikrogramlık nihai konsantrasyona kadar sikloheksimid ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede on dakika inkübe edin.Ortamı aspire edin ve plakayı soğuk pbs ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Plakaya 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve hücreleri kazıyın. Parçalanmış hücreleri mikrofüj tüpüne aktarın.Hücreleri 23 gauge iğneden üç kez geçirin. Lizatı berraklaştırmak için sekiz dakika boyunca 11.200 g'da döndürün. Santrifüjlemeden sonra tüpleri buz üzerinde hareket ettirin ve süpernatanı yeni tüpe aktarın.Bir alikot alın, seyreltin ve bir nano damla kullanarak 260 nanometrede absorbansı ölçün. Birden fazla numune varsa, lizatları aynı optik yoğunluğa ayarlayın ve numuneleri sakaroz gradyan ultrasantrifüjlenmesine kadar buz üzerinde tutun. Fare testisinden sitoplazmik lizat preparasyonu.Fare testisini inceleyin. Tunika albugenia'da küçük bir kesi yapın ve testisin seminiforöz tübüllerini toplayın ve bunları beş mililitre pbs içeren konik tüpe aktarın. Dokuyu kuvvetlice karıştırın.Ve dokunun beş dakika boyunca buza yerleşmesine izin verin. Tamponu çıkarın ve iki kez daha pbs ile yıkayın. Seminifer tübülleri iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir dakika boyunca 500 g'da döndürün.Süpernatanı çıkarın. Tübüllere 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve dokuyu bozmak için bir pipet kullanın. Süspansiyonu küçük hacimli bir dounce homojenizatöre aktarın.Cam havaneli yedi ila sekiz vuruşla dokuyu bozun. Lizatı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Lizatı temizlemek için numuneyi 12.000 g'da dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüjleyin.Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. Ardından, sükroz gradyan hazırlığına devam edin. Sükroz gradyan hazırlama.Mikrobloğa bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve çizgiyi bloğun üst seviyesi boyunca çizin. Ardından tüpü sabit bir rafa aktarın. Katmanlama cihazı takılıyken on mililitrelik bir şırınga alın ve şırıngayı% 10 sükroz çözeltisi ile doldurun.Sükroz çözeltisi işarete ulaşana kadar ultrasantrifüj tüpünün dibinde yavaşça bırakın. Başka bir şırıngayı% 50 sükroz çözeltisi ile doldurun ve% 10 sükroz tabakasından tüpün dibine dikkatlice katmanlama cihazını yerleştirin. Sükroz çözeltisini alttan başlayarak tüp üzerindeki işarete ulaşana kadar yavaşça serbest bırakın.Ardından tüpü sağlanan kapakla kapatın. Sükroz gradyanı hazırlamak için gradyan yapıcı cihazı açın. Ardından yukarı veya aşağı düğmelerini kullanarak plakayı düzleştirin ve bitti düğmesine basın.Plakayı tesviye ettikten sonra grad tuşuna basın. Degrade menü listesine gidin ve SW41 rotorunu seçin. Ardından istediğiniz sükroz gradyanını seçin.Kullan'a basın. Mıknatıs tabanlı tüp tutucuyu degrade yapıcıya yerleştirin. Ardından tüpü tutucuya aktarın.Aynı anda en fazla altı gradyan hazırlanabilir. Çalıştır'a basın. Degrade yapıcı, tüpleri program hızında ve açılarında döndürerek doğrusal bir gradyan oluşturur.Degradeyi hazırlamak sadece birkaç dakika sürecektir. İşlem tamamlandığında, tüpü bir rafa yerleştirin. Sükroz gradyanlı ultrasantrifüj tüplerinin üstünden numune hacmine eşit olan hacmi çıkarın.Üstüne dikkatlice 500 mikrolitre lizat yükleyin. Boruları rotor kovalarına yerleştirin ve dengeleyin. Dört santigrat derecede iki saat boyunca 260.000 g'da santrifüjleyin.Polizom fraksiyonlama ve numune toplama. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpleri buz üzerindeki rotor kovalarına yerleştirin. Kesir toplayıcıyı ve kesirleyiciyi açın.Fraksiyonatör menüsünde tara'ya tıklayın. Fraksiyon toplayıcıya toplama tüpleri olan bir raf koyun. Fraksiyonlayıcının yan tarafındaki durulama haznesini deiyonize su ile doldurun.Pompayı durulamak için durulama tuşuna on saniye basın. Kalibrasyon için pistona suyla dolu şırınga ile bir durulama adaptörü takın. Bilgisayardaki fraksiyonatör yazılımını açın.Kalibre et'e basın. Varsayılan ayarı kullanın ve şırıngadan su enjekte etmeye hazır Ok.Be basın. Kalibrasyonu yapmak için Tamam'a basın.Önümüzdeki beş saniye boyunca hemen su enjekte etmeye başlayın. Sıfır kalibrasyon tamamlandı işareti görünecektir. Şırınga ile bir durulama adaptörünü çıkarın ve fraksiyonatörün pistonuna bir uç takın.Pirinç hava valfini açın ve hava tüpünü ve akış hücresini kurutmak için hava tuşuna on saniye basın. Hava valfini kapatın. Gradyan tüpünü rotor kovasından alın ve rafa yerleştirin.Tüp tutucu kapağını tüpün üstüne uygulayın ve tüpü dikkatlice tüp tutucuya taşıyın ve kilitleyin. Tutucuyu pistonun altına yerleştirin. Sıklıkla, polizomal bantlar gözle görülebilir.Kesir sayıları ve hacim için istenen ayarları tanıtın. Dosyayı adlandırın ve Tamam'a basın, ardından grafik düğmesine gidin. Bir sonraki pencerede taramayı başlat'a basın.Ayarlar görünecek ve Tamam'a basın.Kollektör oluktan ilk fraksiyona hareket edecek ve piston borunun içine hareket edecektir. Piston eğimin tepesine ulaştığında, seçtiğiniz hıza yavaşlayacak ve kesirler toplanacaktır. Genellikle, her biri 500 mikrolitrede 24 fraksiyon toplarız.Tamamlandığında, piston gradyan borusundan dışarı çıkacaktır. Pirinç hava valfini açın. Son fraksiyonu almak için fraksiyonatör üzerindeki hava tuşuna basın.Koşunun sonunda gradyanın absorbans profilini göreceksiniz. Fraksiyonların analizi. Elde edilen fraksiyonlar RNA ve Protein analizi için kullanılabilir.RNA, elektroforez ve ardından Northern Blot ile analiz edilebilir veya cDNA üretimi için kullanılabilir, ardından tek tek mRNA'ların polizomlarla ilişkisini analiz etmek için RT-qPCR reaksiyonu ile analiz edilebilir. Yeni nesil dizileme, mRNA'ların translasyon durumunu transkriptom ölçeğinde analiz etmek için kullanılabilir. Polizomal fraksiyonların protein analizi için, proteinler konsantre etmek için triklüricedik asit ile çökeltilir.Daha sonra proteinler Western Blotting veya proteom seviyesinde Mass Spec ile analiz edilir. Sonuç -ları. Burada, üç organizmanın örnekleri üzerinde polizom fraksiyonlama ve analiz sonuçlarını sunuyoruz. Leishmania, kültürlenmiş insan hücreleri ve fare dokusu.Sherp ve Tubulin mRNA'sının translasyon sırasında ribozomlarla ilişkisini ve Leishmania majörünü incelemek için polizom fraksiyonasyonu kullanıldı. Fraksiyonlama için absorbans grafiği, ribozom alt birimleri 40S ve 60S, monozomlar 80S ve polizomlar için tipik zirvelere sahip farklı bir şekle sahiptir. Fraksiyonların alikotları üç gruba ayrıldı.Ön polizomlar, hafif polizomlar ve ağır polizomlar. mRNA bağıl seviyeleri gerçek zamanlı kantitatif PCR ile incelendi. Veriler, Tubulin mRNA'nın aktif olarak çevrildiğini göstermektedir.Çoğunlukla ağır ve hafif polizomlarla ilişkili olduğu için. Sherp mRNA'nın translasyonu daha az aktif iken. Çoğunlukla pre-polizomlar ve hafif polizomlarla ilişkili olarak bulundu.Bu nedenle, bu deney, tekniğin translasyonda bireysel bir mRNA katılımını inceleme yeteneğini açıkça göstermektedir. Bu şekil, HeLa hücrelerinin polizom fraksiyonasyonunun tipik bir absorbans grafiğini sunar. Proteinler, %10 trikloroasetik asit ile çökeltilerek konsantre edildi.Küçük alt birim ribozomal protein RPS6 ve büyük alt birim ribozomal protein RPL11 Western Blot ile tespit edildi. Dağılımları, absorbans spektrumundaki farklı zirvelerle iyi bir şekilde korelasyon gösterdi. Bu şekilde, fare testisini oluşturan fraksiyone polizomlarda ribozomal RNA'ların elektroforez yoluyla saptanmasına bir örnek sunuyoruz. Sonuç.Polizomal profilleme, tek tek mRNA'ların translasyonel durumunu analiz etmek, ribozomla ilişkili proteinleri incelemek ve farklı koşullar altında farklı model organizmalarda translasyonel regülasyonu incelemek için kullanılabilen çok yönlü bir tekniktir.

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm...

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.

In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi

Öğrenin polisom profilleme tekniğini Leishmania major, insan hücreleri ve fare testisinde protein sentezi düzenlemesini incelemek için. Bu yöntem translasyon aktivasyonu ve baskılanması mekanizmalarını ortaya koyar.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Daha fazla video keşfet