Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Bu tekniğin genel amacı, translasyon sırasında inferdual mRNA'ların polizomlarla etkileşimini incelemektir. Polizom profillemesi, ribozomlar ve polizomlarla mRNA etkileşimini incelemek için güçlü bir teknolojidir. Teknik, protein sentezi regülasyonu, translasyon aktivasyonu ve baskılama çalışmaları için önemlidir.

Burada ekibimiz, polisomal fraksiyonasyon tekniklerini ve üç organizma örneğinde fraksiyonların analizini sunmaktadır. Parazit Leishmania majör, kültürlenmiş insan hücreleri ve bir hayvan dokusu. Bu yaklaşım, lizat hazırlama, sükroz gradyan hazırlama ve ultrasantrifüjleme, polizom fraksiyonlama ve numune toplama olmak üzere dört ana adımdan oluşur.

Fraksiyonların analizi. Farklı kaynaklardan gelen hücreler, bir iğne veya Dounce homojenizatörden geçirilerek lizis tamponunda toplanır, yıkanır ve parçalanır. Santrifüjleme, lizatı berraklaştıran hücre kalıntılarını gidermek için kullanılır.

Bir gradyan yapıcıda %10 ve %50 sükroz çözeltilerinin karıştırılmasıyla sürekli bir sükroz gradyanı oluşturulur. Lysate, gradyanın üstüne yüklenir. Ultrasantrifüjleme, farklı sayıda ribozomla ilişkili mrNA'ları ayırır.

Fraksiyonlama sırasında bir UV Dedektörü tarafından izlenir ve farklı emici spektrumlar oluşturur. Lizat hazırlığı. Kaynağa bağlı olarak lizatın hazırlanmasında bazı farklılıklar vardır.

Lizat hazırlandıktan sonra, numune orijininden bağımsız olarak prosedürler aynıdır. Leishmania majör Sitoplazmik Lizat hazırlığı. Leishmania ana hücrelerini, mililitre başına 100.000 hücre yoğunluğunda 30 mililitre ortama yerleştirin.

Bu adım bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Leishmania kültürü içeren şişeyi inkübatöre yerleştirin ve logaritmik faza kadar hücreleri 27 santigrat derecede büyütün. Büyümesi genellikle yaklaşık iki gün sürer.

Leishmania majör hücreleri mikroskop altında kolayca görülebilir. Translasyonlanmış mRNA'lardaki ribozomları durdurmak için yetiştirilen Leishmania kültürüne mililitre başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar Sikloheksimid ekleyin. Hücreleri 27 santigrat derecede on dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Sikloheksimid tedavisi tamamlandıktan sonra, hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 8 dakika boyunca 1.800 g döndürün. Süpernatanı atın. Hücreleri 30 mililitre pbs ve santrifüj ile yıkayın.

Süpernatanı atın ve hücreleri bir mililitre pbs içinde yeniden askıya alın. Bir dizi hücre alın ve formaldehit çözeltisi ile karıştırın. Sonra hücreleri hemositometre ile sayın.

İstenilen sayıda hücreyi mikrofüj tüpüne aktarın. Hücreleri dört santigrat derecede 8 dakika boyunca 1.800 g'da döndürün. Sonra süpernatanı atın.

Hücre peletini proteaz inhibitörleri ve RNAsin içeren bir mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri 23 gauge iğneden üç kez geçirin. İğneden geçtikten sonra lizat şeffaf hale gelir.

Lizatı berraklaştırmak için dört santigrat derecede on dakika boyunca 11, 200 g'da santrifüjleyin. Arıtılmış lizatı yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın ve sakaroz gradyan ultrasantrifüjlenmesine kadar buz üzerinde tutun. Kültürlenmiş insan hücrelerinden sitoplazmik lizat preparasyonu.

HeLa hücrelerini inkübatörde 37 santigrat derecede büyük bir plakada,% 5 CO2 ile büyütün. Translasyonlu mRNA'lardaki ribozomları tutuklamak için büyüyen HeLa hücrelerine mililitre başına 100 mikrogramlık nihai konsantrasyona kadar sikloheksimid ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede on dakika inkübe edin.

Ortamı aspire edin ve plakayı soğuk pbs ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Plakaya 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve hücreleri kazıyın. Parçalanmış hücreleri mikrofüj tüpüne aktarın.

Hücreleri 23 gauge iğneden üç kez geçirin. Lizatı berraklaştırmak için sekiz dakika boyunca 11.200 g'da döndürün. Santrifüjlemeden sonra tüpleri buz üzerinde hareket ettirin ve süpernatanı yeni tüpe aktarın.

Bir alikot alın, seyreltin ve bir nano damla kullanarak 260 nanometrede absorbansı ölçün. Birden fazla numune varsa, lizatları aynı optik yoğunluğa ayarlayın ve numuneleri sakaroz gradyan ultrasantrifüjlenmesine kadar buz üzerinde tutun. Fare testisinden sitoplazmik lizat preparasyonu.

Fare testisini inceleyin. Tunika albugenia'da küçük bir kesi yapın ve testisin seminiforöz tübüllerini toplayın ve bunları beş mililitre pbs içeren konik tüpe aktarın. Dokuyu kuvvetlice karıştırın.

Ve dokunun beş dakika boyunca buza yerleşmesine izin verin. Tamponu çıkarın ve iki kez daha pbs ile yıkayın. Seminifer tübülleri iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir dakika boyunca 500 g'da döndürün.

Süpernatanı çıkarın. Tübüllere 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve dokuyu bozmak için bir pipet kullanın. Süspansiyonu küçük hacimli bir dounce homojenizatöre aktarın.

Cam havaneli yedi ila sekiz vuruşla dokuyu bozun. Lizatı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Lizatı temizlemek için numuneyi 12.000 g'da dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. Ardından, sükroz gradyan hazırlığına devam edin. Sükroz gradyan hazırlama.

Mikrobloğa bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve çizgiyi bloğun üst seviyesi boyunca çizin. Ardından tüpü sabit bir rafa aktarın. Katmanlama cihazı takılıyken on mililitrelik bir şırınga alın ve şırıngayı% 10 sükroz çözeltisi ile doldurun.

Sükroz çözeltisi işarete ulaşana kadar ultrasantrifüj tüpünün dibinde yavaşça bırakın. Başka bir şırıngayı% 50 sükroz çözeltisi ile doldurun ve% 10 sükroz tabakasından tüpün dibine dikkatlice katmanlama cihazını yerleştirin. Sükroz çözeltisini alttan başlayarak tüp üzerindeki işarete ulaşana kadar yavaşça serbest bırakın.

Ardından tüpü sağlanan kapakla kapatın. Sükroz gradyanı hazırlamak için gradyan yapıcı cihazı açın. Ardından yukarı veya aşağı düğmelerini kullanarak plakayı düzleştirin ve bitti düğmesine basın.

Plakayı tesviye ettikten sonra grad tuşuna basın. Degrade menü listesine gidin ve SW41 rotorunu seçin. Ardından istediğiniz sükroz gradyanını seçin.

Kullan'a basın. Mıknatıs tabanlı tüp tutucuyu degrade yapıcıya yerleştirin. Ardından tüpü tutucuya aktarın.

Aynı anda en fazla altı gradyan hazırlanabilir. Çalıştır'a basın. Degrade yapıcı, tüpleri program hızında ve açılarında döndürerek doğrusal bir gradyan oluşturur.

Degradeyi hazırlamak sadece birkaç dakika sürecektir. İşlem tamamlandığında, tüpü bir rafa yerleştirin. Sükroz gradyanlı ultrasantrifüj tüplerinin üstünden numune hacmine eşit olan hacmi çıkarın.

Üstüne dikkatlice 500 mikrolitre lizat yükleyin. Boruları rotor kovalarına yerleştirin ve dengeleyin. Dört santigrat derecede iki saat boyunca 260.000 g'da santrifüjleyin.

Polizom fraksiyonlama ve numune toplama. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpleri buz üzerindeki rotor kovalarına yerleştirin. Kesir toplayıcıyı ve kesirleyiciyi açın.

Fraksiyonatör menüsünde tara'ya tıklayın. Fraksiyon toplayıcıya toplama tüpleri olan bir raf koyun. Fraksiyonlayıcının yan tarafındaki durulama haznesini deiyonize su ile doldurun.

Pompayı durulamak için durulama tuşuna on saniye basın. Kalibrasyon için pistona suyla dolu şırınga ile bir durulama adaptörü takın. Bilgisayardaki fraksiyonatör yazılımını açın.

Kalibre et'e basın. Varsayılan ayarı kullanın ve şırıngadan su enjekte etmeye hazır Ok.Be basın. Kalibrasyonu yapmak için Tamam'a basın.

Önümüzdeki beş saniye boyunca hemen su enjekte etmeye başlayın. Sıfır kalibrasyon tamamlandı işareti görünecektir. Şırınga ile bir durulama adaptörünü çıkarın ve fraksiyonatörün pistonuna bir uç takın.

Pirinç hava valfini açın ve hava tüpünü ve akış hücresini kurutmak için hava tuşuna on saniye basın. Hava valfini kapatın. Gradyan tüpünü rotor kovasından alın ve rafa yerleştirin.

Tüp tutucu kapağını tüpün üstüne uygulayın ve tüpü dikkatlice tüp tutucuya taşıyın ve kilitleyin. Tutucuyu pistonun altına yerleştirin. Sıklıkla, polizomal bantlar gözle görülebilir.

Kesir sayıları ve hacim için istenen ayarları tanıtın. Dosyayı adlandırın ve Tamam'a basın, ardından grafik düğmesine gidin. Bir sonraki pencerede taramayı başlat'a basın.

Ayarlar görünecek ve Tamam'a basın.Kollektör oluktan ilk fraksiyona hareket edecek ve piston borunun içine hareket edecektir. Piston eğimin tepesine ulaştığında, seçtiğiniz hıza yavaşlayacak ve kesirler toplanacaktır. Genellikle, her biri 500 mikrolitrede 24 fraksiyon toplarız.

Tamamlandığında, piston gradyan borusundan dışarı çıkacaktır. Pirinç hava valfini açın. Son fraksiyonu almak için fraksiyonatör üzerindeki hava tuşuna basın.

Koşunun sonunda gradyanın absorbans profilini göreceksiniz. Fraksiyonların analizi. Elde edilen fraksiyonlar RNA ve Protein analizi için kullanılabilir.

RNA, elektroforez ve ardından Northern Blot ile analiz edilebilir veya cDNA üretimi için kullanılabilir, ardından tek tek mRNA'ların polizomlarla ilişkisini analiz etmek için RT-qPCR reaksiyonu ile analiz edilebilir. Yeni nesil dizileme, mRNA'ların translasyon durumunu transkriptom ölçeğinde analiz etmek için kullanılabilir. Polizomal fraksiyonların protein analizi için, proteinler konsantre etmek için triklüricedik asit ile çökeltilir.

Daha sonra proteinler Western Blotting veya proteom seviyesinde Mass Spec ile analiz edilir. Sonuç -ları. Burada, üç organizmanın örnekleri üzerinde polizom fraksiyonlama ve analiz sonuçlarını sunuyoruz. Leishmania, kültürlenmiş insan hücreleri ve fare dokusu.

Sherp ve Tubulin mRNA'sının translasyon sırasında ribozomlarla ilişkisini ve Leishmania majörünü incelemek için polizom fraksiyonasyonu kullanıldı. Fraksiyonlama için absorbans grafiği, ribozom alt birimleri 40S ve 60S, monozomlar 80S ve polizomlar için tipik zirvelere sahip farklı bir şekle sahiptir. Fraksiyonların alikotları üç gruba ayrıldı.

Ön polizomlar, hafif polizomlar ve ağır polizomlar. mRNA bağıl seviyeleri gerçek zamanlı kantitatif PCR ile incelendi. Veriler, Tubulin mRNA'nın aktif olarak çevrildiğini göstermektedir.

Çoğunlukla ağır ve hafif polizomlarla ilişkili olduğu için. Sherp mRNA'nın translasyonu daha az aktif iken. Çoğunlukla pre-polizomlar ve hafif polizomlarla ilişkili olarak bulundu.

Bu nedenle, bu deney, tekniğin translasyonda bireysel bir mRNA katılımını inceleme yeteneğini açıkça göstermektedir. Bu şekil, HeLa hücrelerinin polizom fraksiyonasyonunun tipik bir absorbans grafiğini sunar. Proteinler, %10 trikloroasetik asit ile çökeltilerek konsantre edildi.

Küçük alt birim ribozomal protein RPS6 ve büyük alt birim ribozomal protein RPL11 Western Blot ile tespit edildi. Dağılımları, absorbans spektrumundaki farklı zirvelerle iyi bir şekilde korelasyon gösterdi. Bu şekilde, fare testisini oluşturan fraksiyone polizomlarda ribozomal RNA'ların elektroforez yoluyla saptanmasına bir örnek sunuyoruz. Sonuç.

Polizomal profilleme, tek tek mRNA'ların translasyonel durumunu analiz etmek, ribozomla ilişkili proteinleri incelemek ve farklı koşullar altında farklı model organizmalarda translasyonel regülasyonu incelemek için kullanılabilen çok yönlü bir tekniktir.