Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen
21 Haziran 2018
Genetik varyantların karmaşık insan hastalığa katkıda kimliği roman mekanizmalar belirlemek için bize izin verir. Burada, biz aday genler veya kapsamı düşük maliyetle en üst düzeye çıkarır ve kohort-esaslı çalışmalar için mükellef gen yolu çözümlemesi için bir multiplex Genotipleme yaklaşım göstermektedir.
Bu yöntem, insan papilloma virüsü de dahil olmak üzere hastalık sonuçlarıyla ilişkili genetik belirteçlerin tespit edilmesi gibi klinik teşhis ve genetik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uygun maliyetli, hedefli ve zaman açısından verimli bir tanı yöntemi olmasıdır. Bu prosedüre başlamak için, sipariş edilen liyofilize primerleri moleküler dereceli su ile sulandırın.
Her çoğullanmış tahlil için ileri ve geri primerleri, her bir primeri sıfır nokta beş milimolar konsantrasyonda içerecek şekilde bir stok primer karışımına çekin. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi PCR için bir ana karışım hazırlayın. 384 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna bu karışımdan dört mikrolitre ekleyin ve mikrolitre başına beş ila 10 nanogram arasında bir konsantrasyonda bir mikrolitre genomik DNA ekleyin.
Plakayı bir plaka kapağı ile örtün ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca 200 kez G santrifüjleyin. Ardından PCR'yi metin protokolünde belirtildiği gibi çalıştırın. %2'lik bir agaroz jel üzerine üç mikrolitre yükleme tamponu ile bir mikrolitre PCR ürünü yükleyin.
DNA amplifikasyonunun başarılı olduğundan emin olmak için 45 dakika boyunca 100 voltta çalıştırın. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi bir SAP ana karışımı hazırlayın. Daha önce çalıştırılan PCR plakasının her bir oyuğuna yeni yapılmış SAP ana karışımından iki mikrolitre ekleyin.
Bir dakika boyunca 1.000 kez G'de kısa bir süre santrifüjleyin. Ve sonra plakayı termocycler'a geri koyun. Termocycler'ı 37 santigrat derecede 40 dakika çalıştırın.
Ve sonra enzimi etkisiz hale getirmek için beş dakika boyunca 85 santigrat derecede. Her bir astar için seyreltme faktörünü hesapladıktan sonra, bir astar havuzu oluşturmak için her birinin belirlenen hacimlerini birleştirin. Bu havuzu seyreltmek için gerektiği kadar su ekleyin.
Metin protokolünde belirtildiği gibi, yüksek plex testi veya düşük plex testi için uzantı ana karışımını birleştirin. Plakanın her bir oyuğuna iki mikrolitre uzatma ana karışımı ekleyin ve her bir oyuktaki toplam hacmi dokuz mikrolitreye getirin. Bir dakika boyunca 1.000 kez G'de kısa bir süre santrifüjleyin ve ardından plakayı termocycler'a geri koyun.
Bundan sonra, her kuyucuğa 16 mikrolitre deiyonize su ekleyin ve toplam hacmi kuyu başına 25 mikrolitreye çıkarın. Altı miligram reçineyi tüm çukur reçine plakasına eşit olarak uygulayın. Reçineyi oda sıcaklığında 20 dakika kurumaya bırakın.
Ardından reçineyi reaksiyon plakasına uygulayın. Bir süspansiyon karıştırıcı kullanarak, plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca yavaş bir hızda döndürün. Daha sonra, reçinenin kütle spektrumu çipine uygulanmasını önlemek için plakayı beş dakika boyunca 3.200 kez G'de santrifüjleyin.
Plakanın numune düzenini sistemin yazılım arayüzüne yükleyin. Bir dağıtım sistemi kullanarak, genotipleme analit karışımını plakadan genotipleme çipine uygulayın. Analit karışımından kütle spektrumları oluşturmak için çipi MALDI-TOF sistemine yükleyin ve platformun yazılım arayüzünü kullanarak yorumlayın.
Bu çalışmada kütle spektrometresi kullanılarak multipleks genotipleme yapılmıştır. Temsili SNP verileri, gıda alerjisi için fenotiplenmiş bir keşif klinik kohortunda aday gen IL13 için üretilir ve analiz edilir. Bir varyant olan rs1295686, kanıtlanmış gıda alerjisi ile ilişkilidir.
Bu ilişki, bu protokolde gösterilen multipleks genotipleme yaklaşımı kullanılarak bir replikasyon kohortunda doğrulanmıştır. İki kohorttan elde edilen sonuçların bir meta-analizi, IL13 ile FA arasındaki ilişkiye dair güçlü kanıtlar sağlar. Bu prosedürü denerken, herhangi bir numuneyi veya reaktifi kontamine etmemek önemlidir. Herhangi bir pipetleme hatasını hesaba katmak için her PCR için ekstra bir %10 ana karışım hazırlamak da önemlidir.
Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonunun tanımlanan hastalıkla ilişkili genetik belirteçlerle ilişkili olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, klinik teşhis ve genetik alanlarındaki araştırmacıların hasta kohortlarındaki hastalık ilişkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Genotipleme reaktifleri ve MALDI-TOF sistemi ile çalışırken tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kompleks insan hastalıklarıyla ilişkili aday genlerin analizine yönelik bir multipleks genotipleme yaklaşımı sunmaktadır. Maliyet etkin olan bu yöntem, kohort tabanlı çalışmalara uygundur ve hastalık sonuçlarıyla ilişkili genetik belirteçlerin tespitini geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genetik
- Klinik Tanı
- Patojen Tespiti
Arka Plan
- Genetik varyantların belirlenmesi, hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına yardımcı olur.
- Maliyet etkin yöntemler, geniş ölçekli çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Multiplex genotipleme, tanısal verimliliği artırabilir.
- Human papilloma virus, genetik marker saptama için bir hedef örneğidir.
Çalışmanın Amacı
- Aday gen analizi için çoklu genotipleme yöntemi geliştirmek.
- Maliyetleri minimize ederken kapsamı maksimize etmek.
- Genetik alanındaki kohort temelli çalışmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Liyofilize primerlerin moleküler derece su ile yeniden çözündürülmesi.
- 0.5 millimolar konsantrasyonda stok primer karışımının hazırlanması.
- Belirtilen protokole göre PCR için master mix hazırlanması.
- Genomik DNA analizi için 384 kuyucuklu PCR plakası kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, genetik belirteçlerin tespitinde etkinlik göstermiştir.
- Maliyet etkinliği, pratik uygulama yoluyla doğrulanmıştır.
- Tanı sürecinde zaman verimliliği kaydedilmiştir.
- İnsan papilloma virüsü tespitinde başarılı uygulama gerçekleştirilmiştir.
Sonuçlar
- Multiplex genotipleme yaklaşımı, genetik alanında değerli bir araçtır.
- Kompleks hastalıklar üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için bir çerçeve sunmaktadır.
- İleri araştırmalar, bu yöntemin klinik tanıdaki uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kütle spektrometrisi ile yapılan multiple genotipleme, klinik kohortlardaki genetik varyantların maliyet etkin ve yüksek kapasiteli analizine olanak tanıyarak karmaşık hastalık araştırmalarında hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, IL13 gibi aday lokusları gıda alerjisi gibi fenotipik sonuçlarla istatistiksel olarak güçlü ilişkilendirme çalışmaları aracılığıyla bağlayarak öngörü güvenilirliğini artırır. Bu yöntem, genetik taramayı, erken evre Ar-Ge süreçlerinde terapötik hipotezlerin riskini azaltmak için ölçeklenebilir bir keşif aracı olarak konumlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Klinik olarak ilgili kohortlarda genetik varyantlar ile hastalık fenotipleri arasındaki ilişkileri test ederek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Analiz başına 40'a kadar SNP'nin eş zamanlı olarak sorgulanmasına olanak tanıyarak yolak düzeyindeki hedef doğrulama verimliliğini artırır.
- Öngörücü Değer: Genotip-fenotip ilişkilerinin replikasyonu ve meta-analizi yoluyla IL13'ün terapötik bir hedef olarak riskinin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Minimal SNP seçimiyle genomik kapsama alanını maksimize etmek için bağlantı dengesizliğini kullanır ve böylece analiz tasarım verimliliğini artırır.
- Operasyonel Değer: MALDI-TOF okuması, otomatik analiz hatlarına uygun, kantitatif ve yüksek çözünürlüklü genotipleme verileri sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: 384 kuyucuklu PCR formatı, kohort tabanlı tarama kampanyaları için yüksek örnek işlem hacmine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: İnsan kohortlarındaki genetik bulguları fonksiyonel doğrulama yollarıyla ilişkilendirerek biyobelirteç uyumlu hedef seçimini destekler.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Bağımsız kohortlarda yapılan replikasyonlar, keşif aşamasından preklinik yatırıma geçiş için güveni artırır.
- Mekanistik Öngörü: Genetik ilişkilerin ardındaki biyolojik mekanizmaları aydınlatmak için takip çalışmalarına (örneğin, gen ekspresyon korelasyonu) olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, genetik taramadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, sonraki aşamalardaki hedef doğrulama ve bileşik taramaları için genetik olarak tabakalandırılmış kohortlar sunar.
- Keşif Biyolojisi: Hastalıkla ilişkili yolakları netleştirmek ve hedefleri önceliklendirmek için fenotiplendirilmiş klinik kohortlarda genetik hipotezleri test eder.
- Tarama: Fonksiyonel analizler için örneklerin güvenilir şekilde tabakalanmasını sağlayan standartlaştırılmış, tekrarlanabilir genotip verileri üretir.
- Analitik: Koşullar ve kohortlar arası istatistiksel karşılaştırmayı destekleyen, kalite kontrol eşikleriyle birlikte yüksek güvenilirlikli genotip çağrıları sunar.
- Translasyonel Araştırma: Güçlü fenotipik ilişkisi olan varyantları tanımlayarak insan genetiği bulgularını preklinik doğrulama ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Multipleks analiz tasarımı farklı genlere ve hastalıklara uyarlanabilir olup, genotipleme altyapısına yönelik platform düzeyindeki yatırımları destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Klinik olarak ilgili popülasyonlarda istatistiksel olarak desteklenen genetik birliktelikler aracılığıyla hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Multiplexing yoluyla örnek başına maliyeti düşürür; entegre PCR, uzatma ve MALDI-TOF tespiti ile iş akışını optimize eder.
- Stratejik Değer: Geliştirme sürecinin erken aşamalarında hedef seçimindeki riskleri azaltan insan genetiği kanıtları sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kohort çalışmalarındaki replikasyon ve etki boyutuna dayalı olarak hedeflerin riskten arındırılmış önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Genetik analiz tasarımı, PCR optimizasyonu ve MALDI-TOF veri yorumlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Multipleks kapasiteli kütle spektrometrisi sistemlerine ve valide edilmiş genotipleme yazılımlarına erişime bağlıdır.
- Siteler veya partiler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için standartlaştırılmış numune işleme ve QC protokolleri gereklidir.
- Yeni hedeflere adaptasyon, LD tabanlı SNP seçimi ve primer multipleks uyumluluk testi gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında numune DNA kalitesine olan hassasiyet ve kontaminasyonu önlemek için dikkatli reaktif kullanımı yer alır.
