5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi etkisi Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya bir In Vitro modeli
16 Nisan 2018
Bu el yazması antimikrobiyal etkisi 5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi (ALA-PDT) Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı bakteriyel biyofilmler PDT ile tedavisinde gelecekte çalışmaya bir vitro model geliştirmek için kullanılabilir.
Bu deneyin genel amacı, beş aminolevulinik asit veya ALA aracılı fotodinamik tedavinin bir staphylococcus aureus biyofilmi üzerindeki anti-mikrobiyal etkisini değerlendirmektir. Bu yöntem, fotodinamik hücre onarımının biyofilm enfeksiyonlarını kontrol etmek için alternatif bir tedavi olarak nasıl kullanılabileceğine dair bakteriyel biyofilm alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Bu prosedürün bir avantajı, minimum ayarlama ile diğer bakteriler için kullanılma potansiyeline sahip olmasıdır.
96 oyuklu bir plakada bir biyofilm oluşturmak için, önce bir eksi 80 santigrat derece ThOD Staphylococcus aureus USA'yı, beş mililitre tripton soya suyu veya TSB, orta içeren ayrı ayrı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplerde klinik suş kültürleri oluşturan üç biyofilm içinde aşılayın ve gece boyunca çalkalayarak 37 derecelik bir inkübatörde. Kültürler sabit faza ulaştığında, bakteri hücrelerini santrifüjleyin ve peletleri ve PBS'yi mililitre konsantrasyon başına birim oluşturan dokuzuncu koloni oluşturan iki kez 10 ila dokuzuncu koloniye yeniden süspanse edin. Bu bakteriyel süspansiyonları bir ila 200 oranında seyreltin ve sıfır nokta yüzde beş glikoz ile takviye edilmiş TSB ortamı ve 200 mikrolitre bakteri hücresini, polistiren hücre kültürü ile muamele edilmiş 96 kuyulu bir mikroplakada deney grubu başına üç kuyucuğa tohumlayın 37 santigrat derecede 24 saatlik bir inkübasyon için, oksijenle, sallamadan.
Ertesi gün, biyofilmleri bozmadan kuyucukları PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, uygun deney kuyucuklarına 200 mikrolitre taze hazırlanmış ALA ekleyin ve plakayı ışıktan koruyarak bir saat boyunca 25 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra plakayı bir saat boyunca santimetre kare başına 100 miliwatt ışık yoğunluğunda bir ışık yayan diyot ile ışınlayın.
Fototerapi tedavisinin sonunda grup başına canlı bakteri sayısını saymak için, yapışmayan hücreleri çıkarmak için her bir kuyuyu PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Ardından, yapışan bakterileri her bir oyuğun dibinden kazımak için bir pipet ucu kullanın. Hücreleri her gruptan deney koşuluna göre bir eppendorf tüpüne çekin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.
Peletleri 37 santigrat derecede 90 dakikalık bir inkübasyon için bir mililitre yüzde 0.25 pankreatin enzimi ve PBS içinde yeniden süspanse edin, ardından başka bir santrifüjleme yapın. Peletleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve her gruptan bir ila 10 seri seyreltme yapın, beş mikrolitre seri olarak seyreltilmiş numuneyi ayrı ayrı tripton soya agar plakalarına ekleyin. Daha sonra plakaları 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin ve grup başına bakteri kolonilerinin sayısını sayın.
Biyofilmleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile değerlendirmek, gösterildiği gibi biyofilmleri oluşturmak ve ışınlamak. Işınlanmış biyofilmleri PBS ile yıkayın ve canlı ve ölü hücreleri sırasıyla bir mililitre yeşil floresan nükleer ve kromozom prokaryotik hücre zarı geçirgen boya ve bir mililitre bir mikromolar propidyum iyodür ile boyayın. 20 dakika sonra fazla lekeyi çıkarın ve biyofilmleri 63 kez 1.4 NA yağa daldırma objektif lensi altında konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleyin.
Biyofilm bakteri canlılığı, ALA fototerapi çift tedavisinden sonra, kontrol tek veya tedavi edilmemiş biyofilm bakteri canlılığına ve test edilen dört suşun tümüne kıyasla azalır. Biyofilmlerin konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülenmesi bu bulguyu doğrular ve ALA fototerapi çift tedavi grubunda propidyum iyodür için pozitif hücrelerin çoğu gözlenir. Bu prosedürü denerken, ALA ile tedavi edilen tüm bakteri manipülasyonunun karanlıkta yapılması gerektiğini ve oluşan biyofilmi bozmamak için malzeme biyofilminin nazikçe ele alınması gerektiğini hatırlamak önemlidir.
Bu mesaj, bakteriyel enfeksiyon alanındaki araştırmacılar tarafından fotodinamik tedavinin bakteriyel biyofilm üzerindeki antimikrobiyal etkisini in vitro olarak araştırmak için uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, 5-aminolevulinik asit aracılı fotodinamik tedavinin (ALA-PDT) bir Staphylococcus aureus biyofilmi üzerindeki antimikrobiyal etkisini incelemek için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem, biyofilm enfeksiyonlarının kontrolüne yönelik alternatif tedavilerle ilgili olarak bakteriyel biyofilm alanındaki temel sorulara yanıt verebilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Fotodinamik Terapi
- Biyofilm Araştırmaları
Arka Plan
- Staphylococcus aureus, biyofilm enfeksiyonları ile ilişkili yaygın bir patojendir.
- Fotodinamik terapi (PDT), bakterileri öldürmek için ışıkla aktive olan bileşiklerin kullanıldığı bir tedavi yöntemidir.
- 5-aminolevulinik asit (ALA), PDT'de kullanılan fotosensitizörlerin sentezinde bir öncü maddedir.
- Bu çalışma, bakteriyel biyofilmlerde ALA-PDT'yi test etmek için in vitro bir model geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- ALA aracılı PDT'nin Staphylococcus aureus biyofilmleri üzerindeki antimikrobiyal etkisini değerlendirmek.
- PDT'nin biyofilm enfeksiyonları için alternatif bir tedavi yöntemi olma potansiyelini araştırmak.
- Diğer bakteri suşları için uyarlanabilecek bir protokol oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Biyofilm oluşturmak için Staphylococcus aureus'un tryptone soya broth (TSB) içine inokülasyonu.
- Kültürlerin durağan faza ulaşması için 37 °C'de inkübasyonu.
- Bakteriyel hücrelerin santrifügasyonu ve PBS içinde yeniden süspande edilmesi.
- PDT tedavisi için bakteriyel hücrelerin 96 kuyucuklu mikroplakaya ekimi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, ALA-PDT testleri için uygun biyofilmleri başarıyla oluşturmaktadır.
- ALA-PDT, Staphylococcus aureus biyofilmlerine karşı potansiyel antimikrobiyal etkiler göstermiştir.
- Yöntem, minimum ayarlamalarla diğer bakteri suşları için uyarlanabilir.
- Tedavi koşullarını optimize etmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Sonuçlar
- ALA-PDT, bakteriyel biyofilmlerin tedavisi için gelecek vadeden bir yaklaşımdır.
- Bu çalışma, fotodinamik terapi alanındaki gelecekteki araştırmalar için bir temel oluşturmaktadır.
- PDT mekanizmalarının anlaşılması, biyofilmle ilişkili enfeksiyonlar için geliştirilmiş tedavi stratejilerine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Bu in vitro model, antimikrobiyal geliştirme süreçlerinde artan bir zorluk olan biyofilm ilişkili enfeksiyonlar için fotodinamik terapinin (PDT) mekanistik değerlendirmesine olanak tanır. Koloni oluşturan birimlerin miktarının belirlenmesi ve konfokal mikroskopi yoluyla canlılığın görselleştirilmesi sayesinde bu analiz, keşif aşamasının erken dönemlerinde PDT adaylarının riskini azaltmak için tekrarlanabilir, kantitatif veriler sağlar. Platform, özellikle Staphylococcus aureus ve diğer biyofilm oluşturan patojenler için önem arz eden anti-biyofilm stratejileri için hedef doğrulama ve öncü bileşik tanımlama çalışmalarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: CFU azalması ve canlılık boyaması aracılığıyla, ALA-PDT'nin S. aureus biyofilmlerine karşı etkinliğine yönelik terapötik hipotezi sorgular.
- Operasyonel Değer: Kontrollü bir biyofilm modelinde fotosensitizatör aktivasyonunu bakteriyel öldürme mekanizmalarıyla ilişkilendirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Standart koşullar altında doz ve zamana bağlı antimikrobiyal etkileri göstererek klinik öncesi devam/durdurma kararlarını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek kapasiteli PDT bileşiği taraması için uygun, 96 kuyucuk formatında olgun ve tekrarlanabilir S. aureus biyofilmleri oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Bileşik gücünün ve biyofilm penetrasyonunun değerlendirilmesi için ortogonal okumalar olarak CFU sayımları ve konfokal mikroskopi verileri sağlar.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Minimal protokol düzenlemeleriyle diğer bakteri suşlarına ve fotosensitizörlere uyarlanabilir, böylece geniş kapsamlı anti-infektif tarama uygulamalarına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Klinik olarak anlamlı S. aureus biyofilm enfeksiyonlarını modelleyerek, in vitro bulguların PDT tabanlı anti-infektiflerin preklinik doğrulamasına aktarılmasına yardımcı olur.
- Mekanistik Risk Azaltma: Canlı/ölü boyama yoluyla PDT mekanizmasını açıklığa kavuşturarak, biyofilm eradikasyon yollarındaki belirsizlikleri azaltır.
- Translasyonel Süreklilik: Birden fazla suş ve deneysel tekrarda yeniden üretilebilir biyofilm inhibisyon verileri sağlayarak ilerleme kararlarını destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz; hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan antibakteriyel keşif sürecine, özellikle biyofilm hedefli yöntemler için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Fizyolojik olarak ilgili bir modelde, PDT ile indüklenen biyofilm bozulması ve bakteriyel canlılık kaybına dair mekanistik hipotezleri test eder.
- Tarama: Fotosensitizerların ve ışık dozu parametrelerinin anti-biyofilm aktivitesi açısından standartlaştırılmış değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Tedavi koşullarını karşılaştırmak ve yapı-aktivite ilişkilerine rehberlik etmek için CFU azalması ve floresans tabanlı canlılık metrikleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Sayısal olarak ölçülebilir ve tekrarlanabilir uç noktalar aracılığıyla, in vitro biyofilm inhibisyonunu preklinik etkinlik modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla patojen hedefi ve fotosensitizer kemotipinde uygulanabilir, modüler bir biyofilm PDT platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bakteriyel öldürmenin doğrudan görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi yoluyla, PDT-biyofilm etkileşimlerindeki mekanistik belirsizlikleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik için tanımlanmış inkübasyon, ışınlama ve okuma adımları içeren, ışıktan korunan standartlaştırılmış bir iş akışı sunar.
- Stratejik Değer: Klinik olarak ilgili bir biyofilm modelinde erken etkinlik verileri sağlayarak, PDT adaylarının devam/dur kararındaki güvenilirliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Belgelenebilir biyofilm penetrasyonuna ve antimikrobiyal aktiviteye sahip bileşikleri tanımlayarak, PDT programlarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Mikrobiyolojik teknikler, biyofilm kültürü ve fotobiyolojik güvenlik protokolleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kontrollü ışık maruziyeti ekipmanına (örneğin, LED ışınım ölçer) ve CFU ve görüntüleme okumaları için floresan mikroskobuna veya plak okuyucuya bağımlıdır.
- Tekrarlanabilirliği sağlamak için ALA hazırlığının, inkübasyon süresinin ve deneysel gruplar arasındaki ışık iletiminin standartlaştırılması gereklidir.
- Diğer bakteriyel suşlara adaptasyon, biyofilm oluşum koşullarının ve fotosensitizör alım verimliliğinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: biyofilm duyarlılığı büyüme evresine ve matris bileşimine göre değişiklik gösterebilir, bu durum karşılaştırmalı çalışmalar için dikkatli kontroller gerektirir.
