5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi etkisi Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya bir In Vitro modeli

Bu deneyin genel amacı, beş aminolevulinik asit veya ALA aracılı fotodinamik tedavinin bir staphylococcus aureus biyofilmi üzerindeki anti-mikrobiyal etkisini değerlendirmektir. Bu yöntem, fotodinamik hücre onarımının biyofilm enfeksiyonlarını kontrol etmek için alternatif bir tedavi olarak nasıl kullanılabileceğine dair bakteriyel biyofilm alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Bu prosedürün bir avantajı, minimum ayarlama ile diğer bakteriler için kullanılma potansiyeline sahip olmasıdır.

96 oyuklu bir plakada bir biyofilm oluşturmak için, önce bir eksi 80 santigrat derece ThOD Staphylococcus aureus USA'yı, beş mililitre tripton soya suyu veya TSB, orta içeren ayrı ayrı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplerde klinik suş kültürleri oluşturan üç biyofilm içinde aşılayın ve gece boyunca çalkalayarak 37 derecelik bir inkübatörde. Kültürler sabit faza ulaştığında, bakteri hücrelerini santrifüjleyin ve peletleri ve PBS'yi mililitre konsantrasyon başına birim oluşturan dokuzuncu koloni oluşturan iki kez 10 ila dokuzuncu koloniye yeniden süspanse edin. Bu bakteriyel süspansiyonları bir ila 200 oranında seyreltin ve sıfır nokta yüzde beş glikoz ile takviye edilmiş TSB ortamı ve 200 mikrolitre bakteri hücresini, polistiren hücre kültürü ile muamele edilmiş 96 kuyulu bir mikroplakada deney grubu başına üç kuyucuğa tohumlayın 37 santigrat derecede 24 saatlik bir inkübasyon için, oksijenle, sallamadan.

Ertesi gün, biyofilmleri bozmadan kuyucukları PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, uygun deney kuyucuklarına 200 mikrolitre taze hazırlanmış ALA ekleyin ve plakayı ışıktan koruyarak bir saat boyunca 25 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra plakayı bir saat boyunca santimetre kare başına 100 miliwatt ışık yoğunluğunda bir ışık yayan diyot ile ışınlayın.

Fototerapi tedavisinin sonunda grup başına canlı bakteri sayısını saymak için, yapışmayan hücreleri çıkarmak için her bir kuyuyu PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Ardından, yapışan bakterileri her bir oyuğun dibinden kazımak için bir pipet ucu kullanın. Hücreleri her gruptan deney koşuluna göre bir eppendorf tüpüne çekin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Peletleri 37 santigrat derecede 90 dakikalık bir inkübasyon için bir mililitre yüzde 0.25 pankreatin enzimi ve PBS içinde yeniden süspanse edin, ardından başka bir santrifüjleme yapın. Peletleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve her gruptan bir ila 10 seri seyreltme yapın, beş mikrolitre seri olarak seyreltilmiş numuneyi ayrı ayrı tripton soya agar plakalarına ekleyin. Daha sonra plakaları 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin ve grup başına bakteri kolonilerinin sayısını sayın.

Biyofilmleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile değerlendirmek, gösterildiği gibi biyofilmleri oluşturmak ve ışınlamak. Işınlanmış biyofilmleri PBS ile yıkayın ve canlı ve ölü hücreleri sırasıyla bir mililitre yeşil floresan nükleer ve kromozom prokaryotik hücre zarı geçirgen boya ve bir mililitre bir mikromolar propidyum iyodür ile boyayın. 20 dakika sonra fazla lekeyi çıkarın ve biyofilmleri 63 kez 1.4 NA yağa daldırma objektif lensi altında konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleyin.

Biyofilm bakteri canlılığı, ALA fototerapi çift tedavisinden sonra, kontrol tek veya tedavi edilmemiş biyofilm bakteri canlılığına ve test edilen dört suşun tümüne kıyasla azalır. Biyofilmlerin konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülenmesi bu bulguyu doğrular ve ALA fototerapi çift tedavi grubunda propidyum iyodür için pozitif hücrelerin çoğu gözlenir. Bu prosedürü denerken, ALA ile tedavi edilen tüm bakteri manipülasyonunun karanlıkta yapılması gerektiğini ve oluşan biyofilmi bozmamak için malzeme biyofilminin nazikçe ele alınması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu mesaj, bakteriyel enfeksiyon alanındaki araştırmacılar tarafından fotodinamik tedavinin bakteriyel biyofilm üzerindeki antimikrobiyal etkisini in vitro olarak araştırmak için uygulanabilir.