Name: Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Öğrenin bitki-mikrop etkileşimlerinde transkripsiyon analizi yöntemini kullanarak Bacillus mycoides'in gen ifadesi değişikliklerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu protokol endofit bakteriler ve bitki kök salgıları araştırmaları için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jakob Viel onun yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Biz de Anne de Jong Biyoinformatik Analizi onun yardım için teşekkür ederim. Yanglei Yi ve Zhibo Li Çin burs Konseyi (CSC) tarafından desteklenir. NWO-TTW Perspectief başına Programma Back2Roots teşekkür ediyoruz (TKI-AF-15510) OPK için finansal destek için.

1. patates steril koşullarda takımıdır
<ol><li>Patates yüzey steril su ile durulayın. % 70 etanol ve daha sonra 5 min için %3 Sodyum hipoklorit patates yıkayın. Tekrar kalan herhangi bir sodyum hipoklorit kaldırmak için steril su ile durulayın.</li>
	<li>Takımıdır ve patates yumrular büyüyen için gerekli malzemeleri hazırlamak; plastik kap, engraftment sepetleri, vermikülit, sterilize ve ısıyla tarafından 20 dk için 121 ° C'de su. Not: kullanılan tüm malzemelerin autoclavable olduğundan emin olun. Aksi takdirde, sterilizing diğer yöntemleri kullanın.</li>
	<li>Engraftment sepet içine yüzey sterilize patates bağlayıp bu ıslak vermikülit içeren autoclaved bir tencereye koyun.</li>
	<li>Pot bir iklim odasında 24 ° C'de üç hafta boyunca devam et. 16 h ışık (120 µmol m-2s-1) ve karanlığın 8 h döngüleri üzerinde ayarlayın. Mikrobiyal contaminations önlemek için bir büyük cam elyaf kutu kapak pot kullanın.</li>
</ol>2. toplama patates kök Exudates
<ol><li>Sürgünler filiz, transfer autoclaved deiyonize su ile 150 mL steril bir kabı içine bütün patates sepetle doldurdu ile patates yumrular su yüzeyi ve kökleri yer sular altında suda (bkz. Şekil 1). Fide iklim odasında tutmak ve aynı ayarları daha önce olduğu gibi [24 ° C; ışık (120 µmol m-2s-1), karanlığın 8 h 16 h döngüleri] kullanın.</li>
	<li>İkinci gün, gelen su exudates içeren toplamak ve kabı steril deiyonize su ile doldurma. Örnekleme gerçekleştirmek fide aktarma sonra yedinci güne kadar her gün.</li>
	<li>Her örnek ayrı olarak 4 ° C'de depolayın Her örnek için Luria Bertani üzerinde 100 µL yaymak (LB; % 1'tryptone, % 0.5 maya ekstresi, % 0.5 NaCl) agar plaka için mikrobiyal contaminations kontrol etmek için. Kirlenmiş örnekleri atmak.</li>
	<li>Bir fide toplanan örnekleri birleştirir ve onları onları-40 ° c ile 150 mL son hacmi dağılması konsantre.</li>
</ol>3. büyüyen bakteriler
<ol><li>B. mycoides zorlanma bir LB agar plaka üzerine bir-80 ° C gliserol stoktan çizgi ve 30 ° c plaka gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Bir koloni plaka ile bir LB sıvı orta aşılamak ve 30 ° C'de gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka kültür büyümek</li>
</ol>4. tedavi ve bakterilerin örnekleme
<ol><li>Bir negatif kontrol için kök exudates ile tedavi bakterilerin büyüme eğrisi karşılaştırmak için bir dizi içeren LB sıvı orta 50 mL şişe hazırlayın. Tüm şişeler için gecede bakteriyel kültürünün 0.5 mL ekleyin ve % 0, % 5, % 10 veya % 15 (v/v) kök çıktı ya da steril deiyonize suyla orta olarak sırasıyla ekleyin.</li>
	<li>Bir kültür deiyonize su kök exudates yerine bir denetim olarak kullanın. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) her 1 saat sonra. OD600 değerleri zaman karşı komplo tarafından bir büyüme eğrisi oluşturur. Not: Biz kök exudates yüzde 10'u B. mycoides gelişimini etkilemez mi gördüm (bkz: Şekil 2); Bu oran RNA-seq deneyler için kullanıldı.</li>
	<li>Bir gecede B. mycoides kültürü ile önceden ısıtılmış LB orta ve ilk doz600 itibaren 90 mL seyreltik ~ 0,05 bir 300 mL şişe içinde. Kültür için kök exudates 10 mL ekleyin ve 1 h için 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>10 mL steril deiyonize su arıtma bir denetim olarak kullanın. Santrifüjü 9000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından kültür hücreleri toplamak Süpernatant, atmak ve hemen Pelet sıvı azot içinde dondurmak, sonra-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
</ol>5. RNA izolasyon
Not: yalıtım başlamadan önce tezgah, raflar ve pipetler RNase dekontaminasyon çözümünü ile temizleyerek hazırlayın ( Tablo malzemelerigörmek). Her zaman eldiven ve tüm tüpler, keyif ve çözümleri RNase ücretsiz olduğundan emin olun. Her zaman örnekleri buz mümkün olduğunda üzerinde tutun.
<ol><li>Ultrasaf Su (100 mL solüsyon başına DEPC, 100 µL) %0.1 dietil pyrocarbonate (DEPC) (v/v) eklemek, iyice karıştırın ve bir gecede oda sıcaklığında saklayın. Otoklav karışımı gece tedaviden sonra DEPC devre dışı bırakabilirsiniz. TE arabellek hazırlamak için bu DEPC tedavi ultrasaf su kullanın [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] ve % 10 SDS (w/v) çözüm.</li>
	<li>Hücre topakları buz çözme ve her biri 400 µL TE (DEPC) arabelleği askıya alma. Süspansiyonlar 2 mL vidalı kapak tüpler içine aktarın.</li>
	<li>Kloroform izoamil alkol (24:1 v/v) 300 µL ve fenol (asit fenol, RNA sınıf) 300 µL premix ve 5 min için durmak karışım izin verin. Resuspended hücrelere eklemek için organik üst aşaması 500 µL al. Daha sonra 50 µL % 10 SDS ve cam boncuk (0.5 µm) 0.5 g tüp içine ekleyin.</li>
	<li>Kapağı sıkıca kapatın ve bir boncuk-değirmen homogenizer tüpü yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). 3 × 45 s darbe homojenizasyon 1dk aralığı ile buz üzerinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Örnekleri için 11.000 x g (4 ° C) de 10 dk santrifüj kapasitesi ve üst aşaması için yeni bir tüp aktarın.</li>
	<li>Kloroform izoamil alkol (24:1) 500 µL üst aşamaya adım 5.5 ekleyin ve karışımı 11.000 x g (4 ° C) de 5 dk santrifüj kapasitesi. Not: Aşağıdaki adımları bir ticari cam elyaf filtre tabanlı RNA izolasyon üreticinin yönergesinden modifiye edildi ( Tablo malzemelerigörmek) kit.</li>
	<li>500 µL üst aşaması için taze bir tüp transferi, 2 cilt (1 mL) bir lizis/bağlama arabellek ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Filtre ve toplama tüpler (gelen RNA izolasyon kit) birleştirin ve filtre boru 5.7. adımdaki karışıma pipette. 15 tüpler santrifüj kapasitesi 8000 x g ve atma akışı aracılığıyla s.</li>
	<li>DNaz arabelleği, DNaz 10 µL 100 µL tüplerini microcentrifuge 1,5 mL hazırlamak ben ve 5 µL bir RNase inhibitörü ( Tablo malzemelerigörmek). Filtre tüp filtre üzerinde hazır çözüm mix ekleyin ve 20-30 dk 15-25 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>Üreticinin yönerge göre çamaşır adımları gerçekleştirin. 50 µL elüsyon arabelleği RNA elute için kullanın.</li>
	<li>-80 ° C'de eluted RNA kaydedin ve çevresinde bir plastik parafin film koymak. Aynı zamanda, bir kaç microliters örnek bir kalite denetimi gerçekleştirmek için 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
</ol>6. RNA kalite kontrol ve sıralama
<ol><li>RNA microvolume Spektrofotometre ile kontrol edin. Not: 260/280 oranlarıyla absorbans 1.8 olmalıdır ve 260/230 oranlarıyla en az 1,8, tercihen 2.0 yukarıda yukarıda olmalıdır.</li>
	<li>Çalıştır tavsiye RNA analizi kullanarak bir otomatik Elektroforez alet arıtılmış RNA kiti ( Tablo malzemelerigörmek); RNA bütünlüğü (RIN) en az 7 devam etmek için olmalıdır.</li>
	<li>RNA 3 µg örnek başına toplam miktarı bir RNA-Seq Kütüphane hazırlık kitaplıklarıyla oluşturmak için kullanın (bkz. Tablo reçetesi) kit üreticinin önerilerini takip. Not: Yüksek işlem hacmi sıralama platformda Kütüphane hazırlıklar sıralı ve eşleştirilmiş uç okuma oluşturuldu.</li>
</ol>7. veri analizi Web tabanlı boru hattı T-REx
<ol><li>Bir kalite FASTX-Toolkit sürüm 0.0.13 kullanarak filtreleme gerçekleştirmek (> 20 Kalite Puanlarını Phred). Trimmomatic aracı ile bağdaştırıcısı dizilerinden ham RNA-Seq okuma kırpın. Not: Yüksek kalite ile temiz veri aşağı akım analizleri dayalı idi.</li>
	<li>B. mycoides ATCC 6462 NCBI genom veritabanı indir (NCBI katılım No: CP009692.1) ve Bowtie2/2.2.3 kullanarak temiz okuma eşlemek için bir başvuru genom kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Kullanım HTSeq v0.6.1 okunma sayıları saymak için her gen için eşlenen ve okuma transkript milyon eşlenen okuma (RPKM) her gen başına kilobaz başına bu gen için eşlenen gen ve Okunma sayısı uzunluğu temel.</li>
	<li>T-REx boru hattı tarafından veri analizi için RPKM tablo giriş yanı sıra üç açıklayıcı dosya kullanın: faktörler, deneyde hangi faktörler farklı gen ekspresyonu için Karşılaştırılacak tanımlamak için (II) bir tezat dosya tanımlamak için (i) bir faktörler dosya ve (iii) genleri ilgi grupları tanımlamak için bir sınıf dosyası. Not: İn.txt biçimde açıklayıcı dosyalarıdır. Örnekler T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/) Web sayfasında bulunabilir. T-REx kullanarak veri analizi için ayrıntılı bir talimat önceki yayında de Jong vd tarafından bulunabilir 14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bitki-mikrop etkileşimleri bakteri ve bitkiler arasındaki ince ayarlı bir denge tarafından belirlenecek olan. Bu tür etkileşimler son derece karmaşık ve zor çalışma için doğal bir sistemde, hangi oluşur çeşitli mikrobiyal türler, potansiyel olarak konsorsiyum hareket. Bu kağıt bakteriyel yanıt-e doğru kök exudates iyi kontrollü şartlar altında çalışmak için basitleştirilmiş bir protokolünü açıklar. Rhizobacteria, kök exudates, maruz kalma üzerine transcriptome profil bakteriyel uyum rizosferde niş için ayrıntılı bilgi sa...

Bitkiler fotosentez kökleri aracılığıyla sırasında sabit rizosferde1, yani, toprak kökleri yakınındaki dar bölge içine karbon % 20'e kadar çıktı olabilir. Daha yüksek besin durumu nedeniyle, rizosferde bitki büyüme teşvik bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmalar için uygun bir yaşam alanı olduğunu. Kök exudates inorganik bileşikler iyonları, İnorganik asitler, oksijen ve su gibi bir dizi içerir. Ancak, kök exudates çoğunluğu düşük moleküler ağırlıklı bileşikler ve yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler ayrılabilir organik maddeler tarafından oluşturulur. Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler amino asitleri, organik asitler, şekerler, fenolik bileşikler, yağ asitleri ve sekonder metabolitler bir dizi içerir. Yüksek molekül ağırlıklı bileşikler zamk ve proteinler2,3/ oluşur. Rizosferde mikroorganizmaların bu bileşiklerin bazıları büyüme ve gelişme için bir enerji kaynağı olarak kullanabilirsiniz. Kök exudates exudates bitki üretilen bileşikler belirli genlerin ifade etkileyen bakteriler rizosferde ilişkili davranışını etkileyebilir beri rhizobacterial topluluk şekillenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.
Bakteriyel yanıt-e doğru kök exudates anlama bitki-mikrop etkileşim mekanizmaları deşifre önemli bir adımdır. Bakteriyel yanıt-e doğru bitki-mikrop etkileşimleri farklı gen ekspresyonu ürün olduğu için transcriptome analizi ile okudu olabilir. Bu yöntemi kullanarak, önceki çalışmalarda birkaç önemli genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tespit edilmiştir. Pseudomonas aeruginosaiçinde genlerin metabolizma, kemotaksis ve tip II salgı şeker pancarı kök exudates4' e cevap gösterilmiştir. Fan ve ark. 5 yanıt olarak Mısır kök exudates B. amyloliquefaciens FZB42 transcriptomic profilleme okudu. Güçlü kök exudates tarafından indüklenen genler, çeşitli gruplar metabolik yollar besin kullanımı, kemotaksis, hareketliliği ve ribozomal sigara Sentezi antimikrobiyal peptidler ve polyketides ilgili söz konusu olduğunu, bunların sonuçları göster.
Bu çalışmalar doğruluğunu kök exudates koleksiyon üzerinde dayanır. Her ne kadar çeşitli yöntemler farklı amaçlar için kök exudates topluluğu tarif var, sofistike aletleri talep ya da iyi denetlenen koşullar6,7,8' gerçekleştirilmez. Ayrıca, rizosferde inhibe mikroorganizmalar bitki hücre membran geçirgenliği etkileyen kök çıktı kompozisyon etkileyebilir ve konsorsiyumlar mikroorganizmaların9durumunda özellikle kök dokulara zarar. Kök exudates mikrobiyal cevaben araştırıyor tarafından diğer mikroorganizmalar10bileşikleri değiştirilmesini önlemek için iyi tanımlanmış koşulları kullanmak önemlidir. Ayrıca, RNA-seq tabanlı transcriptome çalışmaları için yüksek kaliteli RNA gereklidir. Ancak, modeli bakteri suşları ile uğraşırken, standart protokolleri veya ticari kitleri genellikle düşük verimlilik bilinmeyen faktörler veya özel büyüme özellikleri nedeniyle var.
Burada açıklanan protokol Firmicute şube bir gram-pozitif, spor oluşturan bakteri olan B. mycoides,'ı kullanarak doğrulandı. Çeşitli bitki türlerinin rizosferde içinde her yerde. Şeker pancarı11, sönümleme-off patojen Pythium salatalık12yanı sıra azot inhibisyonu indüksiyon sistematik direnç (ISR) dahil olmak üzere bu tür için birkaç bitki büyüme teşvik özellikleri bildirilmiştir Ayçiçeği rizosferde13fiksasyonu. Ancak, bir ana bitki ile etkileşimi moleküler mekanizmaları iyi okudu değil.
Burada sunulan deneyler amacı endosphere izole B. mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Kısacası, protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: Birincisi, patates kök exudates Steril koşullar altında toplamak. Sonra yüksek kaliteli RNA bakteri hücreleri kök exudates ile tedavi ayıklamak. Son adım, web tabanlı T-REx boru hattı14kullanarak veri analizidir. Bu iletişim kuralı ifade düzeylerinde kök-exudates ile temas üzerine bir kayma göstermek ve böylece bitki-mikrop etkileşimlerde önemli bir rol oynayabileceği B. mycoides genlerin tanımlamak için kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>sodyum hipoklorit</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>% 10-15 & nbsp aktif klor</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) et suyu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkübater</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cam boncuklar</td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 & mikro; m</td></tr><tr><td>2.0 ml vidalı kapaklı</td><td></td><td></td> tüp <td>RNase içermez</td></tr><tr><td>1.5 ml ve 2.0 ml eppendorf tüp</td><td></td><td></td><td>RNase içermez</td></tr><tr><td>Boncuk değirmeni homojenizatör</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>DEPC ile arıtılmış MQ su ile hazırlanmış %10'luk çözelti</td></tr><tr><td>TE tamponu</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH = 8</td></tr><tr><td>fenol</td><td>Sigma</td><td></td><td>RNA sınıfı</td></tr><tr><td>kloroform-izoamil alkol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>24:1 kloroform: izoamil alkol hazırlayın, oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Yüksek saflıkta RNA izolasyon kiti</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase Dekontaminasyon Solüsyonu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Otomatik elektroforez cihazı</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Biyoanalizör</td></tr><tr><td>Mikrohacim spektrofotometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA kalite analiz kiti</td><td>Agilent</td><td>RNA 6000 Nano kiti&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Yönlü RNA kütüphanesi</td><td>Illumina için</td> Hazırlık kiti <td>NEB</td><td>Ultra</td></tr></tbody></table>

bitki-mikrop etkileşim: transkripsiyon yanıt bacillus mycoides patates kök exudates için

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Yararlı bitki ilişkili bakterilerin büyüme teşvik ve bitkilerde hastalık önleme önemli bir rol oynamaktadır. Bitki büyüme teşvik rhizobacteria (PGPR) uygulama biofertilizers veya biyolojik ajanlar olarak geleneksel gübre kullanımı için etkili bir alternatif haline gelmiştir ve düşük maliyetle ürün verimliliği artırabilir. Bitki-mikrop etkileşimler ana bitki salgılanan sinyalleri ve onların ilişkili bakteriler tarafından bu andan bir tepki bağlıdır. Ancak, nasıl yararlı bakteriler moleküler mekanizmaları için bunların ilişkili bitki kaynaklı sinyalleri tam olarak anlaşılamamıştır yanıt. Kök exudates bakteri transcriptomic yanıtı değerlendirirken bakteri gen ekspresyonu ve yönetmelik rhizospheric koşullar altında belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Böyle bir bilgiye temel mekanizmaları bitki-mikrop etkileşimleri dahil anlamak gereklidir. Bu kağıt B. mycoides EC18, patates endosphere patates kök exudates için izole bir yük transcriptomic yanıt çalışmaya detaylı bir protokolünü açıklar. Son yüksek üretilen iş sıralama teknolojisi sayesinde, bu iletişim kuralı birkaç hafta ve üretmek büyük veri kümeleri olarak gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kök exudates sonra bunlar B. mycoides kültürler için eklenir steril koşullarda topluyoruz. Bu kültürlerden RNA ticari bir kit ile kombine ve kalite kontrol için otomatik Elektroforez enstrüman tarafından tabi fenol/kloroform yöntemini kullanarak ayrı tutulur. Sonra sıralama, veri analizi T-REx örümcek ağı-esaslı boru hattı ile gerçekleştirilir ve bir grup differentially ifade genlerin tanımlanır. Bu yöntem bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer üzerinde yeni keşifler kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.

Bitki ilişkili mikroorganizmalar bitki büyüme ve Sağlık olumlu etkileyebilir. Ancak, bitkiler ve onların mikrobiyal simbiont arasındaki karmaşık etkileşimler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değildir. Kök exudates rhizobacterial etkinliği ve davranış düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve genellikle kökleri mikrobiyal kolonizasyon mikroplar kök exudates için cazibe olan başlatır öne ise. Bu çalışmanın amacı, rhizobacterial B. mycoides patates kök exudates için transcri...

Burada sunulan Protokolü amacı endosphere izole Bacillus mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Bu yöntem önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tanımlamasını kolaylaştırır ve prensip olarak diğer endophytes ve bitkilerle küçük ayarlamalar için geçerli olduğunu.

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Bu yöntem, bitki-mikrop etkileşimi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, bakterilerin bitki ile etkileşimi sırasında endosfer veya rizosferden izole edilen bakteri suşlarından önemli genleri tanımlayabilirsiniz. Bitkilerle diğer bakteriler üzerinde yapılan çalışmalar için de kullanılabilen çok yönlü bir yöntemdir.Bu tekniğin temel avantajı, nispeten kısa bir sürede, bitki-mikrop etkileşimleri sırasında önemli olan çok sayıda bakteri geninin tanımlanabilmesidir. Bu işleme başlamak için patates yüzeyini steril suyla durulayın. Patatesi beş dakika boyunca %70 etanol içinde ve ardından beş dakika daha %3 sodyum hipoklorit içinde yıkayın.Daha sonra, kalan sodyum hipokloriti çıkarmak için tekrar steril suyla durulayın. Ardından, patates yumrularını çimlendirmek ve büyütmek için gerekli malzemeleri hazırlayın. Plastik kapları, aşılama sepetlerini, vermiküliti ve suyu 121 santigrat derecede 20 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.Daha sonra, yüzeyi sterilize edilmiş patatesi aşılama sepetine koyun ve ıslak vermikülit içeren otoklavlanmış bir tencereye koyun. Mikrobiyal kontaminasyonları önlemek için tencereyi örtmek için büyük bir cam elyaf kutu kullanın. Tencereyi üç hafta boyunca 24 santigrat derecede bir iklim odasında tutun ve 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngülerine ayarlayın.Patates kökü eksüdalarını toplamak için, sürgünler filizlendiğinde, sepeti bütün patatesle birlikte 150 mililitre otoklavlanmış deiyonize su ile doldurulmuş sterilize bir behere aktarın, patates yumruları su yüzeyinin hemen üzerine yerleştirilir ve kökler suya batırılır. Fideyi iklim odasında tutun ve daha önce olduğu gibi aynı ayarları kullanın. İkinci günden itibaren, eksüdaları içeren suyu toplayın ve kabı steril, deiyonize su ile doldurun.Daha sonra her bir numuneyi ayrı ayrı dört santigrat derecede saklayın. Her numune için, mikrobiyal kontaminasyonları kontrol etmek için bir Luria-Bertani agar plakasına 100 mikrolitre yayın. Kirlenmiş numuneleri atın.Bir fidanın toplanan örneklerini birleştirin. Daha sonra kombine kök eksüdalarını 50 mililitrelik tüplere aktarın. Kök eksüdaları içeren tüpleri eksi 80 santigrat derecede dondurun.Eksi 40 santigrat derecede dondurarak kurutarak 150 mililitrelik bir nihai hacme kadar konsantre edin. Bakterileri büyütmek için, eksi 80 santigrat derece gliserol stoğundan bir LB agar plakasına bir B.mycoides suşu çizin ve plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra LB sıvı ortamını plakadan tek bir koloni ile aşılayın ve kültürü gece boyunca 30 santigrat derecede 200 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde büyütün.Bakterileri tedavi etmek ve örneklemek için, bir gece boyunca B.mycoides kültürünü 90 mililitre önceden ısıtılmış LB ortamı ile 300 mililitrelik bir şişede sıfır nokta sıfır beşin ilk OD600'üne seyreltin. Daha sonra, kültüre 10 mililitre kök eksüda ekleyin ve kontrol olarak 10 mililitre steril, deiyonize su arıtımı kullanın. Sonra onları bir saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.Bir saat sonra, kültürü 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri, dört santigrat derecede iki dakika boyunca 9.000 kez G'de santrifüjleme ile kültürden toplayın. Daha sonra, süpernatenti atın ve peleti hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.Daha sonra kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. RNA'yı izole etmek için, hücre peletlerini buz üzerinde çözün ve her birini 400 mikrolitre TE tamponunda askıya alın. Ardından süspansiyonları iki mililitrelik vidalı kapaklı tüplere aktarın.Tüpün içine sıfır nokta beş gram cam boncuk ekleyin. Ardından kapakları sıkıca kapatın ve tüpleri bir boncuk değirmeni homojenizatörüne yerleştirin. Buz üzerinde bir dakikalık aralıklarla üç kez 45 saniyelik darbeli homojenizasyon gerçekleştirin.Daha sonra, numuneleri 11.000 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin ve her numunenin üst fazını yeni bir tüpe aktarın. Üst faza 500 mikrolitre kloroform: izoamil alkol ekleyin ve karışımı 11.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Bir mililitre lizis bağlayıcı tampon ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Daha sonra, 100 mikrolitre DNaz tamponu, 10 mikrolitre DNaz I ve beş mikrolitre RNaz inhibitörü içeren bir nokta beş mililitre mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Hazırlanan çözelti karışımını filtre tüplerinin filtresine ekleyin ve 15 ila 25 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, yıkama adımlarını üreticinin talimatına göre gerçekleştirin ve tüpe 50 mikrolitre bir elüsiyon tamponu ekleyin.Santrifüjlemeden sonra, RNA'yı elüte edin. Kalite kontrolü yapmak için numunenin birkaç mikrolitresini bir nokta beş mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Son olarak, kaçan RNA'yı plastik bir parafin film ile örtün ve eksi 80 santigrat derecede tutun.Toplandıktan sonra, kök eksüdaları B.mycoides kültürüne %10 oranında ilave edildi ve bakteri toplam RNA'sı izole edildi. RNA daha sonra otomatik bir elektroforez cihazı tarafından bir kalite kontrolüne tabi tutuldu. Bu grafikler, kök eksüdaları ile muamele edilen B.mycoides'ten izole edilen RNA'yı temsil eder ve bu grafikler, kontrol grubundan izole edilen RNA'yı temsil eder.Tüm numuneler, 16S ve 23S RNA alt birimlerine karşılık gelen iki açık bant ile dokuzun üzerinde bir RIN değeri aldı ve bu protokol ile yüksek kaliteli RNA'nın elde edildiğini gösterdi. Kütüphane hazırlığından sonra, yüksek verimli bir sıralama platformu ile çift uç okumaları elde edildi. Ham RNA-seq okumaları, adaptör dizilerinden kırpıldı ve referans genom dizisine karşı eşlendi.Transkript ev analizi, T-REx boru hattı ile gerçekleştirildi ve diferansiyel olarak ifade edilen tüm genlerin oran yoğunluk grafiği burada gösterilmiştir. Potansiyel olarak önemli gen tanımlandıktan sonra, konakçı bitki ile etkileşim sırasında belirli genlerin ayrılmış ekspresyonunda geçen süre gibi ek soruları yanıtlamak için promotör GFP füzyonu, cue-pews-air ve floresan in situ hibridizasyon gibi diğer in vivo yöntemler gerçekleştirilebilir.

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Yi, Y., ve diğerleri. Bitki-Mikrop Etkileşimi: Bacillus Mycoides'in Patates Kökü Eksüdalarına Transkripsiyonel Tepkisi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için Bacillus mycoides kültürlerinin hazırlanmasını ve işlenmesini göstermektedir. Bir stok kültürünün çizilmesinden ve sıvı ortamda inkübe edilmesinden, bakterilerin çalkalama altında bitki kökü sızıntılarına maruz bırakılmasına kadar olan adımları özetlemektedir. İşlem, eksüdaların neden olduğu gen...

İn Vitro Bitki-Mikrop Etkileşimlerini Taklit Etmek için Bakterilerin Bitki Kökü Sızıntıları ile Tedavisi

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Tarif edilen hidrofobik kokültivasyon sistemi, metal örgülü elekler ile bozulmamış bitkileri destekler ve bunları bakteriler ile birlikte yetiştirir. Bitki dokuları, bakteriler ve salgılanan moleküller daha sonra aşağı akış analizleri için ayrıca hasat edilebilmekte, aynı anda her iki bitki barınağının ve etkileşen mikropların veya mikrobiyolojilerin moleküler tepkileri araştırılabilmektedir.

Bitki / Mikrop Moleküler Etkileşimlerinin ve Sinyalizasyonunun Eşzamanlı ve Sistematik Analizi için Hidroponik Birlikte Yetiştirme Sistemi

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Sunulan yöntem, Manduca Sexta larvası uygulama aracılığıyla doğal otobur hasarlı bitki dokusu oluşturur patates ayrılmış yaprakları. Bitki dokusu böcek herbivory erken tepkiler dahil altı transkripsiyon faktör homolog ifadesi için farklı teknik kullanılarak.

Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Bu protokol, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılamak için stratejilerin ayrıntılı bir özetini sunar. Verticillium longisporum ve Verticillium dahliae mantarları için örneklendirilen üç farklı kök enfeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Potansiyel uygulamalar ve olası aşağı akış analizleri vurgulanır ve her sistem için avantajlar veya dezavantajlar tartışılır.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Mikroplu veya mikropsuz filogenetik olarak farklı çeşitli bitkilerin büyümesini destekleyen cam bazlı, yarı hidroponik bir deney sistemi için bir protokol sunuyoruz. Sistem, farklı büyüme ortamlarıyla uyumludur ve aşağı akış analizi için tahribatsız kök eksüda örneklemesine izin verir.

Yarı Hidroponik Kök Eksüda Profillemesi için Çok Yönlü Cam Kavanoz Sistemi

Protokol, Solanum tuberosum köklerinin in vivo sera koşullarında bitki parazitik nematodları ve optik mikroskopi ile kök yapısının histokimyasal analizi için patates in vitro transgenik kökleri ile enfeksiyonunu açıklar.

İndüklenen Yapısal Değişikliklerin Değerlendirilmesi için Patates Köklerinin Bitki Paraziti Nematodlarla İn vivo ve İn vitro Enfeksiyonu

Öğrenin bitki-mikrop etkileşimlerinde transkripsiyon analizi yöntemini kullanarak Bacillus mycoides'in gen ifadesi değişikliklerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu protokol endofit bakteriler ve bitki kök salgıları araştırmaları için uygulanabilir.

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için

Daha fazla video keşfet