Name: Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Öğrenin, lentiviral vektör enjeksiyonu ile transgenik fare üretimini. Perivitelin boşluğuna yapılan bu basit yöntem, yüzde yetmişin üzerinde başarı sağlar ve gen fonksiyonu çalışmalarını hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Magali Dumont ve Rolando Meloni lentiviral vektör üretim ve hayvan sırasıyla konut teknik yardım için el yazması ve iVector ve Phenoparc ICM çekirdek eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Institut Universitaire Hospitalo de sinir Translationnelles de tarafından desteklenen Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10 / IAIHU / 06. Alınan Halkla İlişkiler Derneği de Langue Française için finansman dökün l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) ve ortak bir JDRF / INSERM verin.

Hayvan iş dahil tüm yordamlar etik onay almış ve Fransızca Bakanlığı araştırma ve eğitim numarası APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 altında ve 05311.02 tarafından yetkili olmamıştır. PHENOPARC Fransız Tarım Bakanlığı Akreditasyon numarası B75 altında tarafından akredite ICM hayvan tesisi 13 19. Genel iletişim kuralı her yordam özetlenir kesin bir zaman çerçevesi içinde Şekil 1' de gerçekleştirilmesi.
1. hayvan satın alma ve temel bileşenler hazırlanması
<ol><li>Hayvan satın alma<ol>
<li>8 hafta (F1 üretimi orijinal ♀C57Bl/6JRj ve ♂CBA/JRj arasında haçlar) Yaş 25 vasectomized erkek B6CBAF1/JRj sipariş. Not: erkek girişte yalıtmak. Vasectomized erkeklerin en az bir yıl için yeniden kullanılabilir. Kafesleri her 3 haftada değiştirin.</li>
		<li>10 hafta-in yaş ve en az 50 hayvanların bir havuzu tutun 50 B6CBAF1/JRj kadın sipariş.</li>
		<li>10-15 C57BL/6JRj verimli erkek 8 hafta-in yaş olan sipariş.</li>
		<li>4 hafta-in yaş vardır sipariş 30 C57BL/6JRj kadın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestezi ve ötenazi<ol>
<li>Anestezi intraperitoneally enjekte 300μL ketamin/xylazine karışımı bir birim için gerçekleştirilir (ketamin, 150μg/g vücut ağırlığı, xylazine, 0.15μg bir doz doz / g vücut ağırlık). Hayvanların vücut sıcaklığı ayarlamak için yastık Isıtma altında yerleştirilir. Refleksleri hayvanın kuyruk başlamadan önce yordamı pinching tarafından kontrol edin.</li>
		<li>Ötenazi servikal çıkığı tarafından gerçekleştirildi. İşten çıkarma ölüm hayvan onaylamak için bir ikincil Yöntem olarak dahil edildi. Ötenazi embriyo işten çıkarma tarafından gerçekleştirildi. Not: elimize hayvanlar (işleme veya çiftleşme) tesisin alıştırmak için 1 hafta en az izin. Önemlisi, transgenik satırları da dahil olmak üzere herhangi bir fare suşları olarak verimli ve bereketli erkeklerde ovumun için yararlı olabilir. Seçtiğiniz zorlanma bir bilimsel soru gereksinimlerine göre yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hormon hazırlık<ol>
<li>PSMG (hamile Mare Serum Gonadotropin) arabelleği 910 µL 1 liyofilize PMSG şişe eklemek, 100 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın Not: Her aliquot 11 fareler için 55 Kullanıcı arabirimi içerir. Asla 2 haftadır ilk kullanımdan sonra devam PMSG aliquots.</li>
		<li>2730 µL hCG (insan korionik Gonadotropin) arabelleği 1 içine hCG şişe liyofilize ekleyin. 100 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın Not: Her aliquot 11 fareler için 55 Kullanıcı arabirimi içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hyaluronidase hazırlık<ol>
<li>Hyaluronidase 1 şişe M2 10 mg/mL stok çözüm elde edilir ve 50 µL aliquots olun orta 3 mL ile yeniden oluşturma. -20 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ameliyat araçları hazırlama<ol>
<li>Otoklav kullanarak tüm cerrahi .aletleri sterilize.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kadın bağış ovumun
<ol><li>12 h kullanarak bir hayvan tesiste gün - gece döngüleri, 2 de gün -3 PMSG enjekte. HCG gün -1 ve dostum 12 am sadece hCG enjeksiyonu sonra verimli erkek ile enjekte.</li>
	<li>-3 günde 1 mL steril % 0,9 NaCl çözeltisi PMSG 100 µL 1 aliquot ekleyin (55 UI). 10 C57BL/6JRj kadın intraperitoneally herhangi bir ölü cilt olmadan kullanarak 100 µL ile enjekte. Not: Her fare 5 ka'PMSG alırsınız.</li>
	<li>Gün -1, 1 mL steril % 0,9 NaCl çözeltisi hCG 100 µL 1 aliquot ekleyin (55 UI). Seyreltilmiş hCG çözüm (5UI) ile 100 µL PMSG enjeksiyon intraperitoneally alınan fareler enjekte. Bir şırınga herhangi bir ölü cilt olmadan kullanın. Enjeksiyon yavaş yavaş gerçekleştirmek ve böylece sıvı değil kaçak iğne kaldırmadan önce bekleyin. Not: Her fare 5 ka hCG'alırsınız. HCG enjeksiyonu 46 h PMSG sonra yapılmalıdır.</li>
	<li>Her C57BL/6JRj erkek damızlık erkek, kafes içinde doğrudan hCG enjeksiyonu sonra yerleştirin.</li>
	<li>0 gün sabahı vajinal fişleri kontrol ve olumlu dişiler döllenmiş yumurta toplamak için kullanın.</li>
</ol>3. B6CBAF1/jRj Pseudopregnant kadın hazırlayın
<ol><li>Bir vasectomized erkek 5 de yumurta toplama (gün -1) 2 B6CBAF1/JRj kadın önceki gün dostum. Not: Mate ile eşitleme kadın döngüleri önlemek için farklı mağaraları tarafından kaynaklanan kadın için çok önemli. Bu vajinal fiş alma verim artacak. Buna ek olarak, bir erkek için son 2 gün içinde değiştirilmiş olan bir erkek kafes eklemek değil. Kafes kirli olduğunda erkek üreme davranışı etkinliği artar.</li>
</ol>4. döllenmiş yumurta toplama
<ol><li>Hazırlık<ol>
<li>1450 µL m2 hyaluronidase çalışma çözüm hazırlamak için hyaluronidase hisse senedi ekleyin.</li>
		<li>Bir damla hyaluronidase çalışma çözüm 100 mm Petri kabına döllenmiş yumurta üretmek ve oda sıcaklığında tutmak için kullanılan erkek başına 100 µL yerleştirin.</li>
		<li>M16 500 µL 4 kuyu tabak içine ekleyin. Her türü zerk edilecek lentiviral vektörlerin 2 kuyu kullanın: bir de içerir enjekte yumurta ve diğer sigara enjekte olanlar. 4 iyi plakaları bir % 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C'de kuluçka yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetler toplama ve işleme embriyolar için hazırlayın.<ol>
<li>Cam hematokrit kapiller (75 mm/60 µL) sabit cam Kılcal boru içinde alev ortasına döndürerek yumuşatır.</li>
		<li>Kılcal bir tüp ile bir iç çapı yaklaşık 300 µm. çekme temiz bir mola almak için soğutmalı tüp üzerinde edinmek için çekme ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde ısı kaldırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oviducts toplamak.<ol>
<li>C57BL/6JRj kadın rahim ağzı çıkığı gün 0 9 am tarafından ötenazi. Ölüm işten çıkarma tarafından onaylanır. Not: Bu ötenazi Yöntem IACUC tarafından kabul edildi ve Avrupa önerileri takip eder.</li>
		<li>Karın boşluğu makasla açmak için büyük bir yatay kesi gerçekleştirin. Ovidukt rahim ve yumurtalık arasında yer almaktadır.</li>
		<li>Mesometrium ve önde gelen kan damarları ile eğri forseps taşıyan membran kaldırın.</li>
		<li>Ovidukt yumurtalıktan eğri forseps ile ayırın.</li>
		<li>Kıvrımlı pensler ovidukt eğri makas kullanarak yumurtalık üzerinden kesmek için bir kılavuz olarak kullanın.</li>
		<li>Ovidukt çekin ve rahim eğri makasla kesti. Uyarı: döllenmiş yumurta içeren şişmiş ampulla dokunmayın. Steril aletler kullanarak tüm yordamı gerçekleştirin.</li>
		<li>Tüm toplanan oviducts M2 Orta (35 mm Kültür çanak) Oda sıcaklığında yerleştirin</li>
		<li>2 oviducts hyaluronidase çalışma çözüm (0.3 mg/mL) aynı 100 µL düşüş yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kümülüs hücreleri döllenmiş yumurta kaldırın.<ol>
<li>Bir stereomicroscope altında 2 insülin şırınga kullanın: ovidukt tutmak için ilk ve ampulla kadar gözyaşı ve dağıtmak için ikinci bir hyaluronidase çalışan çözüm yumurta döllenmiş.</li>
		<li>Yumurta toplamak için hazırlanan cam damlalıklı al ve tüp ve bütün yumurtaları Aspire için ağızlık üzerinde monte 0,22 mikron filtre bağlayın. Tüm yumurta toplamak ve art arda gelen geçit tarafından 100 µL M2 orta 6 farklı damla yıkayın.</li>
		<li>Yıkanmış döllenmiş yumurta % 5 CO2 M16 orta atmosferiyle oksijen 37 ° C kuluçka yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. enjeksiyon yapma pipetler
<ol><li>İnce duvarlı cam Kılcal boru (10-15 cm uzunluğunda) bir dış çapı 1 mm ile kullanın ve bu kılcal yatay micropipette çekici kelepçe. Not: en yatay pipet Elcikler içinde 3 parametre ayarlanabilir: ısı enerjisi, Isıtma ve çekerek arasında güç ve zaman gecikme çekerek. Şekil 2Asunulan benzer enjekte pipets elde etmek için bu parametreler ayarlayın. Rutin olarak DNA mikroenjeksiyon gerçekleştiren kullanıcılar için standart ayarları kullanın ve Isıtma ve Pipet Ucu küresel şeklini değiştirmek için çekerek arasında gecikme ayarlayın.</li>
</ol>6. Holding yapma pipetler
<ol><li>Holding pipet hazırlamak için enjekte bir pipet kullanın.</li>
	<li>Enjekte bir pipet bir microforge ekleyin. Pipet ile 80-100 µm çapının keskin bir simetrik ipucu elde etmek için microforge kesti. O zaman ısı ile ucunda keskin hedges bulunmayan bir simetrik yuvarlak şekli elde etmek için microforge Lehçe.</li>
</ol>7. Lentiviral vektör içeren enjeksiyon pipet hazırlanması
<ol><li>160 x g enkaz kez dondurulmuş lentiviral stoklarında mevcut cips 2 min için de lentiviral vektör süspansiyon santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant yeniden elde etmek ve yeni bir 0.5 mL tüp bir sınıf II Emanet kabin içine aktarın.</li>
	<li>1 µL süpernatant, bir mikro-loader kullanarak 5. adımda açıklandığı gibi hazırlanmış bir enjeksiyon pipet aktarın.</li>
	<li>Enjeksiyon pipet doğru micromanipulator araç sahibinin ayarlayın. Holding damlalıklı sol micromanipulator bağlayın. Not: Lentiviral vektör iletim titresi doğrudan kurucusu üretim etkinliği ile ilişkili. Yüksek etkinlik için (> % 70), bir titresi 100 aralığında ile viral vektörleri kullanan p24 kapsid protein/µL ng. Titresi iletim birimi (TU) olarak ifade edilir, titresi 10 olmalıdır9 TU/mL. Lentiviral vektör hisse senetleri 293T hücre p8.91 encapsidation plazmid ile geçici transfection tarafından üretilen gerekir pHCMV-G, vesicular Stomatit virüs (VSV) glikoprotein-G ek yöntemleri18' açıklandığı gibi kodlama.</li>
</ol>8. mikro-enjeksiyon
<ol><li>M2 orta bir depresyon slayt ve kapak merkezinde 8 µL ışık parafin yağı (embriyo test) ile dağıtmak buharlaşma önlemek için.</li>
	<li>Yer 20 yumurta içine damla mümkün olduğunca az dağınık gibi. Dikkat: embriyo yatırırken kabarcıklar yapmayın.</li>
	<li>Enjeksiyon Pipet Ucu açık olduğundan emin olun. Eğer değilse, enjeksiyon pipet holding pipet ile dokunun.</li>
	<li>Microinjector 20 enjeksiyon süre ayarla s. Not: Viral süspansiyon viskozitesi perivitelline uzayda viral vektör dispersiyonu açık görselleştirme sağlar. Enjeksiyon basıncı 20 içinde tüm boşluğu doldurmak için ayarlanması gereken s, 10-100 birim temsil eder enjeksiyon pL. Enjeksiyon basıncı 600 hPa aşmaması gerekir.</li>
	<li>2 pro çekirdeği ve 2 kutup organları ile stereomicroscope altında tutarak pipet içeren bir döllenmiş yumurta Aspire edin.</li>
	<li>Yumurta 8.4, perivitelline alanında tanımlanan ayarları kullanarak microinjector ile enjekte. Uyarı: enjeksiyon damlalıklı ile plazma zarı dokunmayın.</li>
	<li>Tüm döllenmiş yumurta 20 yumurta toplu olarak kullanılabilir enjekte edip enjekte yumurta hemen önceden ısıtılmış M16 ortamda oksijen 37 ° C kuluçka %5 CO2atmosferiyle yerleştirin. Not: enjeksiyon embriyo transferi önce sonra en az 30 dk enjekte yumurtaları kuluçkaya.</li>
</ol>9. B6CBAF1/JRj Pseudopregnant kadın embriyo transfer
<ol><li>Birleşme tak 16 h B6CBAF1/JRj B6CBAF1/JRj vazektomi erkeklerin dişilerle çiftleşme sonra kontrol edin. Bunu sadece yumurta toplama başlamadan önce.</li>
	<li>İmplantasyon pipetler enjekte embriyo için hazırlayın.<ol>
<li>Toplama ve embriyo (adım 4.2) işleme için açıklandığı gibi embriyo implantasyonu pipetler olun. Pipetler dar bir kısmı yaklaşık 4-5 cm yaklaşık 150 µm bir iç çapı ile uzunluğunu seçin. Not: Belgili tanımlık uç, yumurta veya ovidukt olası hasar azaltmak için parlak alev olmalıdır.<ol>
<li>Işık parafin yağı (embriyo test) ile sadece Pipet omuz doldurun.</li>
			<li>Bir küçük hava kabarcığı sonra M2 orta ve son olarak ikinci bir hava kabarcığı Aspire edin.</li>
			<li>Embriyolar tek embriyo ile birlikte ovidukt enjekte orta hacmi en aza indirmek için diğer her arkasında çizin.</li>
			<li>Bir embriyo genişliğini çok az bir damla ışık parafin yağı (embriyo test) yükleyerek bitirmek. Dikkat: pipet taşıma sırasında nazik ol.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyo transferi.<ol>
<li>Tüm aletleri sterilize.</li>
		<li>Çözümün ketamin bas vücut ağırlığının g başına 150 μg ve g Xylazine, vücut ağırlığının başına 0,15 μg içeren steril NaCl %0.9 300 μL mayi bir enjeksiyon kullanarak erkek anestezi.</li>
		<li>Anestezi derinliği hayvanın kuyruk forseps ile pinching tarafından doğrulayın ve subcutaneouly 0.1 mg/kg analjezik (buprenorfin) Başlat yordamı önce enjekte.</li>
		<li>Arkadaki son kaburga düzeyinde spinal kord boyunca her iki tarafında 2 cm tıraş.</li>
		<li>Dişi fare bir Isıtma yastık üzerinde ve steril bir alana yerleştirin. Fare arka ortasında bir 2 cm x 2 cm pencere kesmek.</li>
		<li>Antiseptik bir çözüm (% 10 Povidone iyodür) cilt üzerinde uygulamak ve makas ile 1 cm enine kesi yapmak sonra Yumurtalık (turuncu renk) vücut duvarın içinden görünene kadar cilt yanal parmağınızı kaydırın.</li>
		<li>Dürbün cerrahi mikroskop altında iyi makas ile vücut duvara yumurtalık hemen üzerinde 5 mm kesi olun.</li>
		<li>Kadar yağ yastığı bir atravmatik bulldog kelepçe ile almak ve yumurtalık, ovidukt ve rahim üst çekin.</li>
		<li>Ampulla görselleştirmek ve yumurtalık ampulla için bağlantılar ovidukt kesimindeki kenasen makasla bir hemisection olun.</li>
		<li>Transfer embriyo pipet tanıtmak ve implantasyon pipet ilk hava balonunda durdurma ampulla, içine yumurta teslim.</li>
		<li>İkinci ovidukt yordamı yineleyin.</li>
		<li>Cilt yara klipleri ile kapatın.</li>
		<li>Tam olarak uyanık kadar yer hayvan kurtarma (39 ° C, 30-60 dakika) odası.</li>
		<li>Analjezik enjeksiyon 12 h sonra ve ağrı veya acı belirtileri durumunda 48 h tekrarlayın.</li>
		<li>7-10 gün ameliyat sonrası yara klip kaldırın.</li>
		<li>İmplante kadın gebelik için onların ağırlık eğrisi her 3 günde implantasyonu sonrası durumunu. Önemli kilo alımı 10-12 gün implantasyonu sonrası dikkat edilmesi ve hamilelik için gösterge olacaktır. Not: burada olacak geliştirecek tüm embriyoların sözde transgenik kurucuları temsil ediyor. Bu kurucuları fenotip herhangi bir gelişim aşamalarında veya Doğum göre bilimsel soru transgenik bu hayvanların üretimi için bağlandıktan sonra analiz edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Genotipleme transgenik kurucuları
<ol><li>10 mM Tris-HCl, pH 8 içeren Genotipleme arabellek hazırlamak; 5 mM EDTA, pH %8.0 0,2 SDS (w/v), 50 mM NaCl ile. Genotipleme arabellek 0,22 µm filtreden sterilize ve birkaç ay için oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>(Embriyo için) koymak extraembryonic membranlar veya küçük 500 µL içine (d. hayvanlar için) kuyruk parçası Genotipleme arabellek filtre ve 15 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin. Gecede 55 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>15.000 x g 5 min için de lysate santrifüj kapasitesi ve süpernatant ile 1 µL PCR reaksiyon için kullanın. Lysate 4 ° C'de birkaç ay depolanabilir.</li>
	<li>PCR güçlendirme transgene parçasının içeren 1 x PCR tampon, 1.5 mM MgCl2, dNTPs, her PCR astar 0.2 µM, 1 UI Taq DNA polimeraz ve sindirilir her örneğinin 1 µL 200 µM 20 µL tepki birim içinde gerçekleştirin. Bir negatif kontrol H2O. 1 µL kullanın Pozitif kontrol, DNA transgene içeren lentiviral vektör plazmid kullanın.</li>
	<li>Açıklanan eGFP tespiti için kullanın: eGFP ileri astar: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3' eGFP ters astar: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'</li>
	<li>Bir thermocycler PCR güçlendirme gerçekleştirmek: 94 ° c, 60 ° C'de 1 dk 1 dk 35 döngüleri ardından 94 ° C'de 4 dk ve 72 ° C'de 2 dk</li>
	<li>Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi bir 300 bp eGFP PCR ürünü görselleştirmek için % 2 özel jel PCR ürünü yükleyin. Not: tüm bireylerin 300 bp PCR Wataha gösterilen eGFP transgene entegre etmiş ve transgenics kabul edilebilir.</li>
	<li>Transjenik hayvanlar transgene ifade analiz. Örneğin, histolojik gerçekleştirmek ve immunostaining olarak Şekil 3 ve Şekil 4 resimli ve tamamlayıcı yöntemler açıklanmıştır. Not: Her ikisi de transgene ifade analizi ve fenotip çözümlemesi gerçekleştirilmesi küresel bilimsel soru göre uygun yöntemlerle.</li>
</ol>11. miktar Transgene kopya numarası
<ol><li>DNA örnekleri kantitatif PCR için hazırlayın.<ol>
<li>Adım 10,3 üretici yönergelerine uygun ticari bir seti kullanarak elde genomik DNA (gDNA) lysate İndinavir K dan ayıklayın.</li>
		<li>GDNA tarafından spectrophotometry 260 ölçmek nm.</li>
		<li>Her gDNA örnek 10 ng/µL son konsantrasyonu sulandırmak.</li>
		<li>Her örnek için aşağıdaki konsantrasyonlarda 6 tüpler elde etmek için (1:5) içinde H2O 5 seri dilutions hazırlamak: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0.4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL ve 0.0032 ng/µL</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kantitatif PCR (qPCR) tepki karışımı hazırlayın.<ol>
<li>Astar mix qPCR için hazır olun. Her astar çift qPCR için kullanmak 10 µL ileri astar (100 µM astar stok çözelti), ters astar (100 µM) 10 µL ekleyin ve H2o 80 µL Not: eGFP yükseltmek için ileri TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA ve ters TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG astar kullanın. Cdx2 gen normalleştirici qPCR (genom başına 2 kopya) için kullanılır. İleri GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG ve ters GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT astar Cdx2 normalizer için kullanın</li>
		<li>2 qPCR karışımları, biri eGFP astar karışımı ile ve diğeri Cdx2 astar karışımı hazırlayın. Her gDNA, yineleme içinde dilutions 6 yükseltmek için yeterli qPCR karışımını hazırlayın. Bir qPCR reaksiyon H2O, floresan yeşil 2 reaksiyon mix x 5 µL ve astar Mix 0.2 µL 3.8 µL içerir. Not: transgenik her hayvan için test etmek, 24 qPCR reaksiyonlar gerçekleştirilecek. Reaksiyon karışımı bir 384 iyi qPCR makine için sağlanır.</li>
		<li>Her hayvan test etmek dağıtmak: 12 wells ile 9 µL Cdx2 qPCR karışımı ile eGFP qPCR mix ve 12 kuyu 9 µL. Her gDNA seyreltme 1 µL içeren eGFP qPCR MIX 2 kuyu ve eGFP qPCR içeren 2 kuyu karıştırın.</li>
		<li>Bırak 2 wells için her qPCR hangi gDNA tarafından H2O negatif kontrol olarak değiştirmek oldu karıştırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>384 iyi plaka qPCR makinesinde yerleştirin ve aşağıdaki çalışan iletişim kuralı uygula: 10 min 95 ° c sonra 50 döngüleri 10 / 95 ° C ile 60 ° C'de 1 dk s</li>
	<li>Veri analiz. Test etmek her gDNA için toplam gDNA tutarı (çoğaltmaları 6 puan) günlük bir fonksiyonu olarak Ct değerleri arsa. Doğrusal regresyon ile az kare yöntemi kullanarak eğriyi uydurmak ve karşılık gelen y ekseni ile yakalamayı Ct değeri tahmin. Cdx2 göre eGFP kopya sayısını hesaplamak için eGFP ve normalleştirilmiş Cdx2 ekstrapole Ct değerleri kullanın (2 kopyalar)11Standart 2ΔdCt yöntemi kullanarak.</li>
</ol>

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Lentiviral vektörler döllü yumurta burada açıklanan perivitelline enjeksiyon transgenik embriyo toplam toplanan embriyo sayısına oranla % 70'den fazla vermiştir transgenik embriyo üretimini sonuçlandı. Bu sonuç önceki raporları ile tutarlı olacak ve özgüllük yordam2,7,10,11,12örneğidir. Önemli özellikleri Tablo 1' de sunulan tüm verileri karşı...

Gordon ve ark. öncü çalışmaları 1980 yılında pseudopregnant farelerde implantasyon sonra döllenmiş yumurta plazmid DNA enjeksiyon erkek pronuclei içine entegre transjenik hayvanlar üretimini getirebilecek gösterdi Plazmid DNA1. Transgenik memeliler oluşturulabilir gösteri küresel Yaşam Bilimleri Araştırma temel bilimler ve çevirim Biyomedikal Bilimler için hem de Roman alanlara yol açarak üzerinde çok büyük etkisi vardı. Son dört yıl içinde DNA mikroenjeksiyon rutin bir uygulama haline gelmiştir. Transgenik fareler çok büyük sayıda üretilen rağmen standart yöntem tam olarak tüm fare suşları için kullanılamaz ve zaman alıcı backcrosses2,3gerektirir. Uygulama diğer türler için zorlu4 kalır ve genel transgene tümleştirme verim d. hayvan5birkaç yüzdesine sınırlıdır. Buna ek olarak, transgene tümleştirme etkinliğini pronuclear DNA enjeksiyon zavallı genel verimi açıklayan sınırlayıcı bir faktör temsil eder. Bu açıdan bütünleştirici viral vektörler en verimli araçlar için kargo ve transgenes entegre ve böylece önemli ölçüde entegrasyon verim, bu 10 kb6 aşamaz transgene boyutu olmak tek sınırlama artırmak için yeni araç sağlayabilir .
Lentiviral vektörler ile örtmek protein Vesicular Stomatit virüs (VSV) sözde yazılı pantropic ve son derece bütünleştirici gen transferi araçlardır ve döllenmiş yumurta7transduce için kullanılabilir. Yumurtalar çevreleyen zona pelusida doğal virüs engeldir ve iletim lentiviral vektörler ile izin vermek için geçirilmesi gerekiyor. Transjenik hayvanlar tarafından transducing döllenmiş yumurta mikro delme veya zona pelusida8,9/ kaldırma sonra üretilmedi. Ancak, enjeksiyon perivitelline uzayda zona pelusida altında başlangıçta Lois ve meslektaşları7tarafından tanımlandığı gibi döllenmiş yumurta transduce için en basit yöntem gibi görünüyor.
Perivitelline enjeksiyon lentiviral vektörlerin d. hayvanların % 70 transjenik hayvanlar üretiminde yüksek verim sağlar. Böyle verim standart pronuclei DNA enjeksiyon7,10,11kullanılarak elde edilebilir en iyi verim fazla 10 kat daha yüksektir. Bu bağlamda, en az 50 transgenik kurucuları (F0) enjeksiyonları tek bir oturum oluşturur. Kurucuları çok sayıda, bu nedenle, fenotipleme doğrudan transgenik fare satırları oluşturmak için gerek kalmadan F0 fareler üzerinde gerçekleştirilen transgene etkisi ile uyumludur. Bu avantaj ve in vivo kazanç ve kayıp işlev çalışmaların hafta içinde gerçekleştirmek için özel olarak adapte transgene etkisi hızlı tarama için sağlar. Ayrıca, düzenleyici DNA elemanlarının da hızla arttırıcılar ve transkripsiyon faktörleri11,12' bağlı DNA motifleri eşlemek için taramaya tabi. Pronuclear iğne ile transgenes genellikle benzersiz bir odağı olarak birden çok kopya entegre. Lentiviral vektörler ile tümleştirme, locus10,13başına tek kopya olarak birden çok loci oluşur. Bu nedenle, tümleşik loci çokluğu yeni oluşturulan modeli daha sağlam yapar transgenik kurucuları gözlenen çok yüksek ifade alellerle ilgili olabilir.
Önemlisi, DNA'ın pronuclear enjeksiyon kullanırken, pronuclei görselleştirme işlemi sırasında kesinlikle gereklidir. Bu teknik sınırlama döllenmiş yumurta çok çeşitli fare suşları kaynaklanan kullanımını engeller. Bu nedenle, belirli bir transgenik bir modelde üretim için hangi pronuclei görünmez istenen fare transgene aktarmak için en az 10 ardışık backcrosses ardından izin veren bir yük hayvanlarda üretimini gerektirir zorlanma zorlanma. Lentiviral vektör enjeksiyonları ile perivitelline alanı her zaman görünür ve enjeksiyon çok özel beceri gerektirmez. Örnek olarak, pronuclei enjeksiyon için uygun değildir NOD/SCID transgenik fareler viral vektör enjeksiyonları14ile elde edilmiştir.
Burada, kapsamlı bir protokol transgenik fareler bir hücre sahne embriyo perivitelline uzayda lentiviral vektör enjeksiyonlar kullanarak basit üretim izin için sunulmuştur. İkisinden biri ile kontrollü Transgene ifade her yerde veya hücre belirli Rehberleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
PTrip ΔU3 lentiviral omurga bu çalışma15dakika içinde kullanıldı. Bu vektör içinde U3 sıra kısmen U3 organizatörü etkinliğini kaldırmak ve kendi kendine inactivating bir vektör (günah)16oluşturmak için silinene kadar çoğaltma arızalı lentiviral vektörler üretmek için izin verir. Lentiviral vektör stokları HEK-293T hücre p8.91 kapsülleme plazmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G vesicular Stomatit virüs (VSV) glikoprotein-G17ve pTRIP ΔU3 kodlama ile geçici transfection tarafından üretildi Rekombinant vektör. Detaylı üretim yordamı tamamlayıcı yöntemler sağlanır.
Üretim yüksek titresi lentiviral vektör stoklarının Biyogüvenlik seviye II koşullarda (BSL-2) gerçekleştirilir. Bu BSL-3'te üretilmiş olmalıdır oncogenes dışında çoğu transgenes için geçerlidir. Bu nedenle, üretim BSL-2 koşullarda çoğu için yeterlidir. Buna ek olarak, kullanım ve üretim genellikle çoğu ulusal düzenleyici kurumlar genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) ile başa çıkmak için kesilir. Çoğaltma beceriksiz günah lentiviral vektörler (aşağıda 2 µg p24 kapsid protein) sınırlı miktarda Fransızca GDO Ajansı ile anlaşma Avrupa Birliği'nin önerileri tarafından açıklandığı gibi BSL-1 koşullar altında kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petri kabı</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu Nunc çanak</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>Tüp bebek çanağı</td></tr><tr><td>M2 orta</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 orta</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 ve mikro; m Şırınga filtresi</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz Enzimi 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>fare embriyosu test edildi</td></tr><tr><td>İnsülin seringi</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Kavisli forseps</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli makas</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş mikrokılcal pipetler için aspiratör borusu tertibatları</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Harvard aparatı</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Yatay mikropipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Hoffman modülasyonu kontrast aydınlatması gereklidir</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram hava</td><td></td></tr><tr><td>Tutma pipeti kontrolcüsü</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>fare embriyosu test edildi</td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>DNA veya viral vektörleri enjekte etmek için kullanılabilir</td></tr><tr><td>Dumont # 5 forseps</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas mikro makas</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>santrifüj</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET %100 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>santrifüj</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iyodür</td><td>santrifüj</td><td>VET001</td><td>vetedine 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>santrifüjü</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Trizma hidroklorür</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>toz</td></tr><tr><td>proteinaz K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kiti</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 PCR tüpü</td><td>şeridi 4titude 4ti-0781</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu termal döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomik DNA mini kiti</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master karışımı</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Yeşil&nbsp;</td></tr><tr><td>Çok kuyulu plaka 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR cihazı 384 kuyulu</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Yaklaşık 40 yıldır, pronuclear DNA enjeksiyon transgenes rasgele entegrasyonu ile transgenik fareler oluşturmak için standart yöntem temsil eder. Rutin bir işlem tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır ve kurucusu hayvanlar bir düşük verim içinde kaynaklanan transgene tümleştirme, zavallı etkinliği, onun ana sınırlama bulunur. Sadece birkaç yüzde enjekte döllenmiş yumurta implantasyonu sonra doğan hayvanların transgene entegre etmiş. Buna ek olarak, lentiviral vektörler bütünleştirici gen transferi için güçlü araçlar ve kullanımları döllenmiş yumurta transduce kurucusu yüksek verimli üretim % 70 üzerinde bir ortalama verim ile transgenik fareler sağlar. Ayrıca, herhangi bir fare zorlanma transgenik hayvan üretmek için kullanılabilir ve alellerle transgene ifade son derece yüksek, DNA mikroenjeksiyon karşılaştırıldığında lentiviral aracılı transgenesis ile % 80'i yukarıda. Kargo lentiviral vektör tarafından olabilir DNA parçasının boyutunu 10 kb ile sınırlı ve bu yöntemin büyük sınırlama temsil eder. Basit ve kolay enjeksiyon yordamı döllenmiş yumurta zona pelusida altında gerçekleştirmek kullanarak, 50'den fazla kurucusu hayvanlar mikroenjeksiyon tek bir oturumda üretilebilir. Böyle bir yöntem, doğrudan kurucusu hayvanlar, hızlı kazanç ve kayıp işlev çalışmaların veya ekran genomik DNA bölgeleri kontrol eden ve düzenleyen gen ifade içinde vivoyeteneklerini için gerçekleştirmek için son derece adapte.

Transjenik hayvanlar burada sunulan protokolü kullanılarak oluşturuldu. Temsilcisi her ikisi de her yerde karşımıza çıkan sonuçlar ve hücre türü belirli transgene ifade gösterilmiştir.
Transgenes kurucu ifade
Her yerde Rehberleri transgenes sürekli ve etkin bir şekilde ifade etmek için temel araştırma araçlardır. Böyle Organizatör için bir çok büyük de...

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Bu yöntem farelerde hızlı in vivo tarama sağlar, bir transgen etkisi, ve özellikle kazanç veya fonksiyon çalışmaları kaybı gerçekleştirmek için uyarlanmıştır, yanı sıra bir cevap ve DNA güdü haritalama. Bu tekniğin en büyük avantajı, transgenik hayvanların tahmini kullanımının yenidoğanın %70'inin üzerinde olması ve transgenik hayvanlar da dahil olmak üzere her türlü fare suşlarına uygulanabiliyor olmasıdır. Fareler ötenazi sonra, oviducts toplamak.Ameliyata başlamak için, karın boşluğuna büyük bir yatay kesi yapmak için makas kullanın. Sonra, rahim ve yumurtalık arasında oviduct bulmak. Daha sonra, belirgin kan damarları ile mesometrium ve membran kaldırmak için kavisli forceps kullanın.Daha sonra oviduct'ı yumurtalıktan ayırın ve yumurtalıkları yumurtalıktan ayırın. Sonra, oviduct üzerinde römorkör ve rahim kesip. Toplanan tüm oviduct'ları oda sıcaklığında M2 ortamına aktarın.Oviducts kullanırken, döllenmiş yumurta yüklü şişmiş ampulla dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun. Daha sonra, 10 santimetrelik bir tabağa 100 mikrolitrelik bir damla hyaluronidase çalışma çözeltisi ekleyin. Daha sonra yumurtaküm hücrelerini çıkarmak için içine iki oviducts aktarın.Stereomikroskop altında, ampulla yırtılma ve döllenmiş yumurta dağıtma sırasında oviduct güvenli bir çift insülin şırınga kullanın. Sonra, tüm yumurta aspire etmek için tüp ve ağızlık ile hazırlanmış bir cam pipet kullanın. Bu aracı kullanarak, çevredeki kümülüs hücrelerini yıkamak için m2 orta altı damla arasında aktarın.Daha sonra, yıkanmış yumurtaları 10 milimetrelik bir kuyuya, önceden M16 ile ısıtılmış dört kuyu tabağına aktarın. Daha sonra, bir nemlendirilmiş 37 derece santigrat inkübatör için çanak aktarın. Hazırlık olarak, iki dakika için 160 g hazırlanan lentiviral vektör süspansiyon santrifüj, genellikle lentiviral stok mevcut enkaz pelet.İkinci sınıf bir güvenlik kabininde, süpernatantları yeni bir 0,5 mililitrelik tüpe aktarın. Sonra, bir enjeksiyon pipet içine supernatant bir mikrolitre yükleyin. Daha sonra enjeksiyon pipetini sağ taraftaki mikromanipülatöre takın.Ve tutucu pipeti sol taraftaki mikromanipülatöre takın. Şimdi, depresyon slayt merkezinde M2 orta sekiz mikrolitre dağıtmak. Ve buharlaşmayı önlemek için hafif parafin yağı ile kaplayın.Sonra, kabarcıklar oluşturmadan damla sığ yerlere 20 yumurta yerleştirin. Daha sonra, enjeksiyon pipetucu ucu açık olduğundan emin olun. Değilse, açmak için tutma pipet ile enjeksiyon pipet dokunun.Sonra, 20 saniyelik enjeksiyonlar için mikroenjektör ayarlayın. Şimdi, tutma pipetve manuel basınç kullanarak iki pronüklei ve iki kutup cismi içeren döllenmiş bir yumurtaaspire. Sonra, enjeksiyon pipet kullanarak yumurta perivitelline alan enjekte.Plazma zarına dokunmayın. Basıncı, perivitelline alanının çözeltiyle dolması için ayarlayın. Basınç 600 hecto pascal'ı geçmemelidir.Hemen 20 yumurta enjekte ettikten sonra, önceden ısıtılmış M16 orta bir banyo içine toplu aktarın. Ve yerleştirmeden önce en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Normal dişileri vazektomili erkeklere çiftleştirdikten 16 saat sonra çiftleşme fişleri kontrol edin.Bu dişileri implantasyon için kullan. Daha sonra, yaklaşık 150 mikron iç çapı ile implantasyon pipetler olun. Ve yaklaşık 4-5 milimetre uzunluğunda alev cilalı ipuçları ile.Embriyo test ile bir pipet yükleyin, omuz noktasının hemen üzerinde hafif parafin yağı. Daha sonra, küçük bir hava kabarcığı aspire ve daha fazla M2 orta ile pipet yükleyin. Sonra, ikinci bir hava kabarcığı aspire.Şimdi, embriyoları birbirinin arkasındaki pipete yerleştirin, embriyolar arasındaki ortamın hacmini en aza indirin. Bitirmek, parafin yağı çok küçük bir damla sadece bir embriyo genişliğinde aspire ederek. Reimplantasyon pipetinin hazırlanması çok önemlidir ve çok fazla pratik yapılması gerekir.Pipetteki yumurtalar aralarında neredeyse hiç orta olmayan bir şekilde hizalanmalıdır. Sonra, fare anestezi ve son kaburga düzeyinde omurilik boyunca saç iki santimetre şeritler kapalı iki, iki santimetre saç shave kapalı bir parmak çimdik tıraş ile anestezi doğruladıktan sonra. Şimdi, fareyi steril bir alana bir ısıtma yastığına yerleştirin ve açıkta kalan cilde bir pencere bırakarak onu örtün.Daha sonra, iodoprovidone ve yüzde 70 etanol alternatif scrubs ile maruz kalan cilt dezenfekte. İmplantasyon için, önce bir santimetre lik enine kesi yapın ve sonra turuncu renkli yumurtalık vücut duvarından görünene kadar cildi yanal olarak kaydırın. Sonra, ince makas ile beş milimetrelik bir kesi yapmak ve atravmatik bulldog kelepçe ile yağ yastığı almak.Bir kez yastık kavradı, yumurtalık çekin, oviduct ve rahim üst. Daha sonra, ampulla bulmak ve vannas makas ile bir hemisection yapmak, ampulla yumurtalık bağlayan oviduct segmentinde. Sonra, transfer embriyo pipet tanıtmak ve yumurta fırlatmak.Yumurtalar serbest bırakıldıktan sonra ilk hava kabarcığında durmak. İkinci oviduct üzerinde prosedürü tekrarlamak için gerekli malzemeleri hazırlayın. Ve tamamlandığında, yara klipleri ile deri kapatın.Deriyi kapattıktan hemen sonra, intraperitonealy analjezik enjekte ve 39 derece Santigrat ısıtma elemanı ile kurtarma odasına hayvan yerleştirin. Tamamen uyanana kadar izleyin. Transgenik hayvan sunulan yöntem kullanılarak üretildi.Yüksek bir titer lentiviral vektörler eGFP sürücü Neurogenin-3 için 2.3 kilo baz arttırıcı kullanılarak üretildi. Ya da kontrol olarak, eGFP'yi sürmek için kromozom altının bir parçası. Embriyolara entegrasyon oldukça başarılı oldu.Embriyolardan, pankreas tomurcuk kesitli ve immünostained eGFP lokalize ifade aramak için. Vektörlerin yüzde 90'ından fazla, Neurogenin-3 arttırıcı ile, Neurog3 ifade hücreleri eGFP ifade. Ancak, entegre kontrol vektörleri hiçbiri pankreas tomurcuk eGFP ifade.Transgen entegrasyon bölgeleri, CDX2 geni kontrol olarak kullanılarak kantitatif PCR tarafından değerlendirildi. Entegrasyon sitelerinin ortalama sayısı yaklaşık 20 Neurogenin-3 yapı, ya da 10 kontrol yapısı kullanılarak. İlginçtir, Nörogenin-3 yapısı için kullanılan viral transdüksiyon titre, kontrol vektörünün yaklaşık iki katıydı.Transdüksiyon titreci ile tümleştirme sayısı arasında bir ilişki olduğunu düşündürüyor. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek etkinliği ile lentiviral vektörlerin perivitellin enjeksiyonu kullanarak kurucu transgenik embriyoların çok sayıda oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bir kez hakim, bu teknik mikroenjeksiyon tek bir gün içinde 50 kurucu hayvanlar üretebilir, düzgün yapılırsa.Bu işlemden sonra transgenik fare hatları oluşturmak için titer pronükleer DNA enjeksiyonu gibi başka yöntemler de yapılabilir. Lentiviral vektörlerle çalışmanın yerel GDO komitenizden gelen yetkiye tabi olduğunu unutmayın. Bu vektörler son derece tehlikeli olabilir ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman önlem alınmalıdır.

lentiviral-mediated-production-transgenic-mice-simple-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Bu video, lentiviral vektörlerin döllenmiş bir fare embriyosunun perivitellin boşluğuna pronükleer enjeksiyonunu açıklar. Lentivirüs, döllenmiş embriyonun genomuna dahil edilen ve sonunda transgenik farelere yol açan transgeni içerir.

Lentiviral Vektör Bazlı Perivitellin Enjeksiyonu: İlgilenilen Geni Döllenmiş Tek Hücreli Fare Oositlerine Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Bu video, in vivo çalışmalar için medial ganglionik üstünlük (MGE) hücrelerinin viral etiketlenmesini ve transplantasyonunu göstermektedir. MGE hücrelerinin bir viral raportör ile transdüksiyonu, bu transdüksiyonlu hücrelerin bir fare yavrusunun korteksine nakledilmesi ve belirli internöron alt tiplerinde muhabir ekspresyonunun etkinleştirilmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

İn Vivo Çalışmalar için Medial Ganglionik Eminence Hücrelerinin Viral Aracılı Etiketlenmesi ve Transplantasyonu

MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet...

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Döllenmiş yumurta fare ve erken sahne embriyolar zona pelusida, gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Bu makalede, zona lentiviral vektörler ile embriyonik hücreler transduce ve transgenik fareler oluşturmak için bir lazer ile perfore için bir iletişim kuralı.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Bu makalede, zigot perivitellin uzaya bir virüs süspansiyon birden fazla enjeksiyon kullanarak sıçan embriyolarında lentiviral transgenez için metodoloji sağlamayı amaçlamaktadır. Farklı bir baskın kürk rengi ile doğurgan bir erkek zorlanma ile çiftleştirilmiş dişi sıçanlar sözde hamile koruyucu anneler oluşturmak için kullanılır.

Lentiviral Vektör Yaklaşımı Kullanarak Transgenik Sıçanların Üretimi

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Öğrenin, lentiviral vektör enjeksiyonu ile transgenik fare üretimini. Perivitelin boşluğuna yapılan bu basit yöntem, yüzde yetmişin üzerinde başarı sağlar ve gen fonksiyonu çalışmalarını hızlandırır.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Daha fazla video keşfet