Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

Bu protokolün genel amacı, embriyodaki karmaşık gelişimsel yolların derinlemesine incelenmesini sağlamak için in vitro ortamda embriyonik tavuk gözlerine erişim sağlamaktır. Embriyonik tavukta, göz kapağı gelişimi, embriyo hareketi ve ekstra embriyonik dokuların büyümesi nedeniyle gözü incelemek genellikle zordur. İlaçlar ve inhibitörler gibi bileşikler de embriyo üzerinde öldürücü etkilere sahip olabilir ve bu bileşiklerin gen yollarını modüle etmek için kullanılmasını zorlaştırır.

İn vitro doku kültüründeki gelişmeler, bilim adamlarının bu dokuları izole etmesine ve yukarıda belirtilen engellerin çoğunu ortadan kaldırmasına izin vermiştir. Protokolümüz, nöral retina ve retina pigmentli epitel gibi gelişim sırasında etkileşime girme potansiyeline sahip tüm dokular dahil olmak üzere gözü bir bütün olarak incelememize izin vermesi açısından avantajlıdır. İşlemden önce tüm solüsyonların ve ekipmanın steril olduğundan emin olmak için malzemeleri otoklavlayarak başlayın.

Bunu yapmak için, iki litre damıtılmış su ve bir litre civciv salini, bir kutu mendil, yarı gözenekli filtre kağıdı, tel örgü, su kapları ve tek kullanımlık cam pipetlerle birlikte otoklavlayın. Kuluçka makinesi raflarını ve kapısını %70 etanol kullanarak iyice sterilize edin, ardından kapları otoklavlanmış, damıtılmış suyla doldurun ve kuluçka makinesini 37 santigrat dereceye ısıtın. Kuluçka makinesinde bir antibiyotik penisilin streptomisin tüpü ile birlikte besin ortamını önceden ısıtın.

Çalışma alanına bir kağıt havlu serin ve %70 etanol ile sterilize edin. Tüm forseps ve makasları sterilize edin. Tavuk kafası otoklavlanmış civciv tuzlu su içindeyken, civciv kafasını orta hatta ikiye bölün ve her bir gözün etrafında bir miktar doku bırakın.

Ekstra doku, gözün kültürde bir miktar gerginliği korumasına yardımcı olmanın yanı sıra, göz boyunca besin alımına yardımcı olacak ve gözün filtre kağıdından kaymasını önleyecektir. Bu dokular aynı zamanda daha sonraki analizlerde gözü yönlendirirken yer işaretleri olarak da işlev görür. Kültürü hazırlarken disseke edilmiş dokuyu oda sıcaklığındaki civciv tuzlu su içinde bırakın.

Kültür kabını hazırlayın. İki adet 35 milimetrelik Petri kabını bir adet 100 milimetrelik Petri kabının içine yerleştirin. Her küçük tabağa bir tel örgü aşaması yerleştirin.

Gözün kağıttan kaymamasını sağlamak için hafifçe eğerek, yarım kafayı gözle birlikte bir parça filtre kağıdına yerleştirin. Kağıt mendil ve filtre kağıdını tel örgü aşamasının üstündeki küçük Petri kabına aktarın. Aynı embriyonun diğer yarım başı ile tekrarlayın.

İki küçük Petri kabının her birine kültür ortamı ekleyin. Ortamı kağıt mendil seviyesine getirin. Dokuyu ortama batırmayın.

Bakteriyel enfeksiyonu önlemek için her tabaktaki besin ortamına 50 mikrolitre antibiyotik penisilin streptomisin stok çözeltisi ekleyin. Daha büyük Petri kabının iç kenarına katlanmış bir ince doku parçası yerleştirin ve damıtılmış suyla nemlendirin. Kültürü karanlık inkübatörde 37 santigrat derecede dört güne kadar inkübe edin.

Kültürlemeyi takiben, dokuyu filtre kağıdından çıkarın ve% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. İlk sütun, kültürün başlangıcındaki embriyonik civciv gözünü temsil eden bir HH34 gözünü göstermektedir. İkinci sütun, HH34'ten başlayarak dört gün boyunca kültürlenen embriyonik bir civciv gözünü göstermektedir.

Üçüncü sütun, HH34'ün ötesinde dört günlük in-ovo gelişime karşılık gelen bir HH38 gözünü gösterir. A'dan F'ye kadar olan paneller boyanmazken, G'den I'ye kadar olan paneller alkalin fosfataz enzimi için boyanır. En üst sıra, A'dan C'ye kadar olan paneller, tüy tomurcuklarının ortaya çıkması ve her panelde oklarla gösterilen göz kapaklarının büyümesi ile kanıtlanan gözün kültür boyunca gelişmeye devam ettiğini gösterir.

Orta sıra, D'den F'ye kadar olan paneller, konjonktival papillaların kültürde dejenere olmaya başladığını gösterir. Alt sıra, G'den I'e kadar olan paneller, skleral kemikçik indüksiyonunun uzay-zamansal modelinin kültürde korunduğunu ve bu yöntem kullanılarak incelenebilecek gelişimsel bir yolun bir örneği olarak hizmet ettiğini göstermektedir. Bu protokol, dokuların kültürün tamamı boyunca gelişimin temel uzamsal ve zamansal yönlerini korumasına izin verir.

Bu protokol, tüm duyu organlarının kültürlenmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve ilgili karmaşık gelişimsel yolları incelemek için alternatif bir metodoloji sağlar.