Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Bu yöntem, nörobilim araştırmalarında, nöro popülasyonu karakterize etmek veya iletim sistemlerinin kaynaklarını ve hedeflerini belirlemek gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hücreden önceden seçilmiş bir gen kümesinin ekspresyon profilini hızlı ve kolay bir şekilde belirlemeye izin vermesidir. Dolayısıyla bu yöntem, rastgele çeşitlilik faresi hakkında fikir verebilir.

Astrositler gibi diğer hücre tiplerine ve birçok hayvan modelinde de uygulanabilir. Bu yöntemin bu gösterimi kritiktir, çünkü tutuklama ve heves etme adımlarının öğrenilmesi zor olabilir, çünkü verilerin analiz edilmesi için bir miktar sitoplazmaya ihtiyaç vardır. Bölümlere ayırmadan önce, cerrahi makas, ince iris makası, iki spatula, forseps, bir kağıt filtre diski ve siyanoakrilat yapıştırıcı içeren bir diseksiyon kiti hazırlayın.

Daha sonra buz gibi kesme solüsyonunu karbogyn ile doyurun ve kesme odasını eksi 20 santigrat derecede soğutun. Sonra, hayvanın kafa derisini çıkarın ve kafatasını açın. Beyni dikkatlice çıkarın ve karbojene buz gibi kesme solüsyonu ile doldurulmuş küçük bir behere yerleştirin.

Daha sonra kesme haznesini eksi 20 santigrat dereceden çıkarın ve nemi bir kağıt havluyla alın. İlgilenilen bölgeyi izole etmek için beyni dikkatlice inceleyin. Kesme haznesine yapıştırın ve karbonaboje, buz gibi soğuk kesme solüsyonunu ekleyin.

Bir vibraton kullanarak, 300 mikrometre kalınlığında dilimler kesin. Dilimleri oda sıcaklığında oksijenli kesme solüsyonu ile doldurulmuş bir dinlenme odasına aktarın ve en az 30 dakika iyileşmelerine izin verin. Tek hücreli RT-PCR ve hedeflenen hücre karakterizasyonu için, mRNAz'ı korumak için tüm hücre kaydını 20 dakikadan fazla olmayacak şekilde sınırlayın.

Kaydın sonunda, iki mikrolitre 5xRT karışımı ve 0,5 mikrolitre 20xDTT ile doldurulmuş 500 mikrolitrelik bir PCR tüpü hazırlayın. Döndürün ve buz üzerinde saklayın. Daha sonra hafif bir negatif basınç uygulayarak hücrenin sitoplazmasını hasat edin.

Sıkı bir sızdırmazlık sağlarken hücre içeriğinin pipete girmesini izleyin ve kontrol edin ve bazı genler göz önüne alındığında çekirdeği toplamaktan kaçının. Gen söz konusu olduğunda, çekirdeğin toplanmasını önlemek ve genel kontaminasyona hazırlanmak için gDNA'yı amplifiye etmeyi amaçlayan bir dizi primer dahil etmek önemlidir. Çekirdek pipetin ucuna yaklaşıyorsa, negatif basıncı serbest bırakın ve pipeti uzaklaştırın.

Sıkı sızdırmazlığın korunduğundan emin olun ve sitoplazmanın toplanmasını yeni pipet konumunda yeniden başlatın. Ardından, hücre dışı kalıntıların neden olduğu kontaminasyonu sınırlamak ve sonraki histo-kimyasal analiz için hücre zarının kapanmasını desteklemek için dıştan bir yama oluşturmak üzere pipeti nazikçe geri çekin. Yumruların, mikro manipülatörlerin, bilgisayar klavyesinin veya bilgisayar faresinin proton yüklü rnaz kontaminasyonu kaynakları olduğunu unutmayın.

Kayıt sırasında dokunulmuşlarsa eldivenleri değiştirin. Daha sonra, pipeti dışarı atana takın ve pozitif basınç uygulayarak içeriğini PCR tüpüne boşaltın. İçeriğinin toplanmasına yardımcı olmak için pipetin ucunu PCR tüpüne kırın.

Daha sonra, tüpü kısaca santrifüjleyin, 0.5 mikrolitre RNAse inhibitörü ve 0.5 mikrolitre RTAse ekleyin. Yavaşça karıştırın, tekrar santrifüjleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpü döndürün ve birkaç aya kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

PCR analizine ve ilk amplikasyon adımının gerçekleştirilmesine kadar. PCR'yi doğrulamak için, bir primer çiftini karıştırın ve seyreltin, tek hücreli RTPCR'ye ayrılmış pipetle bir mikromolar ekleyin. Termo döngüleyiciyi 95 santigrat derecede üç dakikaya ayarlayın, 40 döngü çalıştırın ve ardından beş dakika boyunca 72 santigrat derecede son bir uzama adımı izleyin.

Primer dimer oluşumunu en aza indirmek için, PCR tüplerini 95 santigrat derecede önceden ısıtılmış termo döngüleyiciye yerleştirerek sıcak bir başlatma gerçekleştirin. 30 saniye sonra, 20 mikrolitre astar karışımını yağın üzerine hızlıca boşaltın. Primer çifti doğrulandıktan sonra, multipleks protokolü ile test edin.

Dış astarı bir mikromolar ile karıştırın ve seyreltin. Multipleks astar karışımını eksi 20 santigrat derecede birkaç haftaya kadar saklayın. Ardından, bir ön karışım hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin.

PCR tüpünü hafifçe vurun ve döndürün ve iki damla mineral yağ ekleyin. 95 santigrat derecede üç dakika sonra 20 PCR döngüsü çalıştırın. 20 mikrolitre multipleks astar karışımı ile tarif edildiği gibi sıcak bir başlangıç yapın.

Ardından, analiz edilen gen sayısına benzer bir dizi PCR tüpü hazırlayın. Şablon olarak gen başına ilk PCR ürününün bir mikrolitresini kullanarak bir ön karışım hazırlayın. Tüm hacimleri analiz edilecek gen sayısına göre ayarlayın ve pipetleme hatalarını telafi etmek için ekstra hacmin %10'unu kullanmayı düşünün.

Hafifçe çalkalayın, tüpü döndürün ve her bir PCR tüpüne 80 mikrolitre premiks gönderin. Duvara veya tüplerin kapağına dokunmadan tüp başına iki damla mineral yağ ekleyin. 35 PCR döngüsü çalıştırın, ardından 20 mikrolitre dahili astar karışımını dışarı atarak sıcak bir başlangıç gerçekleştirin.

İkinci PCR projelerini aragoz jel elektroforezi ile analiz edin. Beşinci katman piramidal nöron, büyük soma ve belirgin bir apikal dendrit ile görsel olarak tanımlandı. Çekme hücresi kaydı, düşük giriş direncine, uzun süreli aksiyon potansiyellerine ve belirgin başak frekansı adaptasyonuna sahip beşinci katman düzenli sivri nöronların tipik elektro-fizyolojik özelliklerini ortaya çıkardı.

Bu nöronun moleküler analizi, glutamiterjik fenotipini doğrulayan vGluT1'in ekspresyonunu ortaya çıkardı. Bu nöron ayrıca somatostatin ve ATP1-alfa-1 ve sodyum-potasyum ATPA'ların üç alt birimini de eksprese etti. Kaydedilen nöronların biyosit etiketlemesi, piramidal bir morfolojiyi doğruladı.

Glutamiterjik nöronlardan beklendiği gibi, 26 katman-beş piramidal hücrenin moleküler analizi, vGluT1'in ekspresyonunu ortaya çıkardı, ancak iki GAD'nin hiçbirini ortaya çıkarmadı. Bir kez teknik, uygun şekilde hazırlanmışsa iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kontaminasyonları önlemek için çok dikkatli olmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, sitoplazma toplama, ters transkripsiyon ve sıcak başlangıçlı PCR'lerden sonra, beyin dilimlerine göre yama kümeleri ile karakterize edilen tek hücrelerden aynı anda 10'larca genin ekspresyonunu nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.