Name: Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin tek hücreli çoklu RT-PCR yöntemini yama-kelepçe kayıtları sonrası sinirbilim araştırmaları için. Bu teknik, bireysel hücrelerden gen ifadesi profillerini analiz ederek nöron çeşitliliğini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr Alexandre Mourot el yazması üzerine onun yorum için teşekkür. Bu eser Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; gelen hibe tarafından desteklenmiştir ANR-15-CE16-0010 ve ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation pour la Recherche sur Alzheimer bursu tarafından desteklenmektedir. IBPS (Paris, Fransa) hayvan tesisi teşekkür ediyoruz.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Tek hücre multiplex RT-PCR electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla genlerin ifade aynı anda ve güvenilir bir şekilde yama-kelepçe yoklama sonra. Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz yüksek verimli PCR astar gerektirir. En sınırlayıcı adımlardan biri hücrenin içerik topluluğudur. Verimlilik hücre boyutu eşleştirme sırasında mümkün olduğu kadar büyük olmalıdır yama pipet ucu çapı göre değişir. Pipetler 1-2 µm açık uç çapı en nöronal türleri için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Yal...

Serebral korteks çok sayıda hücre tipleri çeşitli fizyolojik süreçlerinde yer oluşmaktadır. Kendi kimlik ve karakterizasyonu, özel işlevleriyle, anlayış için bir ön koşul kortikal hücre tip1 karakterize büyük morfolojik, fizyolojik ve moleküler çeşitliliği göz önüne alındığında çok zor olabilir ,2,3,4.
Tek hücreli multiplex RT-PCR yama-kelepçe ve RT-PCR teknikleri kombinasyonuna dayanmaktadır. Aynı anda electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla önceden tanımlanmış genlerin ifade sonda. Histochemical vahiy6,7,8,9, sonra kaydedilen hücrelerin karakterizasyonu morfolojik dahil edilmesi daha fazla kayıt pipet nöronal bir izleyici sağlar 10. onların fenotipik özellikleri5,9,10,11,12 çok değişkenli analize dayalı nöronal türleri sınıflandırılması için çok kullanışlı bir yöntemdir ,13,14. Tek hücre multiplex RT-PCR da astrocytes15,16,17gibi sigara nöronal hücrelerin karakterizasyonu için uygundur ve hemen hemen her beyin yapısı-18uygulanabilir, onlar bütün hücreli yapılandırmada kaydedilebilir varsayarak 19,20,21,22,23 ve hücre tipi.
Bu teknik çok hücresel kaynakları tanımlaması ve/veya iletim sistemleri7,8,15,16,20,21hedefleri için uygundur, özellikle belirli antikor eksik zaman 24,25,26,27,28,. Bu yama-kelepçe kayıtları görsel olarak tanımlanan hücreleri29kullanır ve böylece aynı zamanda hücreleri belirli hücresel ortamı8,15,16hedefleme sağlar. Beyin dokusu cytoarchitecture beyin dilimler halinde korunmuş olduğundan, Ayrıca bu yaklaşım da anatomik ilişkileri nöronal ve nöronal elements7,8 ile karakterize hücrelerinin çalışma sağlar , 18.
Bu tekniği hasat sitoplazma miktarı ve RT verimliliğini tarafından sınırlı olduğu için düşük kopya sayısı ifade mRNA tespiti zor olabilir. Yüksek üretilen iş pahalı sıralayıcılar ihtiyaçları ille RNaseq teknolojisine dayalı diğer yaklaşımlar tek hücreleri3,4,30,31, Bütün transcriptome analiz etmek için izin rağmen Her laboratuvar için kullanılabilir. Tek hücre multiplex RT-PCR tekniği son nokta PCR kullandığından, yalnızca yaygın olarak kullanılan thermocyclers gerektirir. Bu kolayca elektrofizyolojik set-up ile donatılmış laboratuarlarında geliştirilen ve pahalı ekipman gerektirmez. O, bir gün içinde bir kalitatif analiz genler önceden tanımlanmış bir dizi ifade sağlayabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım hızlı bir şekilde tek hücreleri moleküler karakterizasyonu kolay bir erişim sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Astar tasarımı için çoklu hizalama</td></tr><tr><td>Ditiyotreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Rastgele primerler</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>28-4065-52</td><td>RT ve PCR</td></tr><tr><td>RNasin Ribonükleaz İnhibitörleri</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkriptaz</td><td>İnvitrojen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>RT Taq DNA Polimeraz</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mineral Yağ</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR primerleri</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / tuzdan arındırılmış ve 200 &° C'de seyreltilmiş; M</td></tr><tr><td>Tüpler, 0,5 mL, düz kapaklı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT ve PCR</td></tr><tr><td>BT10 Serisi - 10 & L Filtre</td><td>Ucu Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT ve PCR</td></tr><tr><td>BT20 Serisi - 20 & mikro; L Filtre</td><td>Ucu Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT ve PCR</td></tr><tr><td>BT200 Serisi - 200 & mikro; L Filtre Ucu</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT ve PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Serisi - 1000 & mikro; L Filtre Ucu</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT ve PCR</td></tr><tr><td>DNA Termal Silindir</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Etidyum Bromür</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>E1510-10ML</td><td>Agaroz jel elektroforezi</td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA tamponu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>T4415-1L</td><td>Agaroz jel elektroforezi</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16500-500</td><td>Agaroz jel elektroforezi</td></tr> <tr><td>ve Phi; X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Agaroz jel elektroforezi</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak Agaroz</td><td></td><td>jel elektroforezi</td></tr><tr><td>Elektroforez Güç kaynağı EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Agaroz jel elektroforezi</td></tr><tr><td>Midi Yatay Elektroforez Ünitesi Modeli SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Agaroz jel elektroforezi</td></tr><tr><td>Saten görünümlü pürüzsüz kağıt</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Yama kelepçesi iç çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Yama kelepçesi iç çözeltisi</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime;-tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>E3889</td><td>Yama kelepçesi iç çözümü</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Yama kelepçesi iç çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum D-glukonat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Yama kelepçesi iç çözeltisi</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Yama kelepçesi iç çözümü</td></tr><tr><td>5500 Buhar Basıncı Ozmometresi</td><td>Wescor</td><td></td><td>Yama kelepçesi iç çözümü</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Yama kelepçesi iç çözeltisi</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Kinürenik asit</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Dilim hazırlama</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Yama Kelepçesi kurulum temizliği</td></tr><tr><td>İnce Duvar Camı Filamentli</td> <td>kılcal damarlarDünya Hassas Aletler</td><td>TW150F-4</td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>Eppendorf Mikro Yükleyici</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>BX51WI Dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD S/B VİDEO KAMERA</td><td>Sony</td><td></td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 yazılım paketi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Yama Kelepçesi</td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td></td></tr><tr><td>Düz Gövdeli E Serisi Çıkarma (Tutucu)</td> <td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Sodyum</td></tr><tr><td>fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr><tr><td>Soğuk su balık derisinden</td> <td>jelatinSigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histokimyasal vahiy</td></tr></tbody></table>

tek hücre multiplex ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Serebral korteks çeşitli morfolojik, fizyolojik ve moleküler özellikler sergileyen çok sayıda hücre türleri oluşur. Bu hücre türleri, özel işlevleriyle çalışmak için Önkoşullar malzemelerin kolay tanımlanması ve bu çeşitliliği engellemektedir. Bu makalede, sonra yama-kelepçe dilimler halinde kayıt aynı anda onlarca genlerin ifade tek bir hücreye algılamak için sağlar multiplex tek hücre Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) protokolünü açıklar. Bu basit yöntem ile morfolojik karakterizasyonu uygulanabilir ve kan damarlarının çevresinde gibi çeşitli hücre tiplerinin ve belirli hücresel çevreleri, fenotipik özellikleri belirlemek için yaygın olarak uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bir hücre hasat ve ters yama-klemp tekniği ile uyarlamak sitoplazmik içeriğini kaydetmek için ve niteliksel algılamaya genler tarafından önceden tanımlanmış bir dizi ifade multiplex PCR ilkedir. PCR astar ve hücre içi yama-kelepçe çözüm RT-PCR ile uyumlu dikkatli bir tasarım gerektirir. Seçici ve güvenilir transkript sağlamak için algılama, bu teknik aynı zamanda sitoplazma amplifikasyon merdiven-e doğru hasat uygun denetimlerinin gerektirir. Burada tartışılan önlemler kesinlikle takip edilmesi gereken rağmen hemen hemen her elektrofizyolojik laboratuvar multiplex tek hücre RT-PCR tekniği kullanabilirsiniz.

Multiplex RT-PCR temsilcisi doğrulamasına Şekil 3' te gösterilmiştir. Protokol aynı anda 12 farklı genler ifade soruşturma için tasarlanmıştır. Veziküler glutamat ışınlama vGluT1 glutamatergic nöronlar42için pozitif kontrol olarak alınmıştır. Enzimler (GAD65 ve GAD 67), peptit Y (NPY) ve Somatostatin (SOM) sentezleme GABA GABAergic interneurons3,5,1...

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Bu yöntem, nörobilim araştırmalarında, nöro popülasyonu karakterize etmek veya iletim sistemlerinin kaynaklarını ve hedeflerini belirlemek gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hücreden önceden seçilmiş bir gen kümesinin ekspresyon profilini hızlı ve kolay bir şekilde belirlemeye izin vermesidir. Dolayısıyla bu yöntem, rastgele çeşitlilik faresi hakkında fikir verebilir.Astrositler gibi diğer hücre tiplerine ve birçok hayvan modelinde de uygulanabilir. Bu yöntemin bu gösterimi kritiktir, çünkü tutuklama ve heves etme adımlarının öğrenilmesi zor olabilir, çünkü verilerin analiz edilmesi için bir miktar sitoplazmaya ihtiyaç vardır. Bölümlere ayırmadan önce, cerrahi makas, ince iris makası, iki spatula, forseps, bir kağıt filtre diski ve siyanoakrilat yapıştırıcı içeren bir diseksiyon kiti hazırlayın.Daha sonra buz gibi kesme solüsyonunu karbogyn ile doyurun ve kesme odasını eksi 20 santigrat derecede soğutun. Sonra, hayvanın kafa derisini çıkarın ve kafatasını açın. Beyni dikkatlice çıkarın ve karbojene buz gibi kesme solüsyonu ile doldurulmuş küçük bir behere yerleştirin.Daha sonra kesme haznesini eksi 20 santigrat dereceden çıkar

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA'ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Öğrenin tek hücreli çoklu RT-PCR yöntemini yama-kelepçe kayıtları sonrası sinirbilim araştırmaları için. Bu teknik, bireysel hücrelerden gen ifadesi profillerini analiz ederek nöron çeşitliliğini anlamaya yardımcı olur.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Daha fazla video keşfet