Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

Burada sunulan prosedürlerin genel amacı, gen transkript seviyelerinin değerlendirilebilmesi için spor çimlenmesinin aşamalarını belirlemektir. Bu değişikliklerin analizi, hastalık dağılımında kritik bir aşama hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır. Bu yöntem, gen transkript seviyelerindeki değişikliklerle bağlantılı olan ve dolayısıyla gen ekspresyonu kontrolündeki değişimleri yansıtan teliospor çimlenmesi sırasındaki geçişler hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajları, solunum seviyesindeki görünür morfolojik anahtarlara karşılık gelmeyen geçişleri tanımlaması ve çimlenmenin farklı aşamalarında teliosporların fiziksel izolasyonuna izin vermesidir. Bu tekniğin, patojen yayılımının kontrolü için etkileri vardır, çünkü spor çimlenmesindeki temel geçişleri tanımlamamıza izin verir, bu da değiştirilirse hastalığın yayılmasını engelleyebilir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi mısır koçanı enfeksiyonu, teliospor hasadı ve ayrıca teliospor canlılığı ve çimlenme testi ile başlayın.

Çimlenmeyi indüklemek için, önce her solunum deneyi için eşit miktarda teliospor tartın. Bir biyogüvenlik kabininde, teliosporları otoklavlanmış bir solunum odasına ekleyin. Odayı streptomisin sülfat ve kanamisin sülfat ile takviye edilmiş patates dekstroz suyu ile doldurun.

Bir teliospor süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hava geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için hazne kapağını hazneye yerleştirin. OCR ölçümünü elde etmek için önce hazneyi bir su banyosunun içindeki hazne rafına yerleştirin.

Ardından, oksijen probunu odanın açıklığının içine yerleştirin. Sensör izleme hızı programında gerçek zamanlı olarak görünen veri noktalarını izleyin. Prob hazneye yerleştirildikten sonra probun yaklaşık üç dakika stabilize olmasına izin verin.

Oksijen seviyelerini iki saniyelik aralıklarla kaydedilen ölçümlerle altı saat boyunca sürekli olarak ölçmek için Ölç'e tıklayın. Verileri Microsoft Excel'e aktarmadan ve metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirmeden önce ölçümü durdurun ve analiz edilecek her örnek için bu adımları tekrarlayın. Yaklaşık 10 miligram umatus teliosporunu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Teliosporları streptomisin sülfat ile takviye edilmiş 500 mikrolitre PDB'de askıya alın. Ortamda teliospor kümeleri kalmayana kadar karıştırmak için hafifçe pipetleyin. Teliospor süspansiyonunu, streptomisin sülfat ile desteklenmiş PDB içeren otomatik klavlanmış 250 mililitrelik bir Erlin Meyer şişesine aktarın.

Şişeyi gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin ve 90 RPM'de çalkalayın. Petri kabının üst kısmına dört ila beş beş mikrolitrelik damla damıtılmış su pipetleyerek bir Petri kabı hazırlayın. Ardından, numune toplama için kullanılacak Petri kabına üç adet iki mikrolitrelik RNA stabilizasyon solüsyonu damlatın.

Ayrıca, Petri kabına 30 adet beş mikrolitrelik çimlenme teliospor damlacıkları pipetleyin. Petri kabına 15 mililitre mineral yağ ekleyin. Devam etmeden önce tüm damlacıkların yağla kaplandığından emin olun.

Ardından, 15 mikron ara çapa, bir milimetre flanşa, 55 mililitre uzunluğa ve 20 derece uç açısına sahip bir mikro kılcal damar hazırlayın. Mikrokılcal tutucuya yerleştirin ve kılcal hareketin mineral yağın mikro kılcal damara girmesine izin vereceği mineral yağa batırın. Su damlacığına getirmeden önce mikrokılcal damardaki basıncı boşaltın.

Mikrokılcal damarı su ile hazırlamak için aspire edin. Mikromanipülatörün kontrollerini kullanarak, hazırlanan mikrokılcal damarı çimlenme damlacıklarından birine hareket ettirin ve damlacığa nüfuz edin. Mikrokılcal damarı indirin ve mikrokılcal damarın ağzını, ilgilenilen çimlenme aşamasında çimlenen bir teliospora getirin.

Çimlenen teliosporu yakalamak için yavaşça aspire edin. Teliospor mikrokapillere girdikten sonra aspirasyonu durdurun. Mikrokılcal damarda yaklaşık beş teliospor olana kadar tekrarlayın.

Mikromanipülatör ile mikrokılcal damarı kaldırın ve RNA stabilizasyon çözeltisinin toplama damlacığına getirin. Damlacığa nüfuz edin ve teliosporları damlacığa enjekte edin. Yaklaşık 1.000 teliospor yakalanana kadar bu adımları tekrarlayın.

Toplama damlacığını geri kazanmak için, toplama damlacığını pipetleyin ve bir RNA'nın DNA'sının serbest 2.0 mililitrelik mikrocenterfuge tüpünün kapağına aktarın. Toplama damlacığını bozmadan, mineral yağı pipetle dikkatlice karıştırın. Teliosporlar artık RNA izolasyonu gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Bu grafik, çimlenmeye neden olan teliosporların süspansiyonlarındaki oksijen seviyesi değişikliklerinin değerlendirilmesinden elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir. İndüklenmemiş teliosporlara göre, solunumun başladığını gösteren ayrılma yaklaşık 30 dakika içinde gerçekleşir. Numunenin kurulması ve oksijen probuna taşınmasının yaklaşık 15 dakika sürdüğü düşünüldüğünde bu süre aslında 45 dakikadır.

Burada gösterilen, teliospor çimlenmesinin beş aşamasıdır. Birinci aşamada, teliosporlar çimlenmeye teşvik edilir, ancak morfolojik bir çimlenme belirtisi göstermez. İkinci aşama teliosporlar, teliosporun çapından daha küçük bir uzunluğa sahip ortaya çıkan bir promiselyum gösterir.

Üçüncü aşamada, promiselyum uzunluğu teliosporun çapından daha büyüktür. Dördüncü aşama, bağlı basidiosporlar ile promisel ile karakterizedir. Ve beşinci aşamada, tomurcuklanan basidiosporlar var.

Burada, asenkron olarak çimlenen teliosporlar gösterilir ve mikrokılcal damar, üçüncü aşama teliosporun yakınına yerleştirilir. Üçüncü aşama teliospor daha sonra mikrokapiller içine aspire edilir ve bir damla toplama çözeltisine aktarılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu mikrodiseksiyon tekniği, altı ila yedi saat içinde 1.000 evreye özgü teliosporu izole etmek için kullanılabilir.

Bu prosedürü denerken, sık sık ara vermeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, çimlenmenin morfolojik olarak farklı aşamalarında sporları fiziksel olarak nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ve solunumun başlama zamanını belirleyin.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, steriliteyi koruma ihtiyacı nedeniyle mücadele edeceklerdir. Ve sabır ihtiyacı ve mikrodiseksiyon ile hücre tiplerini izole etmek. Bu tekniğin geliştirilmesi, mantar bitki patologlarının, küresel gıda güvenliğini tehdit eden yıkıcı is ve pas mantarlarında çimlenmenin morfolojik ve moleküler yönlerini keşfetmelerinin yolunu açıyor.

Bu teknik biz ligomatistler için geçerli olsa da, yılda milyarlarca dolar zarara neden olan diğer birçok yıkıcı tarım mahsulü patojeninde de kullanılabilir. Bu prosedürü takiben, transkript seviyesi değişikliğinin profili ve zamanlaması nedir gibi ek soruları yanıtlamak için RNA izolasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.