Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak çıkıntı kuvvetlerini ölçmektir. Bu, önce formül kaplı ızgaraların hazırlanması ve bu filmin kalınlığının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Bu işlemin üçüncü adımı, hücrelerin ızgaralar üzerine oturtulması ve bunların yapışmaya bırakılmasından oluşur.

Prosedürün son adımı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak hücrelerin altındaki forma filmi görüntülemektir. Substrata yapışırken, mikrofajlar podozom adı verilen submikrometrik yapışma yapıları oluşturur. Nihayetinde, podozomlar tarafından kullanılan filmin deformasyonu ölçülecek ve ev yapımı bir mekanik model kullanılarak kuvvetlere dönüştürülecektir.

Huni film döküm cihazına etanol temiz bir cam ışık yerleştirin ve huninin üst kısmını kapatın. Seviye slaydın üçte ikisine ulaşana kadar fomvar çözeltisini huniye doğru kaydırın. Bir dakika bekletin, ardından formvar çözeltisini sabit bir akışta boşaltın.

Filmin kalınlığının hem akış hızına hem de formvar çözeltisinin konsantrasyonuna bağlı olduğuna dikkat edin. Bu ışığı koyu bir şekilde kurulayın ve keskin bir tıraş bıçağıyla dikdörtgenleri kesin. Slaytı, fomvar filminin su yüzeyine yüzmesi için damıtılmış suyla doldurulmuş beherinize batırın.

Aseton temiz ızgaraları, bazılarının üzerine 12 milimetre çapında bir kapak kaymasıyla, parlak yüzleri yukarı bakacak şekilde dikkatlice filmlerin üzerine yerleştirin. Kalınlık değerlendirme deneyi için kullanılacaklar. Sonunda, tüm filmi ve ızgaraları kurtarmak için çıkartma kaplı bir slaytı daldırın.

Formvarı kesmek ve slayttan ayırmak için cam kaplı fişi cımbızla çizin. Izgaranın konumunu kapalı kaymanın altına monte edin, ardından çıkarmak için ızgarayı cımbızla çizin. Bu şekilde oluşturulan fomvar filmdeki delik, kalınlığını ölçmek için görüntülenecektir.

Altın şeridin yayın ucunun altında olmadığından emin olarak AFM cam bloğuna bir silikon nitrat kabı monte edin. Cam bloğu AFM modülüne monte edin, ardından ikincisini mikroskop tablasına yerleştirin. Fomvar kaplı kapak fişini, üstte PBS olacak şekilde gözlem odasına yerleştirin.

Temas modunda ve 0,5 nano Newton noktasıyla fomvar ve cam arasındaki sınırı tarayın. Veri işleme yazılımında, cam yüzeyi yükseklik referansı olarak kullanın ve enine kesitteki fomvar kalınlığını ölçün. Steril bir kaputun altında 12 milimetrelik bir kapak kayışı alın ve üzerine delik kenarlı banttan bir şerit yapıştırın.

Fomavr kaplı ızgarayı cımbızla çizin ve parlak yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, böylece sadece yanları yapıştırıcıya yapışacaktır. Bu, ızgarayı banttan çıkarırken fomvarın yırtılmasını önlemek içindir. Kapak şeridini steril altı oyuklu bir plakaya yerleştirin ve 10 milimetrelik bir serum içermeyen kültür ortamı damlacığı içinde sıkın.

Yaklaşık 10 bin hücre içermelidir ve bu durumda bunlar insan monositlerinden farklılaşan mikrofajlardır. Fomvar kaplamaya zarar vermemek için işlem sırasında boru ucu ile ızgaraya dokunmadığınızdan emin olun. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için yarım saat inkübe edin, daha sonra kuyuyu serum takviyeli ortamla doldurun ve AFM gözleminden önce iki saat tekrar inkübe edin.

Cam tabanlı bir petri kabına iki paralel çift taraflı bant şeridi yerleştirin ve aralarındaki genişliğin ızgara çapınıza kıyasla biraz daha küçük olduğundan emin olun. Ardından, daha önce hücrelerle tohumlanmış ızgarayı ayırın ve hücreler aşağı bakacak şekilde iki bant şeridinin üzerine yerleştirin. Geçirgen olanların üzerine iki şerit daha yerleştirerek ızgarayı sabitleyin.

Çanağı, hepe ile desteklenmiş önceden ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Çanağı daha önce 37 santigrat dereceye ayarlanmış bulaşık ısıtıcısına yerleştirin. Seti AFM sahnesine kurun.

Sistem sıcaklığı 37 santigrat derecede sabit olduğunda, 0.95 nano newton ayar noktası ile temas modunda yapılması gereken fomvar yüzeyinin taramasına devam edin ve sapma verileri görüntüleme penceresinde protozoan ile ilişkili deformasyonları görselleştirin. İşte AFM ile oluşumları grafiksel ölçümlere dönüştürmek için temsili sonuçlar ve işleme adımları. Bu görüntüde de görebileceğiniz gibi, fomvar yüzeyindeki çıkıntılar tespit edilir.

Bu fotografik bilgiyi kuvvet değerlerine dönüştürmek için öncelikle yerel yüksek farka erişim sağlamak gerekir. Bunu yapmak için, üçüncü dereceden bir polinom uyumu, tarama çizgisine bağımsız olarak çıkarılmalıdır. Daha sonra, ev yapımı özel bir görüntü algoritmasının kullanılması, AFM yükseklik haritasından ve protozoan aracılı çıkıntının mekanik modelinden çıkıntı kuvveti değerlerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

Bu prosedür sayesinde, protozoanlarda çıkıntı kuvveti oluşumunda rol oynayan mekanizmaları araştırabiliyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneyleriniz için iyi şanslar.