Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem
16 Haziran 2018
Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.
Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak çıkıntı kuvvetlerini ölçmektir. Bu, önce formül kaplı ızgaraların hazırlanması ve bu filmin kalınlığının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Bu işlemin üçüncü adımı, hücrelerin ızgaralar üzerine oturtulması ve bunların yapışmaya bırakılmasından oluşur.
Prosedürün son adımı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak hücrelerin altındaki forma filmi görüntülemektir. Substrata yapışırken, mikrofajlar podozom adı verilen submikrometrik yapışma yapıları oluşturur. Nihayetinde, podozomlar tarafından kullanılan filmin deformasyonu ölçülecek ve ev yapımı bir mekanik model kullanılarak kuvvetlere dönüştürülecektir.
Huni film döküm cihazına etanol temiz bir cam ışık yerleştirin ve huninin üst kısmını kapatın. Seviye slaydın üçte ikisine ulaşana kadar fomvar çözeltisini huniye doğru kaydırın. Bir dakika bekletin, ardından formvar çözeltisini sabit bir akışta boşaltın.
Filmin kalınlığının hem akış hızına hem de formvar çözeltisinin konsantrasyonuna bağlı olduğuna dikkat edin. Bu ışığı koyu bir şekilde kurulayın ve keskin bir tıraş bıçağıyla dikdörtgenleri kesin. Slaytı, fomvar filminin su yüzeyine yüzmesi için damıtılmış suyla doldurulmuş beherinize batırın.
Aseton temiz ızgaraları, bazılarının üzerine 12 milimetre çapında bir kapak kaymasıyla, parlak yüzleri yukarı bakacak şekilde dikkatlice filmlerin üzerine yerleştirin. Kalınlık değerlendirme deneyi için kullanılacaklar. Sonunda, tüm filmi ve ızgaraları kurtarmak için çıkartma kaplı bir slaytı daldırın.
Formvarı kesmek ve slayttan ayırmak için cam kaplı fişi cımbızla çizin. Izgaranın konumunu kapalı kaymanın altına monte edin, ardından çıkarmak için ızgarayı cımbızla çizin. Bu şekilde oluşturulan fomvar filmdeki delik, kalınlığını ölçmek için görüntülenecektir.
Altın şeridin yayın ucunun altında olmadığından emin olarak AFM cam bloğuna bir silikon nitrat kabı monte edin. Cam bloğu AFM modülüne monte edin, ardından ikincisini mikroskop tablasına yerleştirin. Fomvar kaplı kapak fişini, üstte PBS olacak şekilde gözlem odasına yerleştirin.
Temas modunda ve 0,5 nano Newton noktasıyla fomvar ve cam arasındaki sınırı tarayın. Veri işleme yazılımında, cam yüzeyi yükseklik referansı olarak kullanın ve enine kesitteki fomvar kalınlığını ölçün. Steril bir kaputun altında 12 milimetrelik bir kapak kayışı alın ve üzerine delik kenarlı banttan bir şerit yapıştırın.
Fomavr kaplı ızgarayı cımbızla çizin ve parlak yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, böylece sadece yanları yapıştırıcıya yapışacaktır. Bu, ızgarayı banttan çıkarırken fomvarın yırtılmasını önlemek içindir. Kapak şeridini steril altı oyuklu bir plakaya yerleştirin ve 10 milimetrelik bir serum içermeyen kültür ortamı damlacığı içinde sıkın.
Yaklaşık 10 bin hücre içermelidir ve bu durumda bunlar insan monositlerinden farklılaşan mikrofajlardır. Fomvar kaplamaya zarar vermemek için işlem sırasında boru ucu ile ızgaraya dokunmadığınızdan emin olun. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için yarım saat inkübe edin, daha sonra kuyuyu serum takviyeli ortamla doldurun ve AFM gözleminden önce iki saat tekrar inkübe edin.
Cam tabanlı bir petri kabına iki paralel çift taraflı bant şeridi yerleştirin ve aralarındaki genişliğin ızgara çapınıza kıyasla biraz daha küçük olduğundan emin olun. Ardından, daha önce hücrelerle tohumlanmış ızgarayı ayırın ve hücreler aşağı bakacak şekilde iki bant şeridinin üzerine yerleştirin. Geçirgen olanların üzerine iki şerit daha yerleştirerek ızgarayı sabitleyin.
Çanağı, hepe ile desteklenmiş önceden ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Çanağı daha önce 37 santigrat dereceye ayarlanmış bulaşık ısıtıcısına yerleştirin. Seti AFM sahnesine kurun.
Sistem sıcaklığı 37 santigrat derecede sabit olduğunda, 0.95 nano newton ayar noktası ile temas modunda yapılması gereken fomvar yüzeyinin taramasına devam edin ve sapma verileri görüntüleme penceresinde protozoan ile ilişkili deformasyonları görselleştirin. İşte AFM ile oluşumları grafiksel ölçümlere dönüştürmek için temsili sonuçlar ve işleme adımları. Bu görüntüde de görebileceğiniz gibi, fomvar yüzeyindeki çıkıntılar tespit edilir.
Bu fotografik bilgiyi kuvvet değerlerine dönüştürmek için öncelikle yerel yüksek farka erişim sağlamak gerekir. Bunu yapmak için, üçüncü dereceden bir polinom uyumu, tarama çizgisine bağımsız olarak çıkarılmalıdır. Daha sonra, ev yapımı özel bir görüntü algoritmasının kullanılması, AFM yükseklik haritasından ve protozoan aracılı çıkıntının mekanik modelinden çıkıntı kuvveti değerlerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Bu prosedür sayesinde, protozoanlarda çıkıntı kuvveti oluşumunda rol oynayan mekanizmaları araştırabiliyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneyleriniz için iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, podosomların uyumlu bir film üzerinde uyguladığı çıkıntı kuvvetlerini nicellemek için kullanılan deneysel teknikleri atomik kuvvet mikroskobu kullanarak detaylandırır. Süreç, film hazırlama, hücre yapışması ve podosomların neden olduğu deformasyonu analiz etmek için görüntüleme içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Biyofizik
Arka Plan
- Podosomlar, makrofajlar tarafından oluşturulan submikrometrik yapışma yapılarıdır.
- Podosomların uyguladığı kuvvetlerin anlaşılması, hücresel mekanikler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Atomik kuvvet mikroskobu, bu kuvvetleri ölçmek için önemli bir tekniktir.
- Çalışma, film deformasyonuna dayalı kuvvetlerin nicellenmesi için mekanik bir model geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Podosomların uyguladığı çıkıntı kuvvetlerini nicellemek.
- Hücreler ve uyumlu yüzeyler arasındaki etkileşimi analiz etmek.
- Hücresel yapışma mekanizmaları hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Formül kaplı ızgaraların hazırlanması.
- Film kalınlığının ölçülmesi.
- Yapışma için ızgaralar üzerinde hücrelerin oturtulması.
- Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak hücrelerin altındaki filmin görüntülenmesi.
Ana Sonuçlar
- Podosomların neden olduğu film deformasyonunun nicellenmesi.
- Deformasyon ölçümlerinin mekanik bir model kullanılarak kuvvet değerlerine dönüştürülmesi.
- Yüzeylerle podosom etkileşimlerinin mekanik özellikleri hakkında bilgiler.
- Atomik kuvvet mikroskobunun hücresel kuvvetleri ölçmede etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Çalışma, podosomlardan kaynaklanan çıkıntı kuvvetlerini başarıyla nicellendirmiştir.
- Bulgular, hücresel mekanikler ve yapışma anlayışına katkıda bulunur.
- Geliştirilen yöntemler, hücre biyolojisinde daha fazla araştırmaya uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying protrusion forces provides a direct readout of cellular mechanical activity, enabling mechanistic de-risking in target validation for macrophage-related pathways. This method supports predictive confidence by linking subcellular force generation to functional phenotypes in adhesion and migration. It positions protrusion force measurement as a translational biomarker platform for preclinical model de-risking in immunology and inflammation programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying force generation from subcellular protrusive structures like podosomes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct measurement of force-dependent cellular functions in human macrophages.
- Predictive Value: Links protrusion force dynamics to pathway clarification, aiding portfolio triage in mechanosensitive target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible nanoscale topography maps from compliant substrates for quantitative force extraction.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems (e.g., podosome-forming macrophages) for downstream compound screening.
- Platform Reuse: Facilitates reliable compound evaluation by providing a mechanical phenotype readout orthogonal to biochemical assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage protrusion force measurements to preclinical validation through disease-relevant macrophage models.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by quantifying force generation as a functional output of podosome activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating protrusion force modulation with target engagement in adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing a quantitative, mechanistically grounded readout of cellular protrusion dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring force generation from defined protrusive structures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible height maps from AFM imaging that enable quantitative comparison of protrusion forces across conditions.
- Analytics: Generates force values via mechanical model conversion of deformation profiles, enabling statistical comparison of protrusive activity.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using human macrophage-derived podosomes as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing mechanobiology across immune, cancer, and inflammation targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protrusion-driven processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through AFM-based nanoscale deformation mapping and controlled substrate preparation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early biological de-risking of targets involved in force-generating cellular structures.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying protrusion force as a functional biomarker for target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy operation, compliant polymer film preparation, and macrophage cell culture.
- Depends on instrumentation capable of nanoscale height mapping and force curve acquisition in liquid environment.
- Necessitates cross-team standardization of film thickness measurement, cell seeding density, and AFM set-point force for reproducible protrusion detection.
- Involves adaptation considerations when applying to non-macrophage cell types or alternative protrusive structures beyond podosomes.
- Limited by the need for homogeneous, defect-free compliant films and accurate mechanical modeling of protrusion-substrate interactions.
