Name: Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Öğrenin, çıkıntı kuvvet mikroskobu ile makrofajların podozomları tarafından uygulanan kuvvetleri ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre yapışma mekanizmalarını ve biyofiziksel özellikleri anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ilk katkılarından dolayı bu eser ve Matthieu Sanchez ve Françoise Viala için video filme ve düzenleme ile yardım için Anna Labernadie, Guillaume Charrière ve Patrick Delobelle için minnettarız. Bu eser l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planı kanser, Fondation Toulouse kanser ve insan sınır bilim programı (RGP0035/2016) tarafından desteklenmiştir.

1. Formvar kaplamalı ızgaralar hazırlanması
<ol><li>Elektron mikroskobu ızgaralar saf aseton ile temiz ve kuru onları filtre kağıt üzerinde. Sonra temiz bir mikroskop slayt saf etanol ile objektif kağıt ile silin ve toz bir üfleyici ile kaldırın.</li>
	<li>Bir etanol temizledim cam slayt film döküm cihazın alt kısmındaki Formvar çözeltilerine içeren huni dikey olarak yerleştirin. Huni üst kapak.</li>
	<li>Düzeyi üçte ikisi slayt ulaşıncaya kadar 100 mL Formvar çözeltisi (etilen ve %0,5) atomizer ampul ile pompa.</li>
	<li>Slayt 1 dk. için çözüm unutmayın.</li>
	<li>Aygıt bir akışı Formvar çözümünde drenaj valfi açın. Bir akış hızı 10 15 mL/s 30-80 nm Formvar film ortaya çıkarır. Film kalınlığı Formvar çözüm konsantrasyonu ve drenaj oranına göre belirlenir. Not: Drenaj oranı tarafından havalandırma basınç yoluyla hava-out Vana Vana yavaş yavaş açarak kontrol edilebilir. Daha hızlı drenaj, kalın film. Uygulamada, film kalınlığı Formvar akış hızı düşük tahmin etmek zordur çünkü biz Formvar filmlerin birkaç toplu hazırlamak ve onların kalınlığı AFM tarafından kontrol (adım 2 bakınız).</li>
	<li>Slayt odasından kaldırın ve kibar bir şekilde herhangi bir sıvı Formvar kaldırmak için filtre kağıdına kuru.</li>
	<li>20 mm x 50 mm dikdörtgen bir tıraş bıçağı ile Formvar filmden kesip.</li>
	<li>Bir ölçek temiz distile su ile doldurun ve yavaş yavaş slayt dikey olarak filmin yüzer suya dalma: film su yüzeyine float.</li>
	<li>Yer kuru aseton temizlenmiş ızgaralar üzerinde film, parlak ön yüz yukarıda.</li>
	<li>Yuvarlak cam coverslip (Ø 12 mm) birkaç ızgaralar yerleştirin. Bu coverslip film kalınlığı ölçmek için hizmet edecek (adım 2 bakınız).</li>
	<li>Bir mikroskop slayt sığdırmak için yeniden boyutlandırılmış bir beyaz sopa ile kapak. Bütün film için slayt bağlıdır kadar slayt dikey kayan Formvar film sınırında daldırma. Aşırı su filtre kağıdı ile slayt kaldırmak ve oda sıcaklığında gecede kurumaya bırakın.</li>
</ol>2. Film kalınlığı ölçümü
<ol><li>Coverslip çevresinde Formvar slayttan ayırmak için cımbız ile kesti.</li>
	<li>Coverslip altında kılavuzunun bir kalemle işaretlemek.</li>
	<li>Coverslip ayırmak için Formvar işaretli kılavuz çevresinde kesin. Bu nedenle film kalınlığı ölçmek için izin verir kalan Formvar sayfasının içinde bir delik olacak. Coverslip PBS ile kapak ve bir cam slayt mikroskop üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Bir silikon nitrür prensibine göre altın şerit bahar ipucu tarafından kapsanmayan emin AFM cam blok bağlama. Not: Duyarlılığı ve bahar sabiti prensibine göre daha önce PBS içinde kalibre varsa.</li>
	<li>Cam blok AFM modülü üzerine monte ve modül mikroskop üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Formvar kaplı coverslip Gözlem odası yerleştirin ve PBS 500 µL ile kapağı.</li>
	<li>Formvar sayfası AFM iletişim modu ve 0.5 nN kuvvet ayar noktası olarak kullanarak delik kenarlığını inceden inceye gözden geçirmek.</li>
	<li>Cam coverslip yüzey boy ölçümleri için başvurmak ve Formvar kalınlık kesit yüksekliğini olarak değerlendirmek (Formvar toplu iş başına en az 10 ölçümleri gerçekleştirmek).</li>
</ol>3. tohum hücreleri üzerinde ızgaralar
<ol><li>Steril bir başlık altında bir şerit (12 mm x 3 mm) çift taraflı yapışkan bant bir coverslip koy.</li>
	<li>Formvar kaplı ızgara cımbızla ve (sadece ızgara kenarında teybe bağlı olması gerekir) yapıştırıcı şerit üzerinde ters koydu. Formvar film coverslip karşısında gereken.</li>
	<li>Bu cihaz bir kültürde de koy.</li>
	<li>Yer RPMI 104 makrofajlar içeren FCS olmadan bir 10 µL damlacık insan monosit16' dan farklı. Not: Formvar kaplama zarar önlemek için pipet ucu kılavuzla dokunmak emin olun.</li>
	<li>30 dk (37 ° C, % 5 CO2) uygun hücreleri izin vermek için kuluçkaya.</li>
	<li>Kadar iyi 2 mL % 10 FCS içeren RPMI ile doldurun.</li>
	<li>Aygıt hücreleri AFM gözlem önce uygun izin için 37 ° C ve % 5 CO2 2 h için kuluçkaya.</li>
</ol>4. Podosome kaynaklı deformasyonlar topografya ölçümleri
<ol><li>İki katına taraflı yapışkan bant iki şeritler bir cam alt Petri kabına sadık. Not: İki şeritler arasındaki mesafe kılavuz çapı daha küçük olmalıdır.</li>
	<li>Dikkatle makrofajlar yapışkan bandı üzerinden ile kaplama Kılavuzu bağlantısını kesin.</li>
	<li>Izgarayı cam dış yüzey hücreleri için ters çevirmek ve Izgarayı iki yapışkan şeritleri arasında sopa.</li>
	<li>Izgarayı iki ile yeni iki katına taraflı yapışkan şeritler Düzeltme: kılavuz böylece merkezi alan kılavuz AFM ipucu için erişilebilir bırakarak iki yapışkan şeritleri arasında gözükeceksin. Not: ızgara tamir ve değil bükülmüş emin olun; Aksi takdirde AFM prensibine göre Formvar yüzey yaklaşmak mümkün olmayabilir.</li>
	<li>Petri kabına 10 mM HEPES (pH 7,4) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış 37 ° C Kültür ortamının (RPMI % 10 FCS ile) 2 mL ile doldurun.</li>
	<li>Kültür tabak bir 37 ° C yemek ısıtıcı yerleştirin.</li>
	<li>Yemek ısıtıcı AFM sahne alanı'nda yükleyin.</li>
	<li>37 ° C'de stabilize sistem izin</li>
	<li>Kişi modu bir 0.5 nN kuvvetle podosomes bulmak için bir ilk küresel görüntü olun ve 3 Hz değerinde Formvar topografya ile yaklaşık 20 nm büyük pixel inceden inceye gözden geçirmek. Not: ızgara kenarlarına tarama kaçının.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Malzeme özellikleri
Formvar, bizim durumumuzda deforme membran için malzeme seçimi birkaç şartları yerine getirmek gerekiyor. Malzeme için görünür ışık şeffaf olması ve gözlemler parlak alan ve floresan mikroskopi izin vermek için sınırlı otomatik floresans sergilemek gerekir. İnce film pürüzlülüğü de 10 olmalıdır nm açık hücre kaynaklı çıkıntılar gözlenmesi AFM görüntüleme tarafından izin veren ve hücre adezyon topografik herhangi bir etkisi önlemek için. Son olarak, Young'ın...

Hayvan hücrelerinin fiziksel olarak matrix ve onların çevre1oluşturan diğer hücreleri ile etkileşim. Bu onlar için geçirme, cesetleri içselleştirmesi, dış bilgi edinme veya ayırt etmek gereklidir. Bu tür işlemlerde, mekanik Kuvvetleri hücre oluşturmak için gereken ve çok sayıda çalışma son yıllarda gösterdiği gibi kuvvetler oluşturmak ve çevresine yoklama için hücre yeteneği Örneğin nükleer silahların yayılmasına karşı yönlendiren biyolojik davranışını etkiler veya farklılaşma2,3. Buna karşılık, hücresel kuvvetler ölçümü kuvvet oluşturma Yönetmeliği çalışma ve onun dolaylı hücre davranış ve doku kader4,5anlamak için bir büyük yardımcısıdır.
Son yıllarda bir hücre üzerinde onun çevre6uygulamayın kuvvetleri ölçmek için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde çok sayıda tanık olduk. Bunların çoğunluğu onlar mobil probları veya deforme substrat çekmek gibi hücreleri sarfetmek çekiş güçleri açığa vesile olmuştur. Ancak, mekanik Kuvvetleri çıkıntı hücre dışı ortama dahil ölçüm teknikleri bir eksikliği muzdarip ve iyi değil karakterize bugüne kadar.
Bu sınırlamayı aşmak için uygun belgili tanımlık substrate sarf kuvvetleri ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu canlı hücreler hücreleri tarafından yüzey deformasyon ölçmek ve katılan kuvvetleri anlamak mümkün hale dik yönde deforme ince bir elastik levha üzerinde kaplama oluşur. Substrat topografya atomik kuvvet mikroskobu kullanarak nano çözünürlüğü ile ölçülür ve deformasyon kuvvetlerden değerlendirilmesi protrusive hücresel yapılar7,8, geometri bilgisine dayanıyor 9.
Burada, kurulum ve uygulama podosomes, protrusive yapışma yapıları için üç boyutlu ortamlarda10,11mezenkimal onların göç makrofajlar tarafından kurulan tarafından oluşturulan kuvvetleri ölçmek için açıklamak, 12,13,14,15,16,17. Bu teknik kuvvet oluşturma ve çıkıntı içeren birçok hücresel süreçler, Yönetmelikte anlayışı peşin olacak inanıyorum.

<table><tbody><tr><td>200 gözenekli nikel ızgaralar</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz çıkartmalar 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Çıkışında valf bulunan film döküm cihazı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçakları Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Etilen diklorür içinde formvar% 0.5 çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm lameller</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Atomik Kuvvet Mikroskobu</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü numune tutucu&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Nominal yay sabiti 0,01 N/m olan silikon nitrür konsol</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Çift taraflı yapışkan bant</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı Petri kapları</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Çok sayıda biyolojik bağlamlarda hayvan hücrelerinin fiziksel olarak mekanik Kuvvetleri geliştirerek onların çevre ile etkileşim gerekir. Bunlar arasında çekiş güçleri iyi karakterize olmuştur, ama teknikleri onların substrat uygun hücrelere tarafından sarf çıkıntı kuvvetler ölçümü izin veren bir eksikliği olduğunu. Biz onların yüzey üzerinde yapışık hücreleri tarafından sarf çıkıntı kuvvetleri ölçmek için deneysel bir kurulum tasarlanmıştır. Bu yüzey hücreleri uyumlu Formvar kağıt üzerinde kaplama deforme ve elde edilen topografya nanometre ölçeğinde atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından eşleştirilir. Kuvvet değerleri daha sonra protrusive hücresel yapılar geometri üzerinde dayalı deformasyon profil bir analiz ayıklanır. Bu nedenle, bir yaşam hücre bireysel çıkıntılı birimleri tarafından sarf kuvvetleri zamanla ölçülebilir. Bu teknik, kuvvet oluşturma ve çıkıntı içeren birçok hücresel süreçler, Yönetmelikte sağlayacaktır. Burada, insan makrofajlar tarafından kurulan podosomes tarafından oluşturulan protrusive kuvvetleri ölçmek için uygulama açıklar.

Yukarıdaki Protokolü makrofaj podosomes Formvar substrat üzerine tarafından uygulanan çıkıntı kuvvetleri ölçmek için deneysel kurulum hazırlamak açıklar. Bu AFM kullanarak elde edilir ve Şekil 1' de gösterilmiştir.
JPK veri işleme yazılımı kullanarak podosomes altında çıkıntı topografik bir görüntüsünü analiz ederken, uygun bir üçüncü derece polinom her tarama satırından bağımsız olarak düşülen. Pod...

Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak çıkıntı kuvvetlerini ölçmektir. Bu, önce formül kaplı ızgaraların hazırlanması ve bu filmin kalınlığının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Bu işlemin üçüncü adımı, hücrelerin ızgaralar üzerine oturtulması ve bunların yapışmaya bırakılmasından oluşur.Prosedürün son adımı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak hücrelerin altındaki forma filmi görüntülemektir. Substrata yapışırken, mikrofajlar podozom adı verilen submikrometrik yapışma yapıları oluşturur. Nihayetinde, podozomlar tarafından kullanılan filmin deformasyonu ölçülecek ve ev yapımı bir mekanik model kullanılarak kuvvetlere dönüştürülecektir.Huni film döküm cihazına etanol temiz bir cam ışık yerleştirin ve huninin üst kısmını kapatın. Seviye slaydın üçte ikisine ulaşana kadar fomvar çözeltisini huniye doğru kaydırın. Bir dakika bekletin, ardından formvar çözeltisini sabit bir akışta boşaltın.Filmin kalınlığının hem akış hızına hem de formvar çözeltisinin konsantrasyonuna bağlı olduğuna dikkat edin. Bu ışığı koyu bir şekilde kurulayın ve keskin bir tıraş bıçağıyla dikdörtgenleri kesin. Slaytı, fomvar filminin su yüzeyine yüzmesi için damıtılmış suyla doldurulmuş beherinize batırın.Aseton temiz ızgaraları, bazılarının üzerine 12 milimetre çapında bir kapak kaymasıyla, parlak yüzleri yukarı bakacak şekilde dikkatlice filmlerin üzerine yerleştirin. Kalınlık değerlendirme deneyi için kullanılacaklar. Sonunda, tüm filmi ve ızgaraları kurtarmak için çıkartma kaplı bir slaytı daldırın.Formvarı kesmek ve slayttan ayırmak için cam kaplı fişi cımbızla çizin. Izgaranın konumunu kapalı kaymanın altına monte edin, ardından çıkarmak için ızgarayı cımbızla çizin. Bu şekilde oluşturulan fomvar filmdeki delik, kalınlığını ölçmek için görüntülenecektir.Altın şeridin yayın ucunun altında olmadığından emin olarak AFM cam bloğuna bir silikon nitrat kabı monte edin. Cam bloğu AFM modülüne monte edin, ardından ikincisini mikroskop tablasına yerleştirin. Fomvar kaplı kapak fişini, üstte PBS olacak şekilde gözlem odasına yerleştirin.Temas modunda ve 0,5 nano Newton noktasıyla fomvar ve cam arasındaki sınırı tarayın. Veri işleme yazılımında, cam yüzeyi yükseklik referansı olarak kullanın ve enine kesitteki fomvar kalınlığını ölçün. Steril bir kaputun altında 12 milimetrelik bir kapak kayışı alın ve üzerine delik kenarlı banttan bir şerit yapıştırın.Fomavr kaplı ızgarayı cımbızla çizin ve parlak yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, böylece sadece yanları yapıştırıcıya yapışacaktır. Bu, ızgarayı banttan çıkarırken fomvarın yırtılmasını önlemek içindir. Kapak şeridini steril altı oyuklu bir plakaya yerleştirin ve 10 milimetrelik bir serum içermeyen kültür ortamı damlacığı içinde sıkın.Yaklaşık 10 bin hücre içermelidir ve bu durumda bunlar insan monositlerinden farklılaşan mikrofajlardır. Fomvar kaplamaya zarar vermemek için işlem sırasında boru ucu ile ızgaraya dokunmadığınızdan emin olun. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için yarım saat inkübe edin, daha sonra kuyuyu serum takviyeli ortamla doldurun ve AFM gözleminden önce iki saat tekrar inkübe edin.Cam tabanlı bir petri kabına iki paralel çift taraflı bant şeridi yerleştirin ve aralarındaki genişliğin ızgara çapınıza kıyasla biraz daha küçük olduğundan emin olun. Ardından, daha önce hücrelerle tohumlanmış ızgarayı ayırın ve hücreler aşağı bakacak şekilde iki bant şeridinin üzerine yerleştirin. Geçirgen olanların üzerine iki şerit daha yerleştirerek ızgarayı sabitleyin.Çanağı, hepe ile desteklenmiş önceden ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Çanağı daha önce 37 santigrat dereceye ayarlanmış bulaşık ısıtıcısına yerleştirin. Seti AFM sahnesine kurun.Sistem sıcaklığı 37 santigrat derecede sabit olduğunda, 0.95 nano newton ayar noktası ile temas modunda yapılması gereken fomvar yüzeyinin taramasına devam edin ve sapma verileri görüntüleme penceresinde protozoan ile ilişkili deformasyonları görselleştirin. İşte AFM ile oluşumları grafiksel ölçümlere dönüştürmek için temsili sonuçlar ve işleme adımları. Bu görüntüde de görebileceğiniz gibi, fomvar yüzeyindeki çıkıntılar tespit edilir.Bu fotografik bilgiyi kuvvet değerlerine dönüştürmek için öncelikle yerel yüksek farka erişim sağlamak gerekir. Bunu yapmak için, üçüncü dereceden bir polinom uyumu, tarama çizgisine bağımsız olarak çıkarılmalıdır. Daha sonra, ev yapımı özel bir görüntü algoritmasının kullanılması, AFM yükseklik haritasından ve protozoan aracılı çıkıntının mekanik modelinden çıkıntı kuvveti değerlerinin değerlendirilmesine olanak tanır.Bu prosedür sayesinde, protozoanlarda çıkıntı kuvveti oluşumunda rol oynayan mekanizmaları araştırabiliyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneyleriniz için iyi şanslar.

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Burada B hücreleri üzerinde çekiş kuvveti mikroskobu deneyleri yapmak için kullanılan bir protokol salıyoruz. Yumuşak poliakrilamid jellerin hazırlanmasını ve işlevselleştirilmesinin yanı sıra mikroskopta veri toplama ve veri analizinin bir özetini anlatıyoruz.

B Lenfosit Aktivasyonunu Incelemek Için Çekiş Kuvveti Mikroskobu

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) platformu, bağlı hücrelerdeki çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyalleri aynı anda ölçme işlemini otomatikleştirir. iTACS, topluluk odaklı gelişimi kolaylaştırmak ve araştırmacıların eğitim geçmişlerine bakılmaksızın tüm platform özelliklerini kullanmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti: Kuvvetler, Hareket, Morfoloji ve Floresan

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Öğrenin, çıkıntı kuvvet mikroskobu ile makrofajların podozomları tarafından uygulanan kuvvetleri ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre yapışma mekanizmalarını ve biyofiziksel özellikleri anlamak için kullanılır.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

Daha fazla video keşfet