Bağırsak kök hücre izolasyon ve Segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak iskemisinin bağırsak epitel kök hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, kök hücrelerin yaralanmaya nasıl direndiği ve iskemik yaralanmayı takiben onarıma nasıl katkıda bulunduğu gibi kök hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, klinik bağırsak hastalığı ve onarımı için kullanılabilecek büyük bir hayvan modeli olmasıdır.

Prosedürü gösteren, yüksek lisans öğrencisi Amy Stieler Stewart ve laboratuvarımdan bir araştırma uzmanı olan John Freund olacak. Sekiz ila 10 haftalık bir Yorkshire melezi domuzun göbek deliğinde ortalanmış karın üzerinde sekiz ila 10 santimetrelik bir ventral orta hat kesisi yapmak için bir neşter bıçağı kullanarak başlayın. İleoçekal bileşkeye yaklaşık 40 santimetre oral olan jejunumu bulun.

Her ligatür arasında bir santimetre olacak şekilde 10 santimetre uzunluğundaki jejunum halkalarını tanımlamak için bağırsağı iki kez çevresel olarak bağlayın. Biri iskemi ve diğeri iskemi için olmak üzere birbirine bitişik iskemi zaman noktası başına iki döngü oluşturun ve ek bir saatlik reperfüzyon sağlayın. Tersinir tam iskemiyi indüklemek için, uygun deneysel süre boyunca klemp başına yaklaşık üç mezenterik damarı tıkamak için bulldog vasküler klempleri veya hemostatlar kullanın.

İskemik dönem boyunca karnı kapalı tutun. Deneyin sonunda, önce son iskemik döngünün en az beş ila 10 santimetre proksimalinde normal jejunumun bir kontrol parçasını toplamak için Metzenbaum makasını kullanın, ardından geri kalan döngülerin toplanması gerekir. Her yaralanma zaman noktasından gelen ilmekleri, kript izolasyonuna kadar küçük buz gibi soğuk PBS kaplarında saklayın.

Kript kök hücrelerini izole etmek için, mukozal yüzeyin açığa çıkması için ince bağırsağın her bir halkasını ters çevirmek için 20 gauge bir tel ve doku forseps kullanın. Her ilmeğin üstünü ve altını tele güvenli bir şekilde dikin ve her ters çevrilmiş ilmeği buz gibi soğuk PBS'de durulayın. Tüm luminal kalıntılar çıkarıldığında, numuneleri hemen her beş dakikada bir çalkalama ve ters çevirme ile 30 dakika boyunca buz üzerinde bir numaralı 30 mililitre ayrışma reaktifi içeren 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin.

Kuluçka süresinin sonunda, numuneleri iki numaralı 30 mililitre ayrışma reaktifi içeren karşılık gelen 50 mililitrelik tüplere aktarın ve iki ila dört saatlik iskemik döngü numunelerini santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve ışık mikroskobu ile kript ilişkisinin derecesini ve kalıntı miktarını kontrol etmek için her numuneden 50 mikrolitrelik bir alikot kullanın. Daha sonra, numuneleri her beş dakikada bir çalkalama veya ters çevirme ile 10 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.

Daha sonra numuneleri, her 30 saniyede bir ek manuel sallama veya ters çevirme ile iki ila beş dakikalık çalkalama için iki ila beş dakikalık çalkalama için 60 RPM'ye ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcıda buz üzerinde doğrudan 25 mililitre buz gibi soğuk PBS'ye aktarın. Çalkalama inkübasyonunun sonunda, kript ilişkisinin derecesini ve kalıntı miktarını kontrol edin ve numuneleri, sağlam kriptler minimum kalıntı ve villus ile izole edilene kadar çalkalamak için 25 mililitre soğuk PBS içeren yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Döngüler tamamen ayrıldığında, kalan dokuyu çıkarın, numuneleri santrifüjleme ile peletleyin ve kalan kript peletlerini beş mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin.

Daha sonra, tüp başına 150 kripti ayrı mikrosantrifüj tüplerine alikot edin ve kriptleri mikrosantrifüjleme ile peletleyin. Önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak, peletleri oyuk başına 50 mikrolitre ana karışımla nazikçe yeniden süspanse edin ve ardından karıştırmak için 15 kez hızlı pipetleme yapın. Daha sonra, önceden kurtlanmış ve ızgaralı, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına 50 mikrolitrelik bir kript damlası dağıtın ve plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

30 dakika sonra, her bir matris köftesini bağırsak epitel kök hücre ortamının oyuğu başına 500 mikrolitre ile kaplayın, nemi korumak ve kaplanmış, sıfır gün kriptlerinin sayısını saymak için kullanılmayan oyuklara 500 mikrolitre steril PBS ekleyin. Her 48 saatte bir her kuyucuğa büyüme faktörleri ekleyin, süpernatanı her 96 saatte bir 500 mikrolitre taze büyüme faktörü takviyeli ortamla değiştirin. Tam intestinal iskemi ince barsak ilmeklerinde, gösterildiği gibi dikişler veya klempler ile damar tıkanıklığından yararlanılarak oluşturulur.

Doğru yapılırsa, iskemik yaralanma bağırsak villusunun ucunda başlayacak ve iskemi süresi arttıkça kript içinde aşağı doğru göç edecektir. Cerrahi teknikle ilgili yaygın bir hata, kan damarları eşit şekilde bağlanmadığında veya klemplenmediğinde ortaya çıkabilir, bu da ince duvarlı damarın arterden önce çöktüğü ve ek kanın dokulara sızmasına izin verdiği hemorajik bir iskemi ile sonuçlanabilir. İskemik bağırsak döngülerinin çıkarılmasını takiben, bağırsak kriptleri, az önce gösterildiği gibi ayrışma protokolünü takiben başarılı bir şekilde izole edilebilir.

Daha ciddi şekilde hasar görmüş zaman noktalarından gelen kriptler genellikle kırılır ve hiç hasar görmeyen veya hafif hasar görenlere kıyasla daha fazla arka plan hücresel kalıntısı içerir. Normal ve hafif hasarlı bağırsak kriptleri kültürde kaplandığında, enterosferler 24 ila 48 saat içinde oluşur. Şiddetli iskemik hasarla, bağırsak kriptleri hayatta kalır, ancak başlangıçta çok daha küçük kürelerin oluşumuna neden olan hasar görür.

72 ila 120 saat arasında, tüm kriptlerden gelen enteroidler, belirgin merkezi lümenler ve tomurcuklanan yapılarla daha karmaşık hale gelir ve genel olarak azalmış kript büyüme verimliliğinin yanı sıra ciddi şekilde hasar görmüş bağırsak dokusundan türetilen enteroidlerde azalmış boyut ile birlikte daha karmaşık hale gelir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kript izolasyon kaplama prosedürleri, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Kaplama için toplanan kriptlerin, ayrışma fraksiyonunda kültür kontaminasyonu olasılığının artması nedeniyle, ayrışma fraksiyonlarından değil, yıkamalardan türetilmesi en iyisidir.

Bu yöntem aynı zamanda iskemi artı veya eksi reperfüzyondan kaynaklanan epitel yaralanmalarını tedavi etmek için ilaçların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gastrointestinal biyoloji alanındaki araştırmacıların, iskeminin epitel üzerindeki etkisini, özellikle translasyonel, klinik olarak ilgili büyük bir hayvan modelinde bağırsak kök hücreleri üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, reperfüzyonlu veya reperfüzyonsuz bağırsak iskemisi oluşturmanın yanı sıra in vivo yaralanmayı takiben 3D kültür için bağırsak kriptlerini izole etmeyi iyi anlamış olmalısınız.