Name: Bağırsak kök hücre izolasyon ve Segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin segmental bağırsak iskemi modelinde domuz kullanarak bağırsak kök hücre izolasyonu ve kültürü. Bu yöntem, iskemik hasar sonrası epiteliyal onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 ve bölümü Klinik Bilimler yayma fon tarafından desteklenmiştir

Bu deneyler için tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kültür için hazırlık
Not: Tüm reaktifler Malzemeler tablolistelenir. Belirli büyüme faktörü konsantrasyonları Tablo 1' de listelenmiştir.
<ol><li>0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltilerine saf deiyonize su (GKD2O) hazırlayın. Yeterince mix ve pH 7.4 NaOH ve/veya HCl çözümleri kullanarak için ayarlayın. Not: EDTA hisse senedi çözüm kadar her deneme önce taze olun.</li>
	<li>Ayrılma reaktif #1 (DR #1) aşağıdaki gibi hazırlamak ve yer buza: birleştirin fosfat tamponlu serum Ca2 + ve Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM olmadan Y27632 ve 1 X antibiyotik Antimycotic çözüm (Anti-Anti) Penisilin, streptomisin ve amfoterisin b içeren Not: Y27632 hemen doku toplama önce ekleyin.</li>
	<li>Ayrılma reaktif #2 (DR #2) aşağıdaki gibi hazırlamak ve yer bir 37 ° C su banyosunda: birleştirmek PBS Ca2 + ve Mg2 +, 0,5 M EDTA, 10 µM olmadan Y27632 ve 1 X Anti-Anti. Not: Y27632 hemen doku toplama önce ekleyin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi bağırsak epitel kök hücre (IESC) ortam hazırlamak: Mix 25 mL 1 X N2 ek ile DMEM/F12 Orta İleri, 1 X B-27 ek, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax ve 1 X Anti-Anti. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi düşük büyüme faktörü membran matris (matrix) ve tamamlayıcı büyüme faktörleri ana karışımı hazırlar: matris buz çözme. Bir microcentrifuge tüp 100 ng/mL eklemek rekombinant insan kafa, 500 ng/mL rekombinant insan R-Spondin 1, 50 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng/mL rekombinant insan Wnt3a, 10 mM nikotinamid, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 ve 2.5 µM glikojen sentaz 3 kinaz inhibitörü (GSK3i, CHIR99021). Matrix çözdürülen (ana mix yapma) büyüme faktörü karışımı ile ek ve buz üzerinde depolamak. Not: Bu kaplama sırasında artifakı içinde matris patty yaratacak gibi hava kabarcıkları tanıtımı önlemek dikkatli olun.</li>
	<li>24-iyi doku kültürü çanak hücre izolasyon yordamları başlatmadan önce 37 ° C kuluçka önceden ısıtmak.</li>
</ol>2. cerrahi modeli iskemi ve doku Takibi
<ol><li>Kullanım sekiz on haftalık Yorkshire için (önerilen) her iki cinsiyetten domuzlar olacak. Ameliyat öncesi tüm yem 16-18 h kaldırın. Domuzlar her zaman su erişimine izin verir.</li>
	<li>Varmak için domuz zamanlamak en az 48 saat önce deneyler için çevre calıştıkları izin vermek için. Not: eğitimli veteriner ve/veya Laboratuvar teknisyenleri lisanslı bir veteriner tarafından denetimli rutin hayvan bakımı ve anestezik yordamları ile ilgili yardım sağlar.</li>
	<li>Xylazine domuzla premedicate (1.5 mg/kg intramüsküler (IM)) ve ketamin (11-20 mg/kg (IM))15. Sonra kullanan kişi, domuz orotracheally tüp takacağım.</li>
	<li>%100 O2 ötenazi zamana kadar buharlaşmış isoflurane (% 2-5) ile genel anestezi altında domuz korumak.</li>
	<li>Bir intravenöz (IV) kateter (önerilen kulak ven) yerleştirin ve bir yedek sıvı lactated ringers çözüm 15 mL/kg bakım oranında gibi yönetmek/s.</li>
	<li>Rutin Nabız oksimetri, elektrokardiyografi ve dolaylı tansiyon ölçümleri15de dahil olmak üzere izleme anestezik gerçekleştirin. Domuzun solunum hızı ve çaba izlemek ve el ile veya bitiş tidal CO2 55-60 mmHg üzerinde çıkarsa gerektiği gibi mekanik havalandırın. Not: Uygun anestezi kalp hızı (aralığı 80-130 atım/dk), non-invaziv kan basıncı (ortalama arter basıncı 75-100 mmHg) ve solunum hızı (10-25 nefes/dak)16ve periyodik kontrol eğilimlerin sürekli izleyerek doğrulanır çene ve anal sesi olmaması için. Anestezi derinliği derecede kas gevşemesi ve kas fasciculation cerrahi uyarıcı takip tarafından değerlendirilecektir olabilir. Oküler reflekslere genellikle hiçbir değeri16tane vardır. Analjezi kurumlar IACUC ilkesi tarafından belirtilen şekilde sağlanabilir. Bu durumda, buprenorfin gibi bir opioid ameliyat sırasında yönetilebilir.</li>
	<li>Domuz ısıtma yastığını yerleştirin ve dorsal recumbency cerrahi işlem için dizginlemek.</li>
	<li>Ventral karın tıraş ve cerrahi scrub (klorheksidin çözüm) ve izopropil alkol kullanarak hazırlayın.</li>
	<li>Karın erişmek için göbeğini merkezli bir neşter bıçak kullanarak bir 8-10-cm ventral ensizyon olun.</li>
	<li>İnce bağırsak (değişir) yaklaşık 40 cm oral ileocecal kavşağı için tanımlayın. Çepeçevre bağırsak iki kez birleştirilmesi (ligasyon) tarafından 10 cm uzun döngüler değişir betimlemek, sonraki oluşturmadan önce her bağ arasında bir cm 10 cm (Şekil 1) sözlü olarak bulunan döngüler.</li>
	<li>Her zaman noktası iskemi iki döngü her diğer, iskemi diğeri iskemi için bitişik reperfüzyon bir ek 1 h ile isterseniz oluşturun. Tam iskemi (damar veya damarlar akımı) oluşturmak için kelepçe veya mezenterik damarlara bulldog vasküler kelepçeler, eğri Halstead sivrisinek hemostats veya 2-0 absorbe olmayan ipek 1, 2, 3 ve 4 h için kullanarak ligate ve kelepçeler 1 h için Kaldır reperfüzyon, isterseniz. Not: Yazarlar iskemi tüm döngüler ile 4 h iskemik döngü başlayarak sırayla oluşturulur ve proksimale (Toplam ameliyat süresini en aza indirmek için) taşıma ilerledi. İskemik barsak segmentleri komşu bitişik döngüler zarar verebilir olasılığını adrese, iskemik döngüler sırasını farklı olabilir. Bu toplam cerrahi zaman değiştirebilir. Not: Reperfüzyon zaman dilimi faiz ya da terapiler reperfüzyon dönemde test istiyorsanız araştırma sorusu dayalı çeşitli olabilir. Ancak, doku hasarı süreleri iskemi yalnız artan daha ağır hale geldikçe, reperfüzyon hasarı olasılığı daha fazla epitelyal yaralanma için katkı sağlamamaktadır. Reperfüzyon büyük olasılıkla iskemik yaralanma hafif dönemleri takip bir rol oynuyor.</li>
	<li>İskemi zaman puan arasında karın veya kapalı steril bir havlu ve/veya bir havlu kelepçe kullanarak kapalı tutun. Not: Bu deneme için tek bir hayvan içinde sekiz iskemik kesimleri oluşturulabilir. Bir ek jejunal segment, en az 5-10 cm bir iç normal denetimi olarak hizmet verecek son iskemik döngü, proksimal tanımlayın.</li>
	<li>Yaklaşık üç mezenterik gemi her bulldog damar kıskacı veya eğri Halstead sivrisinek hemostat engel. Çünkü damarları kolayca travma hemostat uygulama sırasında özen göstermelidir. Kelepçeler jaws içinde gemiler yığmak deneyin.</li>
	<li>Deney, Fentobarbital 85-100 mg/kg IV ile aşağıdaki ötenazi sonunda ölüm yok auscultated kalp atışı ve Korneal refleks kaybı ile onaylandıktan sonra metzenbaum makas, kullanarak doku tüm döngüler toplamak. Denetim biteviye-in normal değişir en az 5 - 10 cm son iskemik döngü için proksimal toplayarak başlatın.</li>
	<li>Ayrı ve döngüler her yaralanma zaman noktasından crypt yalıtım için hazır kadar buz gibi PBS küçük kaplarda saklayın. Not: arzu edilirse olun iskemik yeterince Histoloji ve bağırsak kök hücre kültür ayrı örnekleri bölmek için döngüler; Ancak, yazarlar döngüler yaklaşık 10 cm uzunluğunda büyük hemorajik olmak büyük olasılıkla olduğunu bulmuşlardır.</li>
</ol>3. yeraltı türbesi (kök hücre) izolasyon iskemik ve denetim döngüler
<ol><li>İnce bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için bir 20'lik tel ve doku forseps kullanarak her döngü tersine çevirin. Üst ve alt kısımlarında döngü için güvenli bir şekilde tel dikiş (2-0 absorbe olmayan ipek veya eşdeğeri) kullanarak bağlayın.</li>
	<li>İnversiyon, her döngü buz soğuk PBS luminal enkaz kaldırmak için durulayın.</li>
	<li>Örnekleri hemen DR #1 30 dakika buzda içeren 50 mL konik tüpler içine koyun.</li>
	<li>Denetim ile başlayan döngüler toplamak ve süreleri iskemi artırılan döngüler ile izleyin. Döngüler daha az hasarlı doku (yani kontrol ve 1 h iskemik doku) dan zorla, en iyi sonuç için kol dayama sarsılmış. Ağır hasarlı doku (3 ve 4 h iskemi) dokulardan yavaşça sarsan veya sadece çok fazla sallayarak crypt bozulma ve ek doku imha neden olur gibi ters gerekir. Tüpler sarsıldı veya buz ise her 5 dk ters.</li>
	<li>Örnekleri 10 min 37 ° C su banyosu için DR #2 aktarın. Sallamak ya da tüpler her 5 dk ters çevir.</li>
	<li>Dokular aktardıktan sonra DR #1 süpernatant EDTA kaldırmak için 2-4 h hasarlı döngüler içeren konik tüpler (5 min için 200 x g) santrifüj kapasitesi. Bu dokularda oldukça zarar görmüş gibi kriptalarının zaten ayrışmış olmak mümkündür. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS (5 mL) küçük bir hacmi ile resuspend ve 3.9 adıma geçin.</li>
	<li>Örnekleri DR #2 kaldırın ve doku örnekleri doğrudan 25 mL soğuk PBS buz (etiket yıkama #1 olarak) yerleştirin. Örnekleri 60 rpm'de buzda bir orbital çalkalayıcı yerleştirin. Devam sallamak veya her tüpün 30 için ters çevir'i s her 2-5 dak.</li>
	<li>2-4 h dan içeren DR #2 Konik tüpler dokular, spin aktardıktan sonra EDTA süpernatant (5 min için 200 x g) kaldırmak için döngüler zarar görmüş. Bu dokularda oldukça zarar görmüş gibi kriptalarının ayrışmış olmak mümkündür. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS (5 mL) küçük bir hacmi ile resuspend ve 3.9 adıma geçin.</li>
	<li>Yıkama # 1 (veya DR) 50 µL aliquot kaldırma crypt ayrışma derecesi ve enkaz miktarını denetlemek için. Bir yeni 50 mL konik tüp içine yerleştirin doku (yıkama #2, #3, vb) olduğu gibi kriptalarının en az enkaz ve villus ile izole olana 25 mL soğuk PBS ve shake ile dolu. Not: Sağlam kriptalarının ve en az enkaz ile temiz bir kısmını yalıtmak için hedeftir. Her ek yıkama ancak çok fazla sallayarak ikincil doku/hücre zarar görmesine neden başlayacak hücreleri temizler. Ayrıca, Eğer kriptalarının yıkama adım ve bir ayrılma reaktif adım kaplama en azından kirlenme ile en iyi sonuçları elde.</li>
	<li>Kalan dokuyu ve 50 mL konik boru 200 x g de süpernatant kaldırmak için 5 dakika santrifüj kapasitesi sonra crypt Pelet PBS (5 mL) küçük hacim içinde kalan resuspend.</li>
	<li>Ters bir mikroskop kullanarak, 50 µL aliquots kriptalarının/kesir sayısını belirlemek için her örneği inceleyin. Bu son matris patty boyutu olarak 50-100 kriptalarının/50 µL, hedeftir. Not: çok yoğun bir örneğiyse, istenen konsantrasyon ulaşılana kadar soğuk PBS eklemeye devam edin. Örnek çok seyreltik, istenen crypt verim ulaşmak ve ayarlamak için gerekli aliquots sayısını belirleyin.</li>
	<li>Aliquot uygun birimlerin microcentrifuge tüp içine kriptalarının (aliquot gözlemler tarafından saptanır). Örneğin, = 150 µL örnek 50 kriptalarının/50 µL sonra X 3 çoğaltır patty başına aliquot 50 µL varsa / microcentrifuge tüp. = 300 µL/tüp ise örnek sadece 25 kriptalarının/50 µL sonra 2 aliquots gerekli olan / patty X 3 çoğaltır.</li>
	<li>Pelet kriptalarının 200 x g 4° C'de 5 min için de</li>
	<li>Yavaşça pelleted kriptalarının uygun birim ana Mix (iyi başına 50 µL) ile resuspend. Hava kabarcıkları oluşturmadan, 15 kez pipetting hızla tarafından iyice karıştırın. Not: önceden ana mix aspirating önce soğuk steril PBS pipet ucuyla cool. Bu ana mix yayılan tutmak yardımcı olacaktır. İpuçları da buzdolabında muhafaza ve mahallede hemen kullanmak için önceden yerleştirilir.</li>
	<li>Bir 50 µL ana mix artı crypt damlacık her şey önceden ısıtılmış 24 iyi plaka merkezine dağıtmak.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk kültür plaka kuluçkaya</li>
	<li>Her matris patty ile 500 µL / de medyanın IESC (hiçbir ek büyüme ana karışımı içinde yer alır gibi gün 0 gerekli faktörleri) yerleşimi.</li>
	<li>500 µL steril PBS nem korumak için plaka üzerinde yaptı kullanılmayan herhangi bir kuyu ekleyin.</li>
	<li>Kaplama kriptalarının gün 0 saymak. Not: Ön ızgara her hücre kültür plaka kadranın daha doğru sayma sağlamak için yardımcı olur.</li>
	<li>Enterospheres her 24 saat sayısını ve her gün enteroid gelişimi için izleyebilirsiniz.</li>
	<li>Büyüme faktörleri her 48 de her h. için her 96 h IESC medyayı çıkarın ve 500 µL taze medya (büyüme faktörleri sonra medyaya eklenmelidir) yerine ekleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14740765">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li>
<li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair%3A+the+best+offense+is+a+good+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+models+of+digestive+disease%3A+the+future+of+large+animal+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids-Current+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31(2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li>
<li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Swine-in-the-Laboratory-Surgery-Anesthesia-Imaging-and-Experimental/Swindle-Smith/p/book/9781466553477">Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).</li>
<li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/25432600">Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed</a>. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).</li>
<li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li>
<li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li>
<li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li>
<li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ischemia%2Freperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li>
<li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li>
<li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CCN1+%28Cyr61%29+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li>
<li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27213580">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Domuz manken segmental intestinal iskemi gelişimini doku yaralanma aynı hayvan içinde birden fazla zaman puan incelenmesi için izin vererek önceki fare modelleri genişletir. Uygun damar ligasyonu, doku reperfüzyon ve başarılı crypt hücre kültürü de dahil olmak üzere bu protokol birkaç kritik tartışma noktaları vardır.
Uygun damar ligasyonu tam iskemi modeli oluşturulması esastır. Dikişi düzensiz bağlı veya kelepçe tamamen, kandan sıkılır değil kalın duvarlı arter doku girmeye devam edebilir ve ince duvarlı ven çöküşü nedeniyle çıkılamıyor. Bu kan ekstravazasyonu içine lamina propria ek doku hasarına neden olur. Ancak, iskemik yaralanma okudu türüne bağlı olarak, tam veya hemorajik iskemi istenen. Örneğin, bağırsak nakli sürecinde bağırsak tamamen tam intestinal iskemi sonuçları yordamı rezeksiyon aşamasında vasküler kaynağı (arter ve ven) ayrılır. Ne zaman bıçaklanmasından bir bağırsak volvulusu gibi bir olay sırasında bükülmüş, alternatif olarak, ancak, venöz dönüş kez önce arteryel kaynağı olmak önce doku içinde ek kan yol tıkalı, böylece yaratma engel hemorajik iskemi.
İskemik yaralanma villus ucunda başlayan ve mezar odası3Bankası aşağı uzanan doku hasarı sonuçlanır. İskemi sırasında enerji adenozin trifosfat şeklinde kullanılmak üzere devam ediyor ve metaboliti hypoxanthine oluşturur. Doku oksijen ile Reperfüze ne zaman, hypoxanthine ksantin oksidaz tarafından metabolize olur ve süperoksit serbest radikallerin mukozal hasar ve cazibe doku nötrofil17,18zarar yol üretir. Mukozal vasküler mimari aynı zamanda ksantin oksidaz, değişen ifade tür farklılıklar neden reperfüzyon hasarı3derecelerde. Kedi ve kemirgen iskemi-reperfüzyon reaktif oksijen metabolitleri19,20ila reperfüzyon hasarı için daha duyarlı modellerdir. Buna ek olarak, domuz daha az ksantin oksidaz ve bu model daha karşılaştırılabilir insan intestinal iskemi21yapmak bu nedenle daha az reperfüzyon hasarı için bulunamadı. Şu anda, nakavt veya bağırsak yaralanma çalışmaya transgenik domuz modelleri kullanımı, bu bu modelin büyük bir sınırlama yaparken tarif edilmiştir değil. Hastalık süreci uygun hayvan modeli seçimi bağlıdır veya belirli koşul araştırmacı çalışma istiyor. Örneğin, fare modellerinde en iskemik yordamlar 45-60 dk23ise maksimum 6 s iskemik yaralanma domuz modelleri açıklanan22, olmuştur.
Kültür epitel kurtarma çalışmaları için gelen normal ve ischemically zarar görmüş bağırsak bağırsak kriptalarının başarılı yalıtım sağlar. Bu sistem araştırmacı olarak değil damar kaynağı ya da göz önünde bulundurulacak bağışıklık hücre bileşeni benzersiz olarak tek başına, epitel odaklanmak izin verir. Bu epitel hücre etkileşimleri ve yaralanma yanı sıra farklı büyüme faktörleri veya cerrahi veya aşağıdaki crypt yalıtım sırasında kültür medya ilave tarafından yönetilen tedavi yanıtı aşağıdaki kurtarma çalışması için bir fırsat sunuyor. Bu adım en zor kalır, ağır hasarlı döngüler izolasyonu gerektirdiği kadar nazik sallayarak ve EDTA içeren çözümleri hızlı çıkarma kriptalarının gerekirse zamanından önce ayrışmış haline. Bu döngü bağırsak iyice yıkanır değil eğer kriptalarının kültüründe kontamine potansiyeline sahip. Sonuç olarak, antibiyotik antimycotic çözüm her iki DR çözümlerine ek olarak IESC medya için eklendi. Başka bir tartışma noktası normal bir denetimi toplanan bağırsak üzerinde duruluyor. Hayvanları anestezi ile inflamatuar aracılar iskemi için ikincil dolaşan olasılığı ile birlikte sistemik doku perfüzyon olası değişiklikler geçmesi gibi hatta "normal" Denetim doku gerçek kontrolü temsil etmeyebilir. Bu deneylerde, bu denetim doku doku için fena halde ve histolojik olarak karşılaştırılabilir iskemi (Gonzalez, L.M., yayınlanmamış veriler, 2017) diğer deneylerde geçmesi değil hayvanlardan çıktı notun var.
Özet olarak, bu yöntem bir tekrarlanabilir model yakından ne insan iskemik yaralanma oluşur modelleri domuz intestinal iskemi, açıklar. Ayrıca, iskemik döngüler bağırsak kök hücrelerden yalıtım anlatılan, hangi çalışma epitel onarım ve olası tepki kültür tedavi için hizmet vermektedir.

Bağırsak iskemik yaralanma, azalmış oksijen durumu bir azaltma veya bağırsak, kan akışını tam tıkanıklığı nedeniyle sonucu kalır morbidite ve mortalite insan ve hayvan hasta1,2önemli bir nedenidir. Sonraki inflamasyon ve hücresel infiltrasyon, birlikte iskemik hasar mukozal bariyer uyuşmazlığına yol açar. Mukozal bariyer bakteriyel translocation ve ilişkili toksinler önleme sistemik dolaşım3,4içine için çok önemlidir. İskemik doku sonraki reperfüzyon hasarı5azdırmak reaktif oksijen türlerine zarar verme oluşumuna neden. İntestinal iskemi nadiren önlenebilir olduğu için en güncel araştırma teknikleri iskemi erken teşhis ve reperfüzyon hasarı veya hedef mukozal onarım azaltmak yeni tedavi yaklaşımları gelişimi için ilerleyen üzerinde odaklanmıştır.
Hayvan modelleri kapsamlı iskemi-reperfüzyon hasarı temel bilim bilgimizi genişletmek ve translasyonel araştırma için şart kalmak için kullanılmaktadır. Kemirgen modelleri en çok kullanılan yeteneklerini genetik olarak işlenmiş6olması nedeniyle olmuştur. Son zamanlarda ancak, özellikle domuz, büyük hayvan modellerinin kullanımı nedeniyle bir çok avantaj insanlar7,8domuz anatomik ve fizyolojik benzerliklerinden dahil olmak üzere gelecek translasyonel etütler savunduğu. Yaralanma modelleriyle iskemi-reperfüzyon hasarı çalışma ve tam damar tıkanıklığı, düşük akım iskemi ve segmental mezenterik damar tıkanıklığı için geliştirilmiştir. Bu modellerin tam bir inceleme Ancak yazarlar son bir daha gözden geçirme3okuyucularına doğrudan bu makalenin bölge dışında var.
Vivo modelleri yanı sıra, ex vivo hücre kültür sistemlerinin kullanımı bağırsak homeostazı ve yaralanma takip onarım çalışmaya gelecek vaat eden bir araç sunar. Bağırsak kök hücre hücresel proliferasyonu ve ciro Bağırsak epitel astar için sorumludur. Ne zaman normal ya da yaralı bağırsak izole, bağırsak kök hücre kültüründe korunabilir ve bir aracı veya kök hücre ve epitel hücre biyolojisi çalışmaya modeli olarak hizmet. İzole etmek ve bunlar üç boyutlu kurmak için yöntemler kültür sistemleri (enteroids ve ne zaman küçük ve büyük bağırsak sırasıyla türetilmiş colonoids olarak adlandırdığı) türler ve organ sistemleri9,10 çeşitli için tarif var ,11,12,13. Özellikle, gastrointestinal sistem içinde modeli gastrointestinal hastalık kanser, patojen enfeksiyon ve iltihabi bağırsak hastalığı14dahil olmak üzere bu kültür sistemleri kullanılmıştır. Şu anda yalıtım ve bağırsak kök hücrelerden ischemically yaralı bağırsakta herhangi bir tür bakımından açıklayan hiçbir raporlar vardır. Bu nedenle, burada biz modelindeki tekrarlanabilir yaralanma ve yeteneğini ek çalışma için normal ve ischemically yaralı bağırsak bağırsak kök hücreleri izole etmek neden olan bir roman, büyük hayvan domuz intestinal iskemi süreci tanımlamak Kurtarma ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, Ca2+, Mg 2+ ücretsiz</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Seyreltik 1:10</td></tr><tr><td>Damıtılmış, deiyonize su (ddH2O)</td> <td>EDTA ve PBS</td>Dimetil Sülfoksit (DMSO) <td></td><td></td> hazırlamak için kullanılır</tr><tr><td></td><td>) Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamene tetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Her deneyden önce taze yapın; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>İleri DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ek Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ek Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin / Amfoterisin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti çözelti</td></tr><tr><td>Rekombinant insan Wnt-3a</td><td>R & D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan Rspondin1</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan Noggin</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan EGF</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Kimyasal</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>İnsan [leu] 15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Su, WFI Kalite</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Steril su (SW) olarak adlandırılır; büyüme faktörü stokları için</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrisi, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Fenol kırmızı içermeyen</td></tr><tr><td>24 Kuyu Kültür Tabağı</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Konik Tüp, 50 ml&nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>Neşter Sapı</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Karbon Çelik Cerrahi Bıçak, No. 10</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Doku Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Doku Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501752</td><td>Kavisli veya düz</td></tr><tr><td>Metzenbaum Makas</td><td>Dünyası Sivrisinek</td> Forseps <td>501739 leri</td><td></td></tr><tr><td>, Kavisli</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>503724-12</td><td>Kavisli veya düz (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Kelepçe</td><td>Çalma Co.</td><td>52120-40P</td><td>Düz İpek</td></tr><tr><td>, 2-0&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Benzer herhangi bir marka kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Havlu Kelepçeleri</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>İğne Tutucu</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Tel sütür, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Kullanmadan önce kesin ve düzeltin.</td></tr><tr><td>Cerrahi Havlular</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Benzer herhangi bir ürün kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Emzirilmiş Zil Sesi</td><td>Çözümü Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antiseptik ovma (%4)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Benzer herhangi bir marka kabul edilebilir</td></tr><tr><td>İzopropil Alkol %70</td> <td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Benzer herhangi bir marka kabul edilebilir</td></tr><tr><td>IV kateter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>Damarın</td></tr> <tr><td>boyutuna bağlı olarak 20 g veya 24 g gerekebilirKsilazin (100 mg / ml)</td> <td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (100 mg / ml)</td> <td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Kontrollü ilaç</td></tr><tr><td>İzofluran çözeltisi</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Ölümcül Artı Ötenazi Çözeltisi (390 mg / ml))</td> <td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Birden fazla Pentobarbital Sodyum markası mevcuttur.</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı&nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Çekirdek Isıtma Sistemi; diğerleri mevcuttur.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Kabul edilebilir herhangi bir eşdeğer izleme ekipmanı parçası</td></tr><tr><td>Buharlaştırıcı&nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Y parçalı bir Daire Sistemi kullanılması önerilir; birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Sıvı Pompası</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Erik A+; Benzer herhangi bir üretici tavsiye edilir.</td></tr></tbody></table>

bağırsak kök hücre izolasyon ve segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Önemli bir nedeni, morbidite ve mortalite insan ve hayvan hastalıklarıyla ilgili hastalarda intestinal iskemi kalır. Kan akımı ve bu nedenle oksijen azalmıştır bağırsak için birçok hastalığı süreçleri intestinal iskemi neden. Bağırsak bariyer kaybı ve hasar için temel alınan doku bu götürür. Bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının tabanında bulunan ve homeostasis ve aşağıdaki yaralanma sırasında bağırsak yenilenmesi için sorumludur. Ex vivo hücre kültürü teknikleri üç boyutlu epitel organ benzeri sistemlerde büyümeyi desteklemek kültür koşulları kurarak epitel kök hücre etkileşimleri başarılı çalışma için izin ("enteroids" olarak adlandırılan ve" colonoids"küçük ve büyük bağırsak, sırasıyla). Bu enteroids crypt ve villus benzeri etki alanları oluşmaktadır ve olgun epitel içinde bulunan hücre türlerini içerecek. Tarihsel olarak, fare modelleri bağırsak yaralanma çalışmaya yeniden kullanılmıştır. Ancak, bir domuz modeli benzerlik boyutu gibi gastrointestinal anatomi ve Fizyoloji olan insanlar için de dahil olmak üzere birçok avantaj sunar. Bir domuz modeli kullanarak, biz hangi intestinal iskemi gelen bir segmental döngüler içinde tek bir hayvan-ebilmek var olmak mahluk, farklı çalışma etkinleştirme puan iskemik yaralanma zaman ve içinde vivoonarmak bir protokol kurmak. Ayrıca, epitel tamir, kök hücreleri tarafından modülasyonlu sürekli çalışma için izin yalıtmak ve bağırsak, iskemik döngüler bağırsak kök hücrelerden kültür için bir yöntem tarif ex vivo.

Tam intestinal iskemi dikiş veya Şekil 1' de gösterildiği gibi kelepçeler ile damar tıkanıklığı kullanarak küçük bağırsak döngüler içinde oluşturuldu. Kıskaç serbest bırakarak, reperfüzyon kontrollü bir süre, isterseniz sonraki reperfüzyon hasarı ek çalışma için izin gerçekleştirilebilir. Ötenazi kadar en az komplikasyon ile işlemi sırasında tüm hayvanlar hayatta. En sık kullanılan cerrahi komplikasyon hipotansiyon, dobutamin gibi pozitif inotrop takviyesi ile çözülmüş oldu.
Doğru olarak gerçekleştirdiyseniz, iskemik yaralanma bağırsak villus ucunda başlar ve aşağı içinde crypt iskemi artar (Şekil 2) süresi olarak geçirilir. Kan damarları değil bakmaksızın veya eşit klempe cerrahi tekniği ile bir yaygın hata oluşabilir. Bir hemorajik iskemi (Şekil 3), hangi ek kan doku sızmak izin arter önce ince duvarlı ven çöker sonucudur. Bu ağır soluk bir yüzeye tam iskemi (Şekil 3, sağ) sırasında karşılaştırıldığında bir koyu mor serozal yüzey (Şekil 3, sol) olarak görülüyor.
İskemik bağırsak döngüler kaldırılmasını, bağırsak kriptalarının ayrılma protokol (Şekil 4) sonrası başarılı bir şekilde izole edildi. Beklendiği gibi daha ağır hasarlı timepoints üzerinden kriptalarının kez kırık vardı (f; parçası) ve yeraltı türbesi kesirler bulunan bu Hayır uygulandı karşılaştırıldığında daha fazla arka plan hücresel enkaz veya hafif hasar. İletişim kuralı sırasında ağır yaralı bağırsak yavaşça alttaki dokulara ek zarar görmemesi için sarsılmış gerekir. Sallayarak çok kabaca daha fazla crypt hasar ve ek bozulma sonucu EDTA içeren DR çözümlerinde biten kriptalarının çoğunluğu neden olabilir.
Kaplama, iskemi tüm zaman noktalarından kriptalarının hayatta kalmak ve Kültür (Şekil 5) kurulan haline edebiliyoruz. Ne zaman normal ve hafif hasarlı bağırsak kriptalarının kültür, enterospheres form içinde 24-48 h kaplama. Ağır iskemik hasar (3 ve 4 h), bağırsak kriptalarının hayatta ama, çok daha küçük küreler oluşumunda başlangıçta kaynaklanan hasar. 72-120 h tarafından enteroids açık Merkezi lümen ve tomurcuklanma yapıları ile daha karmaşık hale gelir. Genel olarak, azalan büyüme verimlilik kriptalarının yanı sıra ciddi bir şekilde zarar görmüş bağırsak dokusundan (Gonzalez, L.M., yayınlanmamış veriler, 2017) elde edilen enteroids azalmış bir boyutu olduğunu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Resim 1 : Tam intestinal iskemi bir domuz modelinde cerrahi modeli. A) exteriorized normal domuz değişir. B) mezenterik damarları dikiş intestinal iskemi oluşturma tane. C) istenirse doku reperfüzyon için izin vermek için buldozer vasküler kelepçeler kullanılarak oluşturulan iskemi. D) bağırsak damarlara hemen ardından vasküler kelepçeler kaldırılması. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Resim 2 : Tam intestinal iskemi uzun süreleri takip epitel zarar artan histolojik kanıt (Hematoksilen ve eozin (H &amp; E) leke). Hasar villus ucu kademeli kaybı tek hücre epitel tabakası, i. blunting ve ciddi yaralanma (4 s süresi) ile temel crypt aşağı uzanan hücresel hasar ile başlar. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Şekil 3 : Hemorajik iskemi brüt ve histolojik kanıtı. A) Brüt fotoğraf hemorajik iskemi (sol loop) ve tam iskemi (doğru döngü) karşılaştırma. Damarlara bakmaksızın değil veya eşit olarak sabitlenmiş, kan ek inflamasyon ve hasar sonucu dokular, sızmaya devam edebilirsiniz. B) H &amp; E görüntüleri süresi 1-4 h artan hemorajik iskemi. Tam iskemi ile görülen hücresel hasar yanı sıra kırmızı kan hücre infiltrasyonu çevreleyen lamina propria içinde kanıt yoktur. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Şekil 4 : Bağırsak kriptalarının iskemik ve normal bağırsak döngüler izole aliquots. Eksiksiz, bozulmamış bağırsak kriptalarının (yıldızlar) başarıyla bağırsak her döngü izole edildi. Beklendiği gibi daha fazla ağır hasarlı zaman noktalarından kriptalarının kez kırık vardı (f; parçası) ve yeraltı türbesi kesirler bulunan bu Hayır uygulandı karşılaştırıldığında daha fazla arka plan hücresel enkaz veya hafif hasar. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Şekil 5 : Zaman ders yalıtım ince bağırsak iskemik döngüler takip bağırsak kök hücre büyüme. Normal bağırsak kriptalarının kültüründe kaplama zaman içinde 24-48 h enterospheres kurdu. Ağır iskemik hasar (3 ve 4 h) ile kriptalarının hayatta ama çok daha küçük küreler başlangıçta oluştururlar. 72-120 h tarafından enteroids açık Merkezi lümen ve tomurcuklanma yapıları ile daha karmaşık hale gelir. 20 µm ölçek belirtilmediği sürece bar. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Büyüme faktörü</td>
			<td>Eritici</td>
			<td>Hisse senedi toplama</td>
			<td>Hisse senedi seyreltme</td>
			<td>Çalışma seyreltme</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>1 µg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kafa</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10mM asetik asit</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>2.5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: büyüme faktörü reaktif tablo. Büyüme faktörü hisse senedi çözümler ve bu protokol için kullanılan çalışma çözümleri Özeti.

Bu iletişim kuralı okuyucuların başarıyla gelen bir segmental intestinal iskemi domuz bir model kurmak ve daha sonra yalıtmak ve bağırsak kök hücreleri epitelyal onarım yaralanma aşağıdaki çalışma için kültür sağlayacaktır.

Bağırsak kök hücre izolasyon ve Segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak iskemisinin bağırsak epitel kök hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, kök hücrelerin yaralanmaya nasıl direndiği ve iskemik yaralanmayı takiben onarıma nasıl katkıda bulunduğu gibi kök hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, klinik bağırsak hastalığı ve onarımı için kullanılabilecek büyük bir hayvan modeli olmasıdır.Prosedürü gösteren, yüksek lisans öğrencisi Amy Stieler Stewart ve laboratuvarımdan bir araştırma uzmanı olan John Freund olacak. Sekiz ila 10 haftalık bir Yorkshire melezi domuzun göbek deliğinde ortalanmış karın üzerinde sekiz ila 10 santimetrelik bir ventral orta hat kesisi yapmak için bir neşter bıçağı kullanarak başlayın. İleoçekal bileşkeye yaklaşık 40 santimetre oral olan jejunumu bulun.Her ligatür arasında bir santimetre olacak şekilde 10 santimetre uzunluğundaki jejunum halkalarını tanımlamak için bağırsağı iki kez çevresel olarak bağlayın. Biri iskemi ve diğeri iskemi için olmak üzere birbirine bitişik iskemi zaman noktası başına iki döngü oluşturun ve ek bir saatlik reperfüzyon sağlayın. Tersinir tam iskemiyi indüklemek için, uygun deneysel süre boyunca klemp başına yaklaşık üç mezenterik damarı tıkamak için bulldog vasküler klempleri veya hemostatlar kullanın.İskemik dönem boyunca karnı kapalı tutun. Deneyin sonunda, önce son iskemik döngünün en az beş ila 10 santimetre proksimalinde normal jejunumun bir kontrol parçasını toplamak için Metzenbaum makasını kullanın, ardından geri kalan döngülerin toplanması gerekir. Her yaralanma zaman noktasından gelen ilmekleri, kript izolasyonuna kadar küçük buz gibi soğuk PBS kaplarında saklayın.Kript kök hücrelerini izole etmek için, mukozal yüzeyin açığa çıkması için ince bağırsağın her bir halkasını ters çevirmek için 20 gauge bir tel ve doku forseps kullanın. Her ilmeğin üstünü ve altını tele güvenli bir şekilde dikin ve her ters çevrilmiş ilmeği buz gibi soğuk PBS'de durulayın. Tüm luminal kalıntılar çıkarıldığında, numuneleri hemen her beş dakikada bir çalkalama ve ters çevirme ile 30 dakika boyunca buz üzerinde bir numaralı 30 mililitre ayrışma reaktifi içeren 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin.Kuluçka süresinin sonunda, numuneleri iki numaralı 30 mililitre ayrışma reaktifi içeren karşılık gelen 50 mililitrelik tüplere aktarın ve iki ila dört saatlik iskemik döngü numunelerini santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve ışık mikroskobu ile kript ilişkisinin derecesini ve kalıntı miktarını kontrol etmek için her numuneden 50 mikrolitrelik bir alikot kullanın. Daha sonra, numuneleri her beş dakikada bir çalkalama veya ters çevirme ile 10 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.Daha sonra numuneleri, her 30 saniyede bir ek manuel sallama veya ters çevirme ile iki ila beş dakikalık çalkalama için iki ila beş dakikalık çalkalama için 60 RPM'ye ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcıda buz üzerinde doğrudan 25 mililitre buz gibi soğuk PBS'ye aktarın. Çalkalama inkübasyonunun sonunda, kript ilişkisinin derecesini ve kalıntı miktarını kontrol edin ve numuneleri, sağlam kriptler minimum kalıntı ve villus ile izole edilene kadar çalkalamak için 25 mililitre soğuk PBS içeren yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Döngüler tamamen ayrıldığında, kalan dokuyu çıkarın, numuneleri santrifüjleme ile peletleyin ve kalan kript peletlerini beş mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin.Daha sonra, tüp başına 150 kripti ayrı mikrosantrifüj tüplerine alikot edin ve kriptleri mikrosantrifüjleme ile peletleyin. Önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak, peletleri oyuk başına 50 mikrolitre ana karışımla nazikçe yeniden süspanse edin ve ardından karıştırmak için 15 kez hızlı pipetleme yapın. Daha sonra, önceden kurtlanmış ve ızgaralı, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına 50 mikrolitrelik bir kript damlası dağıtın ve plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.30 dakika sonra, her bir matris köftesini bağırsak epitel kök hücre ortamının oyuğu başına 500 mikrolitre ile kaplayın, nemi korumak ve kaplanmış, sıfır gün kriptlerinin sayısını saymak için kullanılmayan oyuklara 500 mikrolitre steril PBS ekleyin. Her 48 saatte bir her kuyucuğa büyüme faktörleri ekleyin, süpernatanı her 96 saatte bir 500 mikrolitre taze büyüme faktörü takviyeli ortamla değiştirin. Tam intestinal iskemi ince barsak ilmeklerinde, gösterildiği gibi dikişler veya klempler ile damar tıkanıklığından yararlanılarak oluşturulur.Doğru yapılırsa, iskemik yaralanma bağırsak villusunun ucunda başlayacak ve iskemi süresi arttıkça kript içinde aşağı doğru göç edecektir. Cerrahi teknikle ilgili yaygın bir hata, kan damarları eşit şekilde bağlanmadığında veya klemplenmediğinde ortaya çıkabilir, bu da ince duvarlı damarın arterden önce çöktüğü ve ek kanın dokulara sızmasına izin verdiği hemorajik bir iskemi ile sonuçlanabilir. İskemik bağırsak döngülerinin çıkarılmasını takiben, bağırsak kriptleri, az önce gösterildiği gibi ayrışma protokolünü takiben başarılı bir şekilde izole edilebilir.Daha ciddi şekilde hasar görmüş zaman noktalarından gelen kriptler genellikle kırılır ve hiç hasar görmeyen veya hafif hasar görenlere kıyasla daha fazla arka plan hücresel kalıntısı içerir. Normal ve hafif hasarlı bağırsak kriptleri kültürde kaplandığında, enterosferler 24 ila 48 saat içinde oluşur. Şiddetli iskemik hasarla, bağırsak kriptleri hayatta kalır, ancak başlangıçta çok daha küçük kürelerin oluşumuna neden olan hasar görür.72 ila 120 saat arasında, tüm kriptlerden gelen enteroidler, belirgin merkezi lümenler ve tomurcuklanan yapılarla daha karmaşık hale gelir ve genel olarak azalmış kript büyüme verimliliğinin yanı sıra ciddi şekilde hasar görmüş bağırsak dokusundan türetilen enteroidlerde azalmış boyut ile birlikte daha karmaşık hale gelir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kript izolasyon kaplama prosedürleri, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Kaplama için toplanan kriptlerin, ayrışma fraksiyonunda kültür kontaminasyonu olasılığının artması nedeniyle, ayrışma fraksiyonlarından değil, yıkamalardan türetilmesi en iyisidir.Bu yöntem aynı zamanda iskemi artı veya eksi reperfüzyondan kaynaklanan epitel yaralanmalarını tedavi etmek için ilaçların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gastrointestinal biyoloji alanındaki araştırmacıların, iskeminin epitel üzerindeki etkisini, özellikle translasyonel, klinik olarak ilgili büyük bir hayvan modelinde bağırsak kök hücreleri üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, reperfüzyonlu veya reperfüzyonsuz bağırsak iskemisi oluşturmanın yanı sıra in vivo yaralanmayı takiben 3D kültür için bağırsak kriptlerini izole etmeyi iyi anlamış olmalısınız.

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Burada tarlada bu tekniğin standardizasyonu teşvik etmek mortalite olmadan tekrarlanabilir yaralanma ile sonuçlanan farelerde bağırsak iskemi-reperfüzyon ayrıntılı prosedürü açıklar. Bağırsak iskemi-reperfüzyon hasarının Bu model yaralanma ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Bağırsak İskemi-reperfüzyon Hasarı Murin Modeli

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Burada, telositler de dahil olmak üzere murin bağırsak mezenkimini izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bunlar, büyümeyi desteklemek ve orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtmak için fare veya insan kaynaklı organoidlerle birlikte kültür gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

Kemirgenlerde intestinal iskemi-reperfüzyon hasarının (IRI) yaygın olarak kullanılan bir cerrahi modelinin nasıl oluşturulacağını açıklıyoruz. Prosedür, superior mezenterik arterin tıkanmasını ve ardından kan akışının restorasyonunu içerir. Bu model, hem veterinerlik hem de insan tıbbında bağırsak IRI'sinin tıkayıcı nedenlerini araştıran çalışmalar için yararlıdır.

Superior mezenterik arterin tıkanması yoluyla intestinal iskemi-reperfüzyon hasarının kemirgen modeli

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Burada, kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin veren 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Bu protokol, adacık izolasyonu ve saflaştırılması için bir domuz pankreasının satın alınması için adım adım bir kılavuz sağlar.

Adacık izolasyonu için domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve izolasyonu

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Öğrenin segmental bağırsak iskemi modelinde domuz kullanarak bağırsak kök hücre izolasyonu ve kültürü. Bu yöntem, iskemik hasar sonrası epiteliyal onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

Bağırsak kök hücre izolasyon ve Segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür

Daha fazla video keşfet