Termal Nanoimprinting teknik ve insan endotel hücreleri koloni oluşturan yanıt testi ile taranması degrade Nanopattern imalatı

Bu tekniğin temel avantajı, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip gradyan desenleri üretebilmesi ve parazitlerin gözlemsel yapılarına hücre tepkisinin taranmasına izin vermesidir. Fiziksel stimülasyona gözlemlenen yanıt henüz tam olarak keşfedilmemiştir. Yöntemimizin bu bilinmeyen mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemli bir araç olacağına inanıyoruz.

Başlamak için, elektro-parlatma solüsyonunu içeren çift cidarlı bir beheri bir sirkülatöre bağlayın ve sıcaklığı yedi santigrat dereceye ayarlayın. Çözeltiyi, sıcaklık yedi santigrat dereceye düşene kadar en az 30 dakika karıştırarak bırakın. Ultra saf alüminyum plakayı ve karbon karşı elektrodu, timsah klipsleri ve bakır tel kullanarak elektro-parlatma solüsyonuna daldırın.

Karbon karşı elektrottaki alüminyum plakanın konumunu birbirine bakacak şekilde ayarlayın. Alüminyum plakayı pozitif terminale bağlayın ve karbon karşı elektrodu doğru akım güç kaynağının negatif terminaline bağlayın. 20 voltluk bir voltaj uyguladıktan sonra, alüminyum plaka pürüzlü, parlaksız bir yüzeye sahip olmaktan gümüş renkli ayna benzeri bir yüzeye sahip olur.

Birincil anotlamayı gerçekleştirmek için, bir litre elektroliti iki litrelik çift cidarlı bir behere dökün. Cilalı alüminyum plakayı ve karbon karşı elektrodu, bakır tel içinde timsah klipsleri ile çözeltiye daldırın. U şeklindeki bir kaide üzerine dikey bir şaft takın.

Metal cl kullanarak bir üstten karıştırıcı ve bir pervane takın.amps. Pervanenin pervanesini her iki elektrotun alt ucuna yakın bir yere yerleştirin. Üst karıştırıcının dönüş hızını 200 ila 300 rpm arasında ayarlayın ve 16 saat boyunca karıştırarak 195 voltluk bir voltaj uygulayın.

Birincil eloksallamanın ardından, alüminyum levhanın rengi gümüşten griye değişir. Alümina kaşıntısı yapmak için, eloksallı alüminyum plakayı aşındırma çözeltisine daldırın. Beherin üst kısmı alüminyum folyo ile kapatıldı ve en az 10 saat karıştırılmasına izin verildi.

Aşındırma adımı sırasında, alüminyum plakanın rengi griden beyaza değişir. İkincil anotlama için, birincil anotlama ile aynı deneysel koşulları ayarlayın ve tekrar altı saat boyunca 195 voltluk bir voltaj uygulayın. İkincil eloksallamanın ardından, alüminyum levhanın rengi beyazdan griye döner.

Gradyan gözenek genişletmeyi gerçekleştirmek için önce bir fosforik asit çözeltisi içeren çift cidarlı kabı sirkülatöre bağlayın ve sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlayın. Beherin yanına dikey olarak doğrusal bir hareketli aşama yerleştirin ve doğrusal aşamanın hareketli kısmına bir braket takın. Doğrusal aşamanın hareketli kısmını başlangıç konumuna ayarlayın.

Braketin klipsini takın ve eloksallı alüminyum plakayı yükleyin. Alüminyum plakanın konumunu manuel olarak manipüle edin, böylece alüminyum plaka çözelti yüzeyinin hemen üzerine gelecektir. 120 nanometre ila 200 nanometre arasında bir boyut gradyanına sahip 35 milimetrelik bir AAO kalıbı yapmak için alüminyum plakayı 120 dakika boyunca saniyede dört nokta sekiz altı mikron hızında yavaş yavaş çözeltiye daldırın.

Alüminyum plakanın çözeltinin yüzeyine temas ettiği anda bir kronometre başlatın. 100 dakika geçtikten sonra, AAO kalıbının yarısı çözelti içinde olmalıdır. GP 200 ila 280 ve GP 280 ila 360 kalıpları yapmak için, GP 120 ila 200 kalıbın tüm alanını sırasıyla iki ila dört saat gözenek genişletme solüsyonuna daldırın.

AAO kalıbını ve piranha çözeltisini metalik olmayan bir cımbız kullanarak 30 saniye daldırın. AAO kalıbını deiyonize su ile birkaç kez durulayın. Kalıbı 30 dakika deiyonize suda bekletin ve 30 dakika daha metil alkole koyun.

AAO kalıbını üç saat boyunca vakum altında tamamen kurutun. Kendinden montajlı tek katmanlı biriktirme için, AAO kalıbını 57 mililitre filtrelenmiş ve hekzan ve 100 mililitrelik bir behere daldırın. Daha sonra 2.9 milimolar bir HDFS çözeltisi yapmak için N hekzanına üç mililitre HDFS stok çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun ilerlemesi için 10 dakika bekleyin.

AAO kalıbını taze ve hekzana aktardıktan sonra, AAO kalıbını 60 mililitre metoksi-nonaflorobütan içine batırın. Fiziksel olarak adsorbe edilmiş HDFS moleküllerini çıkarmak için AAO kalıbını bir beherde bir defada 10 saniye boyunca ultrasonik olarak temizleyin. AAO kalıbını 24 saat boyunca vakum altında kurutmadan önce temizleme prosedürünü 10 kez tekrarlayın.

Bir nokta bir milimetre kalınlığında polistiren levhayı, bir baskılı devre kartı kesici kullanarak iki nokta dokuz milimetre genişliğinde ve üç nokta yedi milimetre uzunluğunda bir boyutta kesin. Temiz bir odada çalışarak, AAO kalıbını bir pense kullanarak alttan 35 milimetre kesin. Arkadaki örnek adını ve veri üreticisini işaretleyin.

Sekiz nokta sıfır inçlik bir gofreti küçük dozda etil alkolle temizleyin, ardından polistiren tabakaları gofretin üzerine koyun ve AAO kalıbını monte edin. Ardından, alt filmi bir termal yazıcının çekmecesine koyun ve üst filmi contaya takın, ardından gofreti alt filmin üzerine koyun ve contayı gofret üzerine yerleştirin. Gofret üzerinde toz olmadığından emin olun.

Termal ve yazıcının çekmecesini kapattıktan sonra, 100 saniyeden itibaren 165 santigrat derece ısı ve 620 nokta beş/iki kilopaskal basınç uygulayın. Ardından numuneyi oda sıcaklığına soğutun. Soğuduktan sonra hazneyi boşaltın ve basınç sıfır kilo Pascal'a düşecektir.

AAO kalıbını serbest bırakmak için polistiren tabakayı hafifçe bükün. Bir heparin inhibitör tüpü kullanarak 50 mililitre insan kanı toplayın. 15 mililitrelik bir tüpe altı mililitre hidrofilik polisakkarit çözeltisi koyun ve hidrofilik polisakkarit çözeltisine sekiz mililitre kan ekleyin.

Hemen bir kan toplanmalı ve hidrofilik polisakkarit çözeltisinin üzerine yavaşça eklenmelidir. Hücreleri peletlemek için tüpü 20 dakika boyunca 1020 kez G'de santrifüjledikten sonra, opak hücre tabakasını toplayın ve 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. % 10 FBS içeren 10 mililitre PBS'de, hücreleri peletlemek için tüpü 1020 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin. % 10 FBS içeren PBS'de beş dakika buz üzerinde inkübe ettikten sonra ve hücreleri peletlemek için tüpü beş dakika boyunca 1020 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş bir mililitre endotel hücre genişleme ortamı ekleyin.

Tohum sekiz, kollajen kodlu her bir tabak için kuyu başına sıfır milyon hücre. Metin protokolünde açıklandığı gibi insan ve eterik koloni oluşturan hücreleri indükleyin ve daha sonraki deneyler için hücreleri yediye kadar büyütün. Daha sonra, gradyan nano desen plakalarını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de bir mililitre sıfır nokta yüzde bir protein kaplama çözeltisi ile kaplayın.

Tripsin kullanarak standart bir hücre bölme yöntemi ile insan ECFC'lerinin kültür kabından bir süspansiyonunu yapın. İstenen birleşmeyi elde etmek için hücre süspansiyonunu seyrelttikten sonra, insan ECFC'leri düz bir kontrolde gradyan nano desen plakalarına kesilir. Hücreleri inkübatörde iki gün boyunca düz veya gradyan nano desen plakaları üzerinde kültürleyin.

Bu görüntüler, üç farklı dökme genişletme koşulu altında üretilen AAO kalıplarını göstermektedir. Fosforik asit aşındırma çözeltisine en kısa süre daldırılan bir taraf en küçük gözenek boyutuna sahipken, aşındırma çözeltisinde en uzun süre kalan diğer taraf en büyük gözenek boyutuna sahiptir. Nano desen, termal baskı yöntemi ile polistirene aktarıldığından, polistiren yüzeyinde nano sütun yapıları oluşturulur ve AAO kalıbının boyut gradyanı nano desen plakalarında korunur.

Birleşen insan ECFC'leri, tipik parke taşı benzeri morfolojinin, bir faz kontrast mikroskobu altında kolayca ayırt edilebilen bir koloniyi bilgilendirdiğini gösterdi. İnsan ECFC'lerinin gradyan nano desen plakalarında düz üzerinde iki günlük ekiminden sonra, GP 120 ila 200'de kültürlenen hücrelerde önemli filopodia büyümesi gözlendi. Tersine, GP 200 ila 280 veya GP 280 ila 360 arasında düz kontrol ile karşılaştırıldığında kayda değer bir değişiklik gözlenmedi.

Bu sonuç, hücrelerin tepkisinin, yüzey nano yapısının boyutuna bağlı olarak farklı olduğunu göstermektedir. Bir nano desen plakası imal etmek için birçok adım vardır. Bu yüzden ilk başta karmaşık olabilir, ancak bir kez ustalaştıktan sonra, herhangi bir zorluk çekmeden arzu boyutu gradyanı ile desenler elde edeceksiniz.

Bu videoyu izledikten sonra, gradyan nano desen plakalarının nasıl üretileceği ve insana yetiştirme ve nano desen plakası üzerindeki daha aptal koloni oluşturan serilerin nasıl üretileceği konusunda büyük bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, bu yöntem çeşitli seri türleri için kullanılabilir. Bu yöntem, hücre enjeksiyonlarının ve yüzey Nano topografyasının anlaşılmasına yardımcı olacak malzeme mühendisliği ve biyoteknoloji arasında bir köprü sağlayabilir.