Name: Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Keşfedin basılı glikan dizisi teknolojisini, küçük hayvanlarda dolaşan anti-karbonhidrat antikorlarını yüksek duyarlılıkla analiz etmek için. Bu yöntem minimal örnek hacmiyle yüzlerce glikan hedefini eşzamanlı ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser "Fondo de Investigaciones Sanitarias" tarafından desteklenmiştir (FIS) PI13/01098 Carlos III Sağlık Enstitüsü, İspanyol Sağlık Bakanlığı vermek. DB-G Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) hibe sözleşmesi 603049 (bağlantı) altında tarafından finanse edilen bir doktora sonrası araştırma konum yararlanmış. NK, NS ve NB çalışmalarını grant #14-50-00131 Rus Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. DB-G Marta Broto, J. Pablo Salvador ve mükemmel teknik destek için Ana Sanchis ve Alexander Rakitko yardım istatistiksel analiz için minnettarlığını ifade etmek istiyor. Desteği ile "Pla de Doctorats sanayi de la Secretaria d'Universitats ben Recerca del Departament d'Empresa ben Coneixement de la Generalitat de Catalunya (sayı 2018 vermek DI 021). Eğer programı teşekkür ediyoruz / Generalitat de Catalunya kurumsal destek için.

1. Glycochips üretim
<ol><li>
Mikrodizi hazırlık
	<ol>
<li>Glukanlardir (50 mM) baskı ve polisakkaritler (10 µg/mL) 300 mM fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 8,5) 6 çoğaltır kullanarak N-hydroxysuccinimide-derivatized cam slaytlar temassız robotik arrayer (damla birim ~ 900 pL). Her slayt 6 kez tekrar 4 farklı blok alt diziler (Şekil 1A, renklerde) içerir. Her tek alt dizi (8 × 14 sütun satırda) denetimleri de dahil olmak üzere 112 farklı glycan noktalar tarafından oluşturulur (Şekil 1B). Not: ek tablo 1' de Glycan ile ilgili bilgiler sağlanır. İçin yazdırma mikroçip kullanılan glycan IBCh takımının uzun vadeli bir sentetik çaba sonucu kütüphanedir; sentez örnekleri ilgili yayınlar29,30,31,32,33,34,35,36 açıklanan ,37,38. Kan grubu antijenleri ve bazı terminal oligosakkaritler, hem de memeli N-O-bağlantılı ve glikoproteinlerin ve glikolipitler, tümör ilişkili karbonhidrat antijenleri, çekirdek motifleri sık sık meydana gelen en glycan Kütüphane dahil ve polisakkaritler patojen bakteriler üzerinden.</li>
		<li>Nem kutusunda (bağıl nem % ~ 70) slaytlar kuluçkaya Oda sıcaklığında (25 ° C) 1 h için.</li>
		<li>Microarrays engelleme: 1,5 saat oda sıcaklığında (100 mM Borik asit, 25 mM etanolamin, %0,2 (v/v) ara-20 Ultrasaf Su) engelleme arabelleği ile slaytlarını kuluçkaya.</li>
		<li>Glycochip Ultrasaf Su ile yıkayın ve yanında soluduğumuz hava kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glycochip kalite kontrol
	<ol>
<li>Her toplu iş karmaşık immünglobulin hazırlık (CIP, IgG, IgM ve IgA içeren), 1 mg/mL solüsyon kullanarak iki microarrays analiz biotinylated keçi anti-insan immünglobulin 10 µg/mL çözüm olarak ikincil bir antikor (IgM + IgG + IgA), 1 µg/mL tarafından takip karşılık gelen floresan streptavidin eşlenik çözümü (aşağıda açıklanan protokolü üzerinden adım 2 bakınız).</li>
		<li>İnceden inceye gözden geçirmek ve çözümlemek (bkz. Adım 3, glycan dizi analizi) glycochips.</li>
		<li>İçi ve arası chip korelasyon 0,9 yüksek ile Mikroarray toplu işlemleri kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Glycan dizi tekniği
<ol><li>
(İçinde Ultrasaf Su) aşağıdaki sulu çözümler hazırlamak ve oda sıcaklığında (25 ° C) saklayabilirsiniz:
	<ul>
<li>Tampon-1: %1 (w/v) Sığır serum albümin (BSA) PBS, (v/v) ara-%20 1 ve % 0,01 (w/v) NaN3 içinde
</li>
		<li>Tampon-2: %1 (w/v) BSA PBS, (v/v) ara-%20 0,1 ve %0,01 (w/v) NaN3.</li>
		<li>Tampon-3: %0,1 (v/v) ara-20 PBS içinde.</li>
		<li>Arabellek-4: %0,001 (v/v) ara-20 PBS içinde.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Glycochip ve örnek hazırlama
	<ol>
<li>Oda sıcaklığı (25 ° C) ulaşana kadar depolama kutusu slaytlar ile masaya koy. Not: pudra içermeyen lateks eldiven kullanın. Glycochip barkod konumlandırıldığı cam slayt alt bölümü tarafından manipüle gerekir. Barkod sağ tarafındaki, nerede glukanlardir baskılı yüzeyi ile temas kaçınarak belirlemenize yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Kutuyu açın, glycochip alıp zaten nem odası içinde sabit tutmak için ıslak filtre kağıdı ile şartına kuluçka odasında (25 ° C) yerleştirin.</li>
		<li>Bu arada, tampon-1 (1:20) fareler serumla 1,5 mL tüpler oranında seyreltin. Serum çözüm homojenize (5 s) bir girdap karıştırıcı ile. Not: bir tek glycochip yüzey tamamen karşılamak için gerekli yaklaşık 1 mL birimdir.</li>
		<li>Sonra homojenizasyon, seyreltik serum immünglobulin toplama önlemek için bir su banyosunda 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Tüpler için 10.000 x g ve 25 ° C ' 3 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve herhangi bir zarlarını malzemesini.</li>
		<li>Glycochip dikkatle kuluçka odasında yer. Herhangi bir malzeme yüzeyinde oluşan glycochip ortadan kaldırmak için tampon-3 1 mL ile 25 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
		<li>Glycochip dikey konumda tutun ve tampon-3 plastik Pasteur pipet kullanarak bazı damla ile rewash. Dikkatli bir şekilde arabellek filtre kağıdı kullanarak glycochip yüzeyden çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaksiyon: bağlama antikorlar
	<ol>
<li>Glycochip kuluçka odasında yerleştirin. Seyreltik serum örneği bir micropipette kullanarak glycochip yüzeye yayılmış. 1,5 h. Pipet Ucu kullanarak seyreltilmiş serum örneği tarafından kapalı tüm kuru alan glycochip yüzey sağlamak için 37 ° C'de yörünge ajitasyon (30 rpm) ile kuluçkaya.</li>
		<li>Aşırı herhangi bir örnek kaldırmak ve glycochip 25 ° C'de 5 dakika içinde tampon-3 için bırakın Sonra bir kapsayıcı arabellek-4 (5 dk) ile glycochip gitmek ve nihayet (5 dk) glycochip Ultrasaf Su ile yıkayın. Glycochip 175 x g ve sıvı kaldırmak için 25 ° C, 1 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Algılama: ikincil antikor
	<ol>
<li>Glycochip kuluçka odasında yerleştirin. Glycochip yüzey üzerinde biotin arabellek-2 için Birleşik keçi Anti-fare (IgG + IgM) çözeltisi (5 µg/mL) yayıldı. 1s için 37 ° C'de yörünge ajitasyon (30 rpm) ile kuluçkaya.</li>
		<li>İlişkisiz bölümü kaldırmak ve çamaşır adımları yineleyin.</li>
		<li>Santrifüjü sonra 2 µg/mL (içinde tampon-2) karşılık gelen fluorochrome etiketli streptavidin çözeltisi ile 45 dk (30 rpm) için 25 ° C'de karanlıkta glycochip kuluçkaya.</li>
		<li>Karanlıkta, ilişkisiz bölümü kaldırmak ve çamaşır adımları yineleyin.</li>
		<li>Glycochip yanında soluduğumuz hava kuru. Not: Glycochip en kısa zamanda taranması. Ama hemen boyama sonra tarama yapmak mümkün değilse, glycochips karanlığın içinde serin ve kuru bir yerde depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Glycan dizi analizi
<ol><li>
Dizi tarama
	<ol>
<li>Karanlık oda sıcaklığında ulaşana kadar glycochip masaya bırak. Aynı zamanda, slayt tarayıcı ve lazer açın (uyarma dalga boyu 633 nm).</li>
		<li>Arkadaki dokunana kadar Mikroarray holding, glycochip yuvaya kaydırın.</li>
		<li>Glycochip ("çalışma kolay tarama") tarayın ve tarama olarak kaydetmek bir ". TIFF"dosyası.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dizi miktar
	<ol>
<li>ScanArray analiz sistemi kullanarak dizi ölçmek. Açık daha önce taranmış görüntüleri, yanında tıkırtı "Eğe"-"yapılandırma ve dosya grubunda" ana penceresinde (Şekil 1B-D)</li>
		<li>Karşılık gelen dizi dosya şablonu GAL biçiminde (cam slayt üzerinde basılı glukanlardir bırakılmasını) yük (Şekil 1 c).</li>
		<li>Görüntüdeki lekeler ile dizi (ızgaralar) yerleştirerek, dikkatle GAL şablonu ayarlamak ve miktar (Şekil 1 d) başlatın.</li>
		<li>Miktar parametreleri seçin:<ul>
<li>Miktar türü: Çalıştır kolay Quant.</li>
			<li>Miktar yöntemi: Daire sabit</li>
			<li>Otomatik noktalar bulabilirsiniz: tüm seçenekleri seçimini kaldırın</li>
			<li>Normalleştirme Yöntem: LOWESS (yerel olarak ağırlıklı Scatter Arsa yumuşatma).</li>
		</ul>
</li>
		<li>Quantified veri olarak kaydetme ". CSV"dosyası (Şekil 1 d). Microsoft Excel veya başka bir uygun uygulama kullanarak ortak bir elektronik tablo dosyasındaki bu baðlamanýz gerekebilir.</li>
		<li>İnterquartile aralığı (IQR) ana istatistiksel yöntem olarak kullanın: her ligand ve interquartile sapma için tüm sinyaller (DÖRTTEBİRLİK 2) sayılarının hesaplanması (75 ve 25 testlerinde veya alt ve üst Dörttebirlikler Q3 ve Q1, sırasıyla).</li>
		<li>Etkileşimli incelenmesi veri hiyerarşik kümeleme Explorer uygulamasını kullanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Parametreleri kümeleme kullanımı: ortalama bağlantı (UPGMA) ve benzerlik olarak Öklid mesafe mesafe ölçü birimi. Normalleştirme olmadan satırlara göre hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+eliciting+neutralizing+antibodies+to+HIV-1+and+to+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).</li>
<li>Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+binding%3A+antibody+effector+functions+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases.</a> Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).</li>
<li>Bebbington, C., Yarranton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+for+the+treatment+of+bacterial+infections%3A+current+experience+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects.</a> Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).</li>
<li>Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).</li>
<li>Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+in+human+diseases%3A+lessons+from+complement+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies.</a> Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).</li>
<li>Borrok, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+by+endowing+IgG+with+Fc%CE%B1RI+%28CD89%29+binding%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding.</a> MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).</li>
<li>Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22424219">Antibody-based immunotherapy of cancer.</a> Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Prechl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+quantitative+antibody+homeostasis+model%3A+antigen+saturation%2C+natural+antibodies+and+a+quantitative+antibody+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network.</a> Clin Transl Immunology. 6 (2), e131(2017).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+as+predictors+of+complex+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopath+Ph%22%5BJournal%5D)">Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases.</a> Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).</li>
<li>Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+tumor-associated+antigens+as+biomarkers+in+cancer+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis.</a> Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).</li>
<li>Suurmond, J., Diamond, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+in+systemic+autoimmune+diseases%3A+specificity+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity.</a> J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).</li>
<li>Bovin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+human+natural+anti-glycan+immunoglobulins.+Do+we+have+auto-antibodies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?</a> Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).</li>
<li>de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+genetic+diversity+in+antibody+repertoires+from+diverse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species.</a> Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).</li>
<li>Pochechueva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+printed+glycan+array%2C+suspension+array+and+ELISA+in+the+detection+of+human+anti-glycan+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies.</a> Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).</li>
<li>Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+glycan+array%3A+antibodies+as+probed+in+undiluted+serum+and+effects+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution.</a> Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).</li>
<li>Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+carbohydrate+microarray+profiling+of+27+antibodies+demonstrates+widespread+specificity+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems.</a> Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21351089">Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array.</a> Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).</li>
<li>Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+protein-glycan+specificity%3A+effect+of+spacers+and+incubation+time%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time.</a> ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).</li>
<li>Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+with+varying+carbohydrate+density+reveal+distinct+subpopulations+of+serum+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies.</a> J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).</li>
<li>Pochechueva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+suspension+array+for+human+anti-carbohydrate+antibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling.</a> Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).</li>
<li>Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+multivalent+glycoconjugates+for+surface+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating.</a> Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).</li>
<li>Huflejt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-carbohydrate+antibodies+of+normal+sera%3A+findings%2C+surprises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges.</a> Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).</li>
<li>Buchs, J. P., Nydegger, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ABO-ELISA+for+the+quantitation+of+human+blood+group+anti-A+and+anti-B+IgM+and+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).</li>
<li>de Jager, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+and+bead-based+cytokine+immunoassay%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison.</a> Methods. 38 (4), 294-303 (2006).</li>
<li>Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoChip%3A+multiarray+for+the+study+of+carbohydrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins.</a> Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).</li>
<li>Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-coated+microarrays%3A+a+novel+slide+surface+for+the+high-throughput+analysis+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans.</a> Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).</li>
<li>Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+BALB%2Fc+mice+natural+anti-Carbohydrate+antibodies%3A+mice+vs.+humans+difference%2C+and+otherness+of+individual+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals.</a> Front Immunol. 8, 1449(2017).</li>
<li>Pazynina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glyco-O-sulfatome+for+profiling+of+human+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies.</a> Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).</li>
<li>Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+synthesis+of+A+%28type+2%29+and+B+%28type+2%29+tetrasaccharides+related+to+the+human+ABO+blood+group+system%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system.</a> Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).</li>
<li>Ryzhov, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-spacer-lipid+constructs+of+Lewis+and+chimeric+Lewis%2FABH+glycans.+Synthesis+and+use+in+serological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd+Res%22%5BJournal%5D)">Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies.</a> Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616300992">Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616000547">Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).</li>
<li>Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S1068162015020120">The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments.</a> Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943615001212">Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc.</a> Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).</li>
<li>Solís, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+into+glycosciences%3A+How+chemistry%2C+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273432327_Divergent_Strategy_for_the_Synthesis_of_a2-3-Linked_Sialo-oligosaccharide_Libraries_Using_a_Neu5TFA-a2-3-Gal_Building_Block">Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block.</a> Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+natural+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry of natural glycan microarrays.</a> Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).</li>
<li>Hoy, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+taxonomic+composition+of+the+fecal+microbiota+in+an+inbred+mouse+strain+across+individuals+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time.</a> PLoS One. 10 (11), e0142825(2015).</li>
<li>D'Argenio, V., Salvatore, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+microbiome+in+the+healthy+adult+status%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of the gut microbiome in the healthy adult status.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).</li>
<li>Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotheses+of+the+origin+of+natural+antibodies%3A+a+glycobiologist%27s+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion.</a> Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).</li>
<li>Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+development+in+fetal+and+newborn+piglets%2C+III.+Colonization+of+the+gastrointestinal+tract+selectively+diversifies+the+preimmune+repertoire+in+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues.</a> Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).</li>
<li>Bos, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoglobulin+levels+and+naturally+occurring+antibodies+against+carbohydrate+antigens+in+germ-free+BALB%2Fc+mice+fed+chemically+defined+ultrafiltered+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet.</a> Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).</li>
<li>van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background+%28spontaneous%29+immunoglobulin+production+in+the+murine+small+intestine+before+and+after+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning.</a> J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).</li>
<li>Krasnova, L., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+chemistry+and+biology+of+glycosylation+with+glycan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis.</a> Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).</li>
<li>Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOverkleeft%2C+HS+%22Essentials+of+Glycobiology+%5BInternet%5D%22">Essentials of Glycobiology [Internet]</a>. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).</li>
</ol>

Nailya Khasbiullinave Alexey Nokel çalışanları Semiotik LLC, bu çalışmada kullanılan glycochips biridir.

Glycan microarrays protein-glycan etkileşimleri40eğitim için vazgeçilmez araçlar haline gelmiştir. Mevcut çalışma BALB/c farelerde Anti-karbonhidrat antikorların dolaşan repertuar çalışmaya PGA teknolojisi tabanlı bir protokol açıklar. PGA biyolojik olarak bilinmeyen glukanlardir ekran çok sayıda imkanı sunuyor, bir son derece uygun bulma aracı13,15,28oldu. Önerilen yöntem aynı Deneysel ortamda, yüz-in se...

Antikorlar merkezi bir rol özrüne patojenler doğrudan virüs1,2 ve bakteri2,3, Kompleman sistemi4,5 aktive ederek nötralize tarafından istila karşı oynamak ve fagositoz6geliştirme. Ayrıca, onlar kanser hedefleme ve kötü huylu hücreleri7ve homeostasis bakım8,9ortadan kaldırılması önemli unsurlardır.
Bozuklukları bağışıklık sisteminin otoimmün ve inflamatuar hastalıklar10 ve kanser11' neden olabilir. Bu patolojik koşullar ideal olarak komut istemi tanısı için etkili bir tedavi talep ediyorum. Otoimmün hastalıklar söz konusu olduğunda, serolojik otoantikorlar Olguların çoğunda tanı otoimmünite10,12için bir tahmin varlığıdır. Bu antikorlar ile hücre yüzeyine tepki ve hücre dışı autoantigens ve onlar uzun yıllar otoimmün hastalık10,12' sunum öncesi mevcut çoğu kez. Ayrıca bağışıklık eksiklikleri ve kanser kan testleri ile de antikorlar veya onların fonksiyonel etkinlik11gibi bağışıklık öğeleri düzeyini ölçmek tanısı vardır.
Dolaşan antikorları ve serolojik seviyelerine repertuar tanımlaması bir prognoz ve bahsedilen patolojik koşulların tümü ilerlemesini değerlendirmek için her şeyden. Daha önce sorun kaçınarak serolojik örnekleri, geniş hacimli tüketimini en aza PGA tekniği farklı hayvan türlerinin13-16, antikor dolaşan analiz için potansiyelini göstermiştir antikorları olan17 ve izin yüksek üretilen iş antikorlar15geniş bir repertuar profil oluşturma ile ilgili.
Glycan tabanlı uzun ağırlıklı olarak, diğer faktörler arasında kökeni ve üretim benzeşme ve bağlama ligandlar15,18,19,20 belirlemek karbonhidrat tarafından conditioned ,21. Glycan tabanlı uzun süspansiyon (mikroküreler)15,21,22 veya düz aktif yüzeyler15,21,22geliştirilebilir, 23,24. Son ELISA (en geleneksel yöntemlerin) ve PGA içerir. Fazla veri aynı deneysel ayarı15,25,26,27' deki bu metodolojileri karşılaştırma değil. Biz daha önce etkinlik ve bu uzun profil anti-glycan antikorlar bireysel insan plazma örnekleri15için selectivity karşılaştırıldığında var. Bu hedefleme anti-A/B kan grubu gibi bazı karşı antikorlar, tüm uzun onları istatistiksel anlamlılık ile tespit olabilir ve onlar olumlu15,18,21birbirleri ile ilişkili. Bu arada, anti-P1 antikorlar öncelikle en yüksek discriminative gücü ile PGA tarafından tespit edildi ve hiçbir bağlantı içinde farklı glycan tabanlı uzun15,18tarafından, yapılan tespitler yapıldı. 21. bu farklılıklar yöntemleri arasında ağırlıklı olarak antikor/antijen oranı ve glycan yönlendirme15için ilgili olduğunu. Çünkü aşırı antijen antikorlar bu yöntemleri15üzerinden ELISA ve süspansiyon diziler PGA belirsiz bağlama duyarlı vardır. Buna ek olarak, glukanlardir PGA içinde yönünü ELISA ve süspansiyon diziler15' te daha daha olamaz. Çalışma glukanlardir sınırlı bir panel içerdiğinde ELISA uygun olur. Süspansiyon dizileri ile birlikte, ELISA tahlil yeniden yapılandırılması ile ilgili daha geniş esneklik sunar. PGA keşif yaklaşımlar15,18,21,28için son derece uygundur. Bu açık avantajları ve dezavantajları rağmen üç belirtilen uzun glycan-antikor etkileşimleri farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir. Son çalışma bir daha uygun yöntemleri yelpazesi rehberlik edecek hedeftir.
Mevcut iş PGA teknoloji kullanımı küçük hayvanlarda anti-glycan antikorlar dolaşan repertuar analizi için genişletmek amaçlamaktadır. Temsil edici bir sonuç olarak, burada doğal anti-karbonhidrat antikorlar PGA tarafından yetişkin BALB/c farelerde repertuar değerlendirmek için detaylı bir protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td><güçlü > antikorlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biyotinile keçi anti-insan Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>Referans #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile keçi anti-fare IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Referans #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotik Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlin, Almanya</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Leke Tepsisi (slayt kuluçka odası)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Kanada</td><td>Ref. #: M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya&nbsp;</td><td>Referans #: 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Gilson, Middleton, WI, ABD</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Slayt Tarayıcı&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, ABD</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, İngiltere</td><td>Ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Biological samples</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c fareler sera</td><td>Bu makale</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks İmmünoglobulin Preparatı (CIP)</td><td>İmmüno-Gem, Moskova, Rusya</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><Güçlü>Kimyasallar, Reaktifler ve Glikanlar&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycan kütüphanesi</td><td>Biyoorganik Kimya Enstitüsü (IBCh), Moskova, Rusya</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Referans #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Referans #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Kimyasallar & Life Science S.A., Madrid, İspanya</td><td>Referans #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte tamponlu salin (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barselona, İspanya</td><td>Referans #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Referans #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 konjugat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 konjuge</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Birleşik Krallık</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hidroksisüksinamid türevli cam slaytlar H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Almanya</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filtre kağıdı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tüp</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Referans #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım ve algoritmalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Mikrodizi Analiz Sistemi</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiyerarşik Kümeleme Gezgini uygulaması</td><td>Maryland Üniversitesi, MD, ABD</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

basılı glycan dizi: anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Anti-karbonhidrat antikorlar verilen bireyin dolaşan repertuar kez immünolojik durumu ile ilişkilidir. Sadece iç ve dış potansiyel tehlike sinyalleri mücadelede başarı bireysel bağışıklık durumu belirler, ama aynı zamanda anti-glycan antikorlar (ve onların serolojik düzey varyasyon) dolaşan belirli bir desene varlığı olabilir bir önemli nokta başlangıçlı ve patolojik belirli koşullar ilerleme. Burada, glycan hedefler yüzlerce ile çok yüksek duyarlılığı ölçmek için bir fırsat sunuyor Glycan dizi PGA baskılı tabanlı bir metodoloji açıklayan; ortak bir sınırlama mevcut küçük hayvanlar olan örnek, en az bir miktarda kullanarak (sıçanlar, fareler, hamster, vb) adresi yönleri insan hastalıkları ile model olarak kullanılır. Bu yaklaşım bir temsili örnek olarak, biz doğal anti-glycan antikorlar BALB/c farelerde repertuar analizinden elde edilen sonuçları göster. Biz her BALB/c fare olmanın genetik olarak aynı ve aynı koşullarda yapılmaktadır rağmen çalışma dahil belirli bir desene doğal anti-karbonhidrat antikor geliştirir göstermek. Bu eser repertuar (özelliklerine) araştırmak için PGA teknoloji kullanımı ve anti-karbonhidrat antikorlar, hem sağlık hem de herhangi bir patolojik durum sırasında dolaşan düzeylerini genişletmek iddia ediyor.

Burada, doğal anti-glycan antikorlar 20 BALB/c farelerin bir popülasyondaki repertuar miktar elde edilen temsilcisi sonuçlarının özetini mevcut. Bu çalışmada kullanılan glycochips 419 farklı glycan yapılar içermektedir. Çoğu glukanlardir -CH sentezlenmiş2CH2CH2NH2 spacer Osilahlı-glikosidler, çeşitli durumlarda -CH2CH2NH2 veya NHCOCH -2NH2 glikosidler olarak. Tüm glycan yapıları tar...

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Bu protokolün genel amacı, baskılı glikan dizi tabanlı bir teknoloji kullanarak küçük hayvanların serumunda dolaşan anti-glikan antikorlarının profilini incelemektir. Bu yaklaşım, glikan yapılarına karşı antikorların önemli rol oynadığı bazı patolojik durumlarda erken tanı ve doğru tedavi potansiyeline sahiptir. Bu tekniğin en büyük avantajı, aynı deneysel ayarda yüzlerce glikan hedefini çok yüksek hassasiyetle ölçme imkanıdır.Mikro diziyi hazırlamak için temassız bir robot dizileyici kullanın. Altı adet 50 milimolar glikan ve mililitre polisakkarit başına 10 mikrogram ve 300 milimolar PBS, pH 8.5'i n-hidroksi 6 cinnamik türevi cam slaytlara yazdırır. Her slayt altı kez tekrarlanan alt diziler dört farklı blok içerir.Her bir alt dizi kontroller de dahil olmak üzere 112 farklı glikan noktalar oluşur. Bir saat oda sıcaklığında bir nem kutusunda slaytlar kuluçka. Mikro dizileri engellemek için, oda sıcaklığında tampon engelleme ile 11/2 saat boyunca slaytlar kuluçka.Daha sonra glikol çipini ultra saf suyla yıkayın ve havaile kurulayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi arabellek dört üzerinden arabellek bir hazırlayın. Glikol yongaları ve numuneleri hazırlamak için, oda sıcaklığına ulaşana kadar slaytlar ile saklama kutusunu masaya koyun.Kutuyu açın ve glikol çipini, nem haznesinin içinde sabit tutmak için ıslak filtre kağıdıyla koşullandırılmak üzere zaten şartlandırılmalı olan kuluçka odasına aktarın. Bu arada, 1.5 mililitre tüpler tampon bir ile fare serum seyreltmek. Bir girdap karıştırıcı ile beş saniye boyunca serum çözeltisi homojenize.Homojenizasyondan sonra, seyreltilmiş serumu 37 santigrat derecede 10 dakika su banyosunda inkünojene edinve immünglobulin agregasyonunu önleyin. Sonra tüpleri 10, 000 kez G ve 25 derece santigrat derecede üç dakika santrifüj edin. Supernatant toplamak ve herhangi bir çökelti malzeme atın.Glikol çipini dikkatlice kuluçka odasına yerleştirin. Glikol çipinin yüzeyindekalan maddeleri ortadan kaldırmak için bir mililitre tampon üç ile kuluçkaya yatırın. 15 dakika boyunca, 25 santigrat derecede.Glikol yongasını dikey bir pozisyonda tutun ve plastik bir pastör pipet kullanarak tampon üç bazı damla ile yeniden yıkayın. Daha sonra, filtre kağıdı kullanarak glikol yonga yüzeyinden tamponu dikkatlice çıkarın. Glikol çipini kuluçka odasına geri yerleştirin.Seyreltilmiş serum örneğini mikro pipet kullanarak glikol çipi yüzeyine yayın. Glikol talaş yüzeyinin tüm kuru alanlarının pipetucu ucu kullanılarak seyreltilmiş serum numunesi ile kaplandığından emin olun. 37 derecede 37 derecede 1,5 saat boyunca orbital ajitasyon la kuluçkaya yat.Kuluçkadan sonra, herhangi bir fazla örnek çıkarın ve 25 santigrat derece tampon üç beş dakika boyunca glikol çipi batırın. Glikol çipini tampon dörtlü bir kaba geçirin ve son olarak glikol yongasını ultra saf suyla yıkayın. Glikol çipini 175 kez G ve 25 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin ve sıvıyı çıkarın.Glikol çipini kuluçka odasına geri yerleştirdikten sonra, glikol yonga yüzeyine biotin konjuge keçi anti-fare çözeltisi yayıldı. Bir saat boyunca 37 derecede yörüngesel ajitasyonla kuluçkaya yat. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarın ve yıkama adımlarını tekrarlayın.Santrifüjden sonra, glikol çipini 25 santigrat derecede 45 dakika boyunca tampon ikideki ilgili florokrom etiketli streptavidin çözeltisinin mililitresi başına iki mikrogram ile kuluçkaya yatırın. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarmak için karanlıkta çalıştıktan ve yıkama adımlarını tekrarladıktan sonra glikol çipini havayla kurutun. Diziyi tmak için, glikol çipini karanlıkta oda sıcaklığına ulaşana kadar masada bırakın.Aynı zamanda, slayt tarayıcısını ve lazeri açın. Mikro diziyi tutarak, glikol çipini arkaya değnene kadar yuvaya kaydırın. EasyScan çalıştırarak glikol yongasını tarayıp tif dosyası olarak tcan kaydedin.ScanArray çözümleme sistemini kullanarak diziyi ölçün. Ana penceredeki yapılandırma ve dosya grubundaki dosyayı tıklatarak önceden taranmış görüntüleri açın. İlgili dizi dosya şablonu, yazdırılan glikanların cam slaytüzerindeki eğilimini temsil eden GAL biçiminde yükleyin.Diziyi görüntüdeki noktalarla dikkatlice hizalayarak GAL şablonu ayarlayın ve niceliklendirmeyi başlatın. Niceleme türü kolay quant ve quantification yöntemi sabit daire çalıştırın olarak nicelik çevreleri seçin. Otomatik bulma noktaları için tüm seçenekleri açın ve normalleştirme yöntemi için lowess'i seçin.Ölçülen verileri csv dosyası olarak kaydedin. Bu verileri Microsoft Excel veya başka bir uygun uygulamayı kullanarak ortak bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Genetik olarak özdeş fareler, farklı doğal anti karbonhidrat antikorları geliştirdikleri için immünolojik eşdeğerler olarak değerlendirilmemelidir.Burada gösterildiği gibi, sadece 12 glikan özgüllükkorunmuştur. Burada gösterilen, floresan tarayıcı kullanarak tarama mikro yongaları elde edilen görüntülerin temsili bir örneğidir. Izgara daha sonra her bir alt dizideki noktalara hizalanır.Florescent's her nokta için algılanır ve sonuçlar ortak bir elektronik tablo dosyasına aktarılır. Fare serumu ile inkübasyon sonrasında, gliko yongaları bir tarama dizisi okuyucu kullanılarak tarandı. Veriler mikro dizi analiz sistemi ile analiz edildi ve sonuçlar Ortanca mutlak sapmanın ortanca artısı olarak RFU ile ifade edildi.Mavi ve beyaz renkler, 4000 RFU'nun alt arka plan bağlama sinyallerini temsil ediyor. Kırmızı renk, 4000 RFU'dan daha büyük veya eşit pozitif bağlama sinyallerini temsil eder. Glikol yongalarında maruz kalan glikan yapıların çoğu balp C farelerin dolaşan anti glisan antikorlarının repertuvarı tarafından tanınmadı.Bir kez bu teknik ustalaşılırsa düzgün bir şekilde yapılırsa 5 saat 45 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, repertuar ve serum örneklerinde dolaşan anti karbonhidrat antikorlarının düzeylerini araştırmak için yazıcı glikol dizi teknolojisini nasıl kullanacağınızı iyi anlamak gerekir. Bu prosedürü denerken, gliko çipgözlük ışığının bir alt kısmı tarafından manipüle edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Barkodun bulunduğu yer. Böylece baskılı glikanlarla temastan kaçınmak için. Ayrıca, gliko çipin tüm kuru alanı nın pipetucunu kullanarak seyreltilmiş serum numunesi ile kaplandığından emin olun.Gliko çipin tek bir yüzeyini tamamen kaplamak için gereken hacim yaklaşık bir mililitredir. Bu prosedürü takiben, anti glikan antikor profilinin esnek multipleks tespiti ile ilgili ek soruları cevaplamak için mikrosfer baz süspansiyon dizisi gibi diğer yöntemler de yapılabilir. Bu teknik, piyasaya sürülmesinden sonra biyomacral moleküller ve immünoloji alanında araştırmacıların küçük hayvanlar kümesinde protein olmayan glikol etkileşimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu video, fare serumunda dolaşımdaki anti-glikan antikorlarını analiz etmek için basılı glikan dizisi teknolojisini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, çip üzerindeki spesifik glikanlarla etkileşime girer ve bu, immün boyama ve ardından floresan taraması ile doğrulanır.

Basılı Glikan Dizisi ile Dolaşımdaki Anti-Glikan Antikorlarının Saptanması

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Burada, insanlardan ve farelerden serum IgG ve IgM otoantikorlarının aynı anda tespiti için kullanılabilecek özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu diziler, ilgilenilen herhangi bir antijene veya epitopa karşı antikorların yüksek verimli ve kantitatif tespitine izin verir.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

En korunmuş dizileri biyoinformatik analizleri ile tespit hedefleyen evrensel bir antikor kullanarak influenza virüs hemaglutinin ve nöraminidaz miktarının tayini için basit bir yuva blot yöntemi geliştirilmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tüm viral hemaglutinin ve nöraminidaz kantitatif tayini için kullanışlı bir alternatif sunabilir.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Keşfedin basılı glikan dizisi teknolojisini, küçük hayvanlarda dolaşan anti-karbonhidrat antikorlarını yüksek duyarlılıkla analiz etmek için. Bu yöntem minimal örnek hacmiyle yüzlerce glikan hedefini eşzamanlı ölçer.

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Daha fazla video keşfet