Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Bu in vitro kinaz testinin genel amacı, kinaz sikline bağımlı kinaz 1 için spesifik olan ilgili bir proteindeki fosforilasyon bölgelerini tanımlamaktır. CDK1'e özgü fosforilasyon bölgelerinin tanımlanması, CDK1'in hücre döngüsünü nasıl kontrol ettiğine dair mekanik bilgiler sağladıkları için önemlidir. Hücre döngüsü regülasyonu, faz tam kromozom ayrışması için kritik öneme sahiptir ve kusurlar kromozomal anormalliklere ve kansere yol açar.

Bu tekniğin temel avantajı, saflaştırılmış proteinlere dayanmasıdır, bu nedenle herhangi bir model organizmaya uygulanabilir ve özellikle hücrelerdeki fonksiyonel çalışmalarla birleştirildiğinde güvenilir sonuçlar verir. Bu yöntem önemlidir, çünkü CDK1'in proteumun tahmini sekiz ila 13'ünü fosforile etmesine rağmen, bilinen CDK1 hedeflerinin sayısı hala düşüktür. Bu yöntem CDK1'e özgü fosforilasyon bölgelerini tanımlasa da, saflaştırılmış kinazın mevcut olması koşuluyla diğer kinazlar için fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için modifiye edilebilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü yüksek fosforilasyon verimliliği elde etmek için kinaz testi koşullarının her bir protein hedefi için optimize edilmesi gerekir. Tercihen% 100 IGPS 3.0 yazılımını kullanın ve CENP-F hedef protein dizisindeki CDK1'e özgü fosforilasyon bölgelerini tahmin etmek için web sunucusunu ziyaret edin. Fosforilasyon bölgelerini CDK1 konsensüs dizisine göre kontrol edin.

Bir ön kültür hazırlayarak protein ekspresyonunu başlatın. Üreticinin talimatlarına göre, ekspresyon plazmidinin bir mikrolitresini 50 mikrolitre E.coli yetkin hücresine dönüştürün. Plazmidi ekledikten sonra, hücreleri 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra hücreleri 42 santigrat derecede 45 saniye inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir dakika boyunca buzun üzerine koyun, ardından hücrelere 400 mikrolitre LB ekleyin, ardından kültürü çalkalarken 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, yapıya bağlı olarak, ilgilenilen antibiyotiklerle desteklenmiş LB agar plakaları üzerine 200 mikrolitre kültür plakalayın.

Daha sonra plakaları sallamadan 12 ila 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra LB agar plakasından bir koloni seçin ve koloniyi istenen antibiyotik kombinasyonu ile desteklenmiş 50 mililitre LB besiyerine aşılayın. 12 ila 20 saat boyunca dakikada 160 ila 180 devirde sallarken kültürü 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her litre LB ortamı için antibiyotik ve hacimce ağırlıkça 10 mililitre% 40 steril filtrelenmiş glikoz çözeltisi ekleyin. Bu ortama, yoğun şekilde yetiştirilen ön kültürden 20 mililitre ekleyin. Daha sonra kültürü dakikada 160 ila 180 devirde sallarken 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültürün emilimini düzenli aralıklarla 600 nanometrede kontrol edin. Absorbans 0.5 ila 0.6'ya ulaştığında, 0.2 milimolar IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Daha sonra kültürü çalkalarken üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Üç saat sonra, hücreleri bir açılır rotor kullanarak dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4, 100 kez G'de santrifüjleme ile hasat edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dışarı atın. Hücre peletini CENP-F için 20 mililitre GST bağlayıcı tamponunda ve her litre kültür için karyopherin alfa için altı bağlayıcı tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. CENP-F'yi saflaştırmak için önce hücreleri CENP-F yapısı ile çözdürün. Ardından, bir GST bağlama tamponu ile hacmi 20 mililitreye ayarlayın.

Hacim ayarlandıktan sonra, hücre süspansiyonunu sonraki lizis için hazırlamak için tüm indirgeyicileri ve proteaz inhibitörlerini birbiri ardına ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu bir cam behere aktarın ve beheri bir buzlu su banyosuna daldırın. Sonra kültürü sonikleştirin.

Sonikasyondan sonra, lizata 250 mikromolar PMSF ekleyin, ardından bu aşamada şeffaf olması gereken lizatı inceleyin. Daha sonra lizatı dört santigrat derecede 25 dakika boyunca 12.000 ila 40.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, tek kullanımlık bir kromatografi kolonuna iki mililitre glutatyon agaroz bire bir bulamaç ekleyerek sütunu hazırlayın.

Kolonu dengelemek için önce 25 mililitre ultra saf su ve ardından 25 mililitre GST bağlama tamponu ile yıkayın. Santrifüjleme bittiğinde, süpernatanı boşaltın ve ardından süpernatanı 0.2 mikrometrelik bir dökme boyutundan süzün. Daha sonra, ciltleme adımı için lizatı tıkalı kolona dökün.

Sütunu kapatın ve hafifçe fındıklarken ve köpürmeyi önlerken 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra sütunu bir rafa aktarın ve reçinenin çökmesine izin verin. Daha sonra akışı toplayın ve sütunu 25 mililitre GST bağlama tamponu ile iki kez yıkayın.

Yıkama tamamlandıktan sonra sütunu tekrar tıka. Daha sonra kolona miligram başına 1000 birim aktiviteye sahip 400 mikrolitre GST bağlayıcı tampon ve 250 mikrolitre PS proteaz stoğu ekleyin. Tekrar sütunu kapatın ve reçineyi tamponda yeniden süspanse etmek için sütunu hafifçe döndürün, ardından sütunu 16 ila 20 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçka süresi sona erdikten sonra, CENP-F fragmanını proteolitik olarak bölünmüş kolondan çıkarmak için dört mililitre GST bağlama tamponu ekleyin. GST etiketini tekrar elute etmek için sütunu tekrar takın. Daha sonra kolona glutatyon içeren dört mililitre GST elüsyon tamponu ekleyin.

Ardından, bağlı GST etiketini çıkarmak için sütunu 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra eluatı toplayın. Ardından, PS proteaz ve glutatyon elüsyon fraksiyonlarını analiz etmek için SDS poliakrilamid jel elektroforezi gerçekleştirin.

Protein örneğini konsantre etmenin ardından, PS proteaz elüatını üç kilodalton moleküler ağırlık kesme ile bir santrifüj filtre ünitesinin üst bölmesine pipetleyin. Daha sonra, numuneyi konsantre etmek için elüatı, açılır bir rotorda dört santigrat derecede 10 ila 15 dakikalık artışlarla 4, 100 kez G'de santrifüjleyin. Her artıştan sonra, bir konsantrasyon gradyanı oluşmasını önlemek için protein örneğini konsantrasyon filtresinde hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

CENP-F'yi jel filtrasyonu ile saflaştırmak için, hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemine bir jel filtrasyon sütunu takın. Daha sonra, sütunu bir sütun hacmi jel filtrasyon tamponu ile dengeleyin. Daha sonra, CENP-F fragmanını bir mikrosantrifüj tüpünde 21, 700 kez G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjleme bittikten sonra, numuneyi kolona enjekte edin, daha sonra kolonu jel filtrasyon tamponu ile elüte edin ve CENP-F fragmanının 0.6 mililitrelik fraksiyonlarını toplayın. Daha sonra jel filtrasyon profilini analiz edin ve tepe fraksiyonlarının bir SDS-PAGE'sini çalıştırın. Saf CENP-F içeren havuz fraksiyonları.

Daha sonra saflaştırılmış CENP-F parçasını mililitre başına 3.3 miligrama konsantre edin. Protein konsantrasyonunu belirlemek için CENP-F fragmanını ultra saf su ile bire 100 oranında seyreltin. Daha sonra spektrofotometrede 220 ila 300 nanometre dalga boyundaki spektrumu kaydedin.

Daha sonra, 0,5 mililitrelik mikrotüplerde 50 mikrolitre saflaştırılmış CENP-F'nin alikotlarını hazırlayın, ardından tüpleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kinaz tahlili için, CENP-F fragmanını ATP ve CDK1 siklin B ile diğer tamponlarla birlikte 0.5 mililitrelik bir mikrotüpte karıştırın. Daha sonra negatif kontrol olarak CDK1 siklin B olmadan ikinci bir numune hazırlayın.

Daha sonra numuneleri bir ila 16 saat boyunca 30 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Fosforilasyon bölgelerinin kütle spektrometresi ile başarılı bir şekilde tanımlanması için, fosforilasyon verimliliğinin mümkün olduğu kadar yüksek, tercihen %100 olması kritik öneme sahiptir. Fosforilasyon verimliliğini artırmak için daha fazla kinaz ekleyin ve inkübasyon süresini 16 saate çıkarın. Daha sonra kalan kinaz tahlil reaksiyonuna ve negatif kontrole eşit hacimlerde altı molar guanidin hidroklorür çözeltisi ekleyin ve fosforilasyon bölgesini tanımlamak için kütle spektrometresi yapın.

Yüksek kaliteli kütle spektrometresi verileri elde etmek için, saflaştırılmış protein numunesinin oldukça saf ve homojen olması da önemlidir. İlk olarak, CDK1 içermeyen negatif kontrole kıyasla fosforile CENP-F için jel üzerindeki bandın net bir şekilde yukarı doğru kaydığını gösteren SDS-PAGE analizi yapılır, bu da CENP-F'nin cNLS'sinin bir CDK1 substratı olduğunu gösterir. Daha sonra, CENP-F fosforilasyon bölgelerinin sayısını ve verimliliğini analiz etmek için kütle spektrometresi yapılır.

Bozulmamış in vitro fosforile CENP-F'nin ESI iyon tuzağı kütle spektrumu, dört fosforilasyon bölgesini gösteren beş tepe noktası olduğunu ve beşinci tepenin fosforile edilmemiş protein olduğunu gösterir. Daha sonra, bu boyut dışlama elüsyon profili, karyopherin alfa zirvesinin elüsyon hacminin, CENP-F mutantının eklenmesinde gözlenmeyen vahşi tip CENP-F'nin eklenmesiyle daha yüksek bir kütleye kaydığını gösterir. Bu, CENP-F'nin fosfomimetik versiyonu S3048D'nin, CENP-F cNLS'nin karyoferin alfa ile etkileşimini zayıflattığını gösterir.

Son olarak, yapılan SDS-PAGE analizi, bozulmamış cNLS'ye sahip vahşi tip CENP-F fragmanının, güçlü bir etkileşime işaret eden karyopherin alfa ile koelute olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, CENP-F ve karyopherin alfa'nın S3048D mutantı ayrı zirvelerde elute olur. Bu prosedürü denerken, elde edilen fosforilasyon bölgelerini CDK1 konsensüs fosforilasyon dizisine karşı kontrol etmeyi ve tanımlanan substratın CDK1 ile aynı hücresel bölmede lokalize olduğunu doğrulamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, tanımlanan fosforilasyon bölgelerinin fizyolojik bir işleve sahip olduğunu doğrulamak için hücrelerde veya hayvan modellerinde fonksiyonel doğrulama yapılmalıdır. Spesifik CDK1 inhibitörleri ve fosfomimetik mutasyonlar gibi fonksiyonel doğrulama için bir dizi araç mevcuttur. Proteumdaki çok sayıda CDK1 substratı nedeniyle, birçok insan CDK1 substratı keşfedilmeyi beklemektedir ve in vitro kinaz testi bu bölgeleri tanımlamak, haritalamak ve doğrulamak için önemli bir araç olacaktır.

Bu fosforilasyon bölgelerinin tanımlanması, CDK1'in hücre döngüsünü nasıl kontrol ettiğine dair mekanik çalışmaları mümkün kılar. Bu videoyu izledikten sonra, CDK1'e özgü fosforilasyon bölgelerinin ve hedef proteinlerin in vitro kinaz testi ile nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.