Name: Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Keşfedin Cdk1'e özgü fosforilasyon sitelerini in vitro kinaz analizi ile belirleme yöntemini. Bu teknik, hücre döngüsü regülasyonu ve kanser biyolojisi araştırmalarında mekanistik bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr David King, Howard Hughes tıp Enstitüsü, University of California Berkeley kütle spektrometresi analiz ve yararlı yorumlar için teşekkür ederiz. Biz Dr Xuelian Zhu, Shanghai, Biyoloji Bilimleri enstitüleri, Çin Bilimler Akademisi, tam uzunlukta bir CENP-F yapı sağlamak için Shanghai, Çin teşekkür ederim. Son olarak, biz Dr Susan Bane, Dr Brian Callahan ve Dr Christof Grewer Binghamton Üniversitesi'nde ekipmana için teşekkür ederim. Bu araştırma State University of New York ve State University of New York Binghamton, Kimya bölümü için Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bizim vitro kinaz tahlil hangi hücre döngüsünün ana denetleyicisi ve birçok önemli hücresel süreçler düzenleyen kinaz Cdk1, moleküler hedefleri tanımlamak için çok güçlü bir yöntem olduğunu. Yöntem bir saf protein bir substrat Cdk1 için ve belirli fosforilasyon sitelerin kimlik sağlar Eğer belirler. Bu Cdk1 aracılığıyla fosforilasyon tarafından mekanik çalışmaları, düzenleme, hücresel süreçler için kolaylaştırır.
En kritik kütle spektrometresi fosforilasyon siteleri başarılı tanımlanm...

Kinazlar fosfat grupları ATP yüzeyler transfer ve birçok hücresel süreçler düzenleyen enzimlerdir. Bu fosforilasyon geri alınabilir, hızlı, iki negatif ücretleri, ekler ve serbest enerji depolar ve hücreleri tarafından kullanılan en yaygın ardından değişiklikler biridir. Hücre bölünmesi döngüsü protein 2 homolog (cdc2) olarak da bilinen olan Cdk1 hücre döngüsünün bütün Ökaryotlar1,2,3,4,5ana bir denetleyicisidir ve phosphorylates bir yaklaşık 8-%13 Proteom6,7.
Bu değişiklikler için sorumlu kinaz bilinmeyen ise son proteomik çalışmalar proteinler, çoğu durumda, çok sayıda fosforilasyon site belirledik. Özellikle insan hücrelerinde bilinen Cdk1 hedeflerin sayısı düşük7var. Nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol kurmak mekanik çalışmalar kullanmasına olanak tanır Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlanması önemlidir. Hücre döngüsü Yönetmeliği sadık kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemlidir ve hücresel sayısız bu önemli fizyolojik işlevi desteklemek için ortaya çıkması gereken. Bu transkripsiyon ve translasyon hücre yapısı ve organizasyon, nükleer zarf, kromozom yoğunlaşma ve Mitotik iğ Montaj Demontaj gibi dramatik bir yeniden yapılanma yanı sıra mitoz başlangıcı öncesinde durdurma içerir. Deregülasyon ve hataları bu süreçlerde kanser, doğum kusurları veya Mitotik hücre ölümüne neden olur. Cdk1 RO-3306 gibi belirli inhibitörleri fonksiyonel çalışmaları için güçlü araçlar sağlayan gelişmiş8, vardı ve bu inhibitörleri şu anda kanser tedavisi için klinik çalışmalarda bazı (9 inceleme için bakınız).
Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar bir vitro kinaz tahlil açıklayın. Bu tahlil, ticari olarak mevcut insan Cdk1/siklin B arıtılmış hedef protein vitrofazdan için kullanılır. Bir substrat fosforilasyon kütlesi artar ve iki negatif ücretleri ekler; Bu nedenle, başarılı fosforilasyon SDS-sayfa protein jel grubu yukarı doğru bir kayma tarafından onaylanır. Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri daha sonra kütle spektrometresi fosforile vitro protein analizi tarafından tanımlanır. Deneysel tasarım ile yardımcı olmak için biz de Hesaplama araçları ve protein serisinden Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tahmin için başvurular gözden geçirin. Ayrıca, aynı zamanda son derece saf ve homojen protein kinaz tahlil için uygun hazırlıklar verim arıtma iletişim kuralları açıklar. Son olarak, tanımlanan fosforilasyon siteleri fonksiyonel çalışmaları tarafından doğrulanması gerekir ve bir basit bağlama tahlil burada bu amaçla kullanılmıştır. Birlikte, bu Cdk1 özgü fosforilasyon siteler verimleri ve mekanik çalışmaları nasıl hücre döngüsü7,10,11Cdk1 denetler içine sağlayan çok güçlü bir yaklaşım olacaktır. Bu yöntem üzerinde saf protein dayanıyor beri herhangi bir model organizma ve verimleri güvenilir sonuçlar için uygulanabilir. Yerde, ardından değişiklikleri, etkileşim ortakları veya hücrede yerleşimi gibi ek düzenleyici mekanizmaları hücre var gibi Ancak, elde edilen fosforilasyon siteleri vitro işlevsel doğrulaması, tavsiye bu fosforilasyon siteleri erişilebilir veya Cdk1 tarafından tanınması için erişilebilir hale gelebilir.
Cdk1 (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), burada X herhangi bir kalıntı ve serin veya treonin fosforilasyonu sitedir oluşur bir fikir birliği fosforilasyon site tanır. + 1 pozisyon prolin varlığı tanıma için özellikle önemlidir. Buna ek olarak, temel kalıntıları + 2 veya 3 pozisyonlarda tercih edilmektedir, Lys veya Arg 3 içeren çoğu Cdk1 özgü fosforilasyon site ile6,12konum.
Cdk1 aktivasyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve mitoz1,2,3,4,5başlangıcı için yol açar. Siklin bağımlı kinaz aktivitesinin genel olarak onların dernek ile farklı siklinlere (siklin A, B, C, D ve E insanlarda), hücre döngüsü13boyunca düzeyleri salınan ifade edilir bağlıdır. Cdk1 ifade hücre döngüsü boyunca sabittir ve siklin A ve B5,13,14,15, olarak siklin düzenleyici alt birimleri ile dernek, düzenleme, faaliyete dayanan de translasyon modifikasyon. Cdk1/siklin B kompleks oluşumu kinaz harekete geçirmek5,14,15,16,17,18için gereklidir. G2 evresinde, siklin B sitozol tercüme ve nerede Cdk15,14,15,16,17,-18bağlar çekirdeği'a içe aktarılan; Ancak, B Cdk1/siklin fosforilasyon (membran ilişkili tirozin ve treonin özel cdc2 inhibitör kinaz) artıkları Thr14 ve Tyr15 insan Cdk1 inhibitör kinaz Myt1 tarafından ve Wee1, sırasıyla19tarafından Inaktif tutulur, 20,21. Geç G2 aşamasında, hücre bölünmesi döngüsü 25 fosfataz (cdc25) tarafından Thr14 ve Tyr15 dephosphorylation Cdk1/siklin B kompleks kinaz aktivitesinin etkinleştirir ve mitoz12,14, inisiyasyon tetikler 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 fosforilasyon da Cdk1/siklin B harekete geçirmek için gereklidir ve Cdk7, Cdk aktive kinaz (CAK)18aracılık ettiği. Siklin B anafaz bozulma Cdk1, mitoz24,25dan çıkış sağlayan inaktive. B Cdk1/siklin aktivasyonu bu nedenle karmaşık bir süreçtir. Burada sunulan Protokolü piyasada bulunan Cdk1/siklin b ile gerçekleştirilir Böcek hücrelerinde rekombinant ifade bu kompleksin sırasında bu harekete geçirmek içinde vivo endojen kinaz14,20 ve arıtılmış durumda etkin kalır. Elde edilen aktif, rekombinant insan Cdk1/siklin B vitro kinaz deneyleri için uygundur.
Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteler insan şeması protein F (CENP-F)10tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. CENP-F, interfaz (G1 ve S-fazlı) en sırasında çekirdeğinde bulunan ve Cdk1 bağımlı bir şekilde10, G2 aşama26,27,28 sitozol verilir bir kinetochore protein 11. nükleer yerelleştirme önerebilirim cNLS26tarafından haiz. kolaylaştırır, birlikte karyopherin β ve RanGDP, cNLS-yük alma çekirdeği29içine nükleer taşıma faktörü karyopherin α cNLSs algılanır. G2 aşamasında nükleer verme yolu ile an bilinmeyen verme yolu10kolaylaştırılmıştır. CENP-F sitozol içinde bulunduğu nükleer zarf oluşturulmuştur ve sırayla motor protein kompleksi dinein30,31acemi. Bu yol için centrosome ilgili çekirdek Mitotik Milli Meclisi ilk aşamalarında Mitotik girdinin doğru zamanlama ve beyin temel bir işlemde önemlidir dinein bağımlı bir şekilde konumlandırmak önemlidir geliştirme30,31,32. G2 aşamasında başlayan, CENP-F de kinetochore sadık kromozom segregasyon27,28,33,34,35 için önemli roller bulunduğu monte edilir . Bir anahtar düzenleyici bu yollar CENP-F nükleer ihracat Cdk110,11tarihinde bağlıdır G2 aşamasında adımdır. Biz burada bir protokol Cdk1 özgü fosforilasyon siteler CENP-F. cNLS içinde tanımlanması için tarif Phosphomimetic mutasyonlar bu sitelerin CENP-F B Cdk1/siklin doğrudan CENP-F Hücrede yerleşimi onun cNLS10fosforilasyon tarafından düzenleyen düşündüren, nükleer alınmasıyla yavaşlatacak.
Kinaz Cdk1. saf hedef proteinler fosforile vitro piyasada bulunan Cdk1/siklin B kompleks ve fosforilasyon siteler için genel olarak, bu vitro kinaz tahlil belirli yüzeylerde tanımlaması sağlar daha sonra kütle spektrometresi tarafından tanımlanır. Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol ortaya mekanik çalışmaları destekler.

<table><tbody><tr><td>2800 mL şaşkın Fernbach şişesi</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampisilin</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidin hidroklorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>şişe üstü filtre</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 / siklin B rekombinant, insan 20.000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/siklin B (alternatif kaynak)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/siklin B (alternatif kaynak)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/siklin B + 10x PK tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (kalıntılar 2987 ve ndash; 3065) pGEX6P1 plazmid</td><td>İstek üzerine temin edilebilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>santrifüj: Heraeus Multifuge X3R, soğutmalı, TX-1000 açılır rotorlu</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj filtre üniteleri: Amicon Ultra-15 santrifüj filtre üniteleri, 3 kDa kesme, Ultracel-PL membranlar</td><td>EMD Millipore UFC900324</td><td></td><td></td></tr><tr><td>klorampenikol</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L metiyonin</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td>125650010</tr><tr><td>tuzdan arındırma pipet uçları: Fermuar uçları</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>tek kullanımlık kromatografi kolonları, Econo-Pac 1,5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>ditiyotreitol</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS suşu</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>elektrosprey iyonizasyon Fourier dönüşümü iyon</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>siklotron rezonans kütle spektrometresi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elektrosprey iyonizasyon iyon tuzağı kütle spektrometresi</td><td>Bruker Amazon</td><td>özel</td><td></td></tr><tr><td>sabit açılı rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC sistemi: &Auml; kta Saf FPLC</td><td>GE Sağlık</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Jel filtrasyon kolonu: Superdex 200 10/300 GL GE</td><td>Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutatyon agaroz</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutatyon, azaltılmış</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>inkübasyon çalkalayıcı: multitron çalkalayıcı</td><td>Bilgiler</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>izopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamisin</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin & alfa; pet-28a pres plazmid</td><td>İstek üzerine temin edilebilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani orta</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj 5418R, soğutmalı</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>mikrotüpler (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>mikrotüpler (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nikel afinite jeli: His-Select Nikel afinite jeli</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plazmit</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsülfonil florür</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS proteaz: PreScission proteaz</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Fos-tag akrilamid</td><td>Wako Saf Kimya İnd.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>indirgenmiş gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>yuvarlak tabanlı santrifüj tüpleri (Oakridge tüpleri)</td> <td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>siteye yönelik mutajenez kiti: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Sahaya Yönelik Mutajenez Kiti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifiye: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC diyaliz membranı (6-8 kDa kesme)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>açılır rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir vitro kinaz tarafından tahlil

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün bütün Ökaryotlarda bir ana denetleyicisidir ve Proteom yaklaşık 8-%13 phosphorylates; Ancak, özellikle insan hücrelerinde Cdk1 için belirlenen hedeflerin sayısı hala düşük. Nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol içine mekanik anlayışlar sağladıkları gibi Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlanması önemlidir. Hücre döngüsü Yönetmeliği sadık kromozom ayrımı için önemlidir ve bu karmaşık bir süreç içinde kusurları kromozom anomalileri ve kanser neden.
Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri tanımlamak için kullanılan bir vitro kinaz tahlil açıklayın. Bu tahlil fosforile vitro arıtılmış bir proteindir ticari olarak mevcut insan Cdk1/siklin B. başarılı tarafından fosforilasyon SDS-PAGE tarafından onaylandıktan ve fosforilasyon siteleri daha sonra kütle spektrometresi tarafından tanımlanır. Ayrıca son derece saf ve homojen protein kinaz tahlil ve bağlama tahlil için uygun hazırlıklar arasındaki etkileşimi probları tanımlanan fosforilasyon siteleri fonksiyonel doğrulanması için verim arıtma iletişim kurallarını açıklar bir klasik nükleer yerelleştirme sinyal (cNLS) ve onun nükleer taşıma reseptör karyopherin α. Deneysel tasarım ile yardımcı olmak için protein dizilerinden Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tahmin için yaklaşımlar gözden geçirin. Birlikte bu protokollerin Cdk1 özgü fosforilasyon siteler verimleri ve mekanik çalışmaları nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol eder içine sağlayan çok güçlü bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntem üzerinde saf protein dayanıyor beri bu herhangi bir model organizma ve verimleri güvenilir sonuçlar için özellikle hücre fonksiyonel çalışmalar ile birlikte uygulanabilir.

Son zamanlarda bir cNLS10bulunan bir CENP-F parçadaki Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri tanımlamak için bir vitro kinaz tahlil (şekil 1) kullandık. Bu sinyal CENP-F nükleer yerelleştirme Interphase lerin confers. G2 evresinde, CENP-F sitozol Cdk1 bağlı şekilde çekirdek verilir. Nasıl CENP-f Hücrede yerleşimi Cdk1 düzenleyen üzerinde mekanik anlayışlar elde etmek için biz üreticisinin sunucu36,...

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Bu in vitro kinaz testinin genel amacı, kinaz sikline bağımlı kinaz 1 için spesifik olan ilgili bir proteindeki fosforilasyon bölgelerini tanımlamaktır. CDK1'e özgü fosforilasyon bölgelerinin tanımlanması, CDK1'in hücre döngüsünü nasıl kontrol ettiğine dair mekanik bilgiler sağladıkları için önemlidir. Hücre döngüsü regülasyonu, faz tam kromozom ayrışması için kritik öneme sahiptir ve kusurlar kromozomal anormalliklere ve kansere yol açar.Bu tekniğin temel avantajı, saflaştırılmış proteinlere dayanmasıdır, bu nedenle herhangi bir model organizmaya uygulanabilir ve özellikle hücrelerdeki fonksiyonel çalışmalarla birleştirildiğinde güvenilir sonuçlar verir. Bu yöntem önemlidir, çünkü CDK1'in proteumun tahmini sekiz ila 13'ünü fosforile etmesine rağmen, bilinen CDK1 hedeflerinin sayısı hala düşüktür. Bu yöntem CDK1'e özgü fosforilasyon bölgelerini tanımlasa da, saflaştırılmış kinazın mevcut olması koşuluyla diğer kinazlar için fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için modifiye edilebilir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü yüksek fosforilasyon verimliliği elde etmek için kinaz testi koşullarının her bir protein hedefi için optimize edilmesi gerekir. T

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Burada, bir (hücre döngüsü) kinazın mitokondriyal lokalizasyonunun nasıl çalışılacağını ve alt mitokondriyal konumunun yanı sıra potansiyel mitokondriyal substratların/hedeflerin nasıl belirleneceğini ana hatlarıyla açıklıyoruz. Proteinlerin mitokondriye zorla ekspresyonu, ilgilenilen bir proteinin mitokondriyal lokalizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Kapiller isoelectric odaklanarak proteinler ve onların izoformlarının son derece küçük biyolojik örneklerinden detaylı karakterizasyonu etkinleştirme bir antikor tabanlı, vericiyi, yüksek üretilen iş, tekniğidir. Aşağıda bir protokol olarak algılanmasını ve miktar belirli proteinlerin ve onların izoformlarının otomatik ve robotized bir şekilde açıklanmıştır.

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Keşfedin Cdk1'e özgü fosforilasyon sitelerini in vitro kinaz analizi ile belirleme yöntemini. Bu teknik, hücre döngüsü regülasyonu ve kanser biyolojisi araştırmalarında mekanistik bilgiler sağlar.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Daha fazla video keşfet