Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

Bu yöntem, üreme tıbbı alanında, desidualizasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar ve endometriyal stromal hücre desidualizasyonunda spesifik genlerin rollerini anlama ile ilgili temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu çalışma, insan endometriyal stromal hücrelerinin izolasyonu ve ardından hormonların kültür ortamına eklenmesiyle yapay desidualizasyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Prolaktin ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein gibi hormonal değişimin ifadesi, desidualizasyon derecesini doğrulamak ve ölçmek için kullanılabilir.

Daha da önemlisi, bu protokolün gene özgü yıkım gerçekleştirme kabiliyeti de gösterilmiştir. Biyopsiyi sterilize edilmiş forseps ile on mililitre taze HBSF içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından 90 saniye boyunca 500x G'de santrifüjleyin. Bir mL'lik bir pipet kullanarak, ortamı çıkarın ve üç mL önceden ısıtılmış hES izolasyon ortamı ekleyin.

Biyopsiyi beş mL hES izolasyon ortamı içeren 10 santimetrelik bir tabağa boşaltın ve yaklaşık 20 dakika boyunca Dumont 5 forseps ve ince düz dikiş makası kullanarak doğramaya başlayın. Bir mL pipet kullanarak, doğranmış biyopsiyi 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve kalan parçaları 50 mL'lik tüpe aktarmak için tabağa yedi mL daha hES izolasyon ortamı ekleyin. Daha sonra numuneyi 800x G'de iki dakika santrifüjleyin ve bir mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın.

Daha sonra, DNase-1 ve kollajenaz sindirim karışımını, 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0.2 mikronluk bir filtreden doğrudan pelet üzerine süzün. Daha sonra peleti yeniden süspanse etmek için tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın ve bir su banyosunda 90 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir, dokunun düzgün bir şekilde sindirildiğinden emin olmak için tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın.

İnkübasyondan sonra, stromal hücreleri geri kazanmak için süspansiyonu yeni bir 50 mililitrelik tüp üzerine yığılmış 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün, ardından toplanan hücreleri 2,5 dakika boyunca 800x G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek bir mililitrelik pipet kullanarak süpernatanı nazikçe çıkarın. Daha sonra hücre peletini 10 mililitre taze hES izolasyon ortamında yeniden süspanse edin, ardından 2,5 dakika boyunca 800x G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri altı mililitre taze hES ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, kan hücrelerini çıkarmak için, yeniden süspanse edilmiş hücreleri üç mililitre yoğunluk gradyan ortamına yavaşça katmanlayın ve numuneyi 30 dakika boyunca 400x G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, yoğunluk gradyan ortamını bozmadan süpernatanı toplayın.

Ardından, toplam hacmi 10 mililitreye çıkarmak için hES ortamını ekleyin ve numuneyi 2,5 dakika boyunca 800x G'de tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri altı mililitre hES ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, şişeye altı mililitre hücre yeniden süspansiyonu ve 10 mililitre hES ortamı ekleyerek hücreleri 75 santimetrelik bir şişeye yerleştirin ve ardından şişeyi sallayarak hafifçe karıştırın.

Kaplamadan sonra, mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin, ardından hücreleri üç ila beş gün boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe kültürleyin ve hES ortamını her iki günde bir değiştirdiğinizden emin olun. 48 saat sonra, hücreler tek tabaka halinde büyümelidir. Genellikle beş gün sonra, hücreler 75 santimetrelik bir şişede% 80 ila 90 birleşme elde eder.

siRNA transfeksiyonu için, her koşul için üç kopya halinde altı oyuklu bir plakada oyuk başına 800.000 hücre kaplayarak başlayın ve transfeksiyona hazırlanmak için hücreleri iki gün boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. İki gün sonra, beş mL'lik bir tüpe 150 mikrolitre Opti-MEM serum içermeyen ortam ekleyin, ardından beş mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Ters çevirerek iyice karıştırın ve beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, beş mL'lik yeni bir tüpe 100 mikrolitre Opti-MEM serum içermeyen ortam ekleyin, ardından 16 nanomol SRC-2 siRNA ekleyin. Daha sonra beş mL'lik bir tüpe 100 mikrolitre Opti-MEM serum içermeyen ortam ekleyin, ardından 16 nanomol kontrol siRNA'sı ekleyin. İnkübasyondan sonra, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini SRC-2 siRNA ile birleştirin ve ileri ve geri pipetleyerek iyice karıştırın.

Daha sonra seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini kontrol siRNA'sı ile birleştirin ve ileri ve geri pipetleyerek iyice karıştırın. Sonra kompleksleri beş dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, hES ortamını aspire edin ve her oyuğa bir mililitre değişim ortamı ekleyin.

Beş dakikalık inkübasyondan sonra, çözeltiyi toplamak için kompleksleri 500x G'de iki dakika santrifüjleyin. Daha sonra, içeren hücrelerin ve ortamın her bir oyuğuna 250 mikrolitre siRNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve hafifçe sallayarak karıştırın, ardından 37 santigrat derecede beş saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin. Beş saat sonra, besiyerini aspire edin ve hES besiyerine geçin ve in vitro desidualizasyon testine hazırlık olarak iki gün boyunca inkübasyona devam edin.

48 saatlik transfeksiyon sonrası ve in vitro desidualizasyon testini başlatmadan önce, sıfır gün kontrol siRNA ve SRC-2 siRNA transfekte edilmiş hücreleri toplayın. İlk olarak, ortamı aspire edin ve kuyucuk başına bir mL PBS ile yıkayın. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve oyuk başına 300 mikrolitre RNA lizis tamponu ekleyin ve üç dakika inkübe edin.

Üç dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri daha sonraki aşağı akış analizi için RNA lizis tamponunda 1.5 ml'lik bir tüpe toplayın. Daha sonra, uygun hacimde desidualizasyon ortamını alıntılayarak EPC ortamını hazırlayın ve 50 mililitrelik bir tüpe 10 nanomolar estradiol, bir mikromolar medroksiprogesteron asetat ve 50 mikromolar siklik adenozin monofosfat ekleyin. Kalan altı kuyucuk için, her kuyucuğa iki mililitre EPC ortamı ekleyin ve hücreleri altı gün boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin ve EPC ortamını her 48 saatte bir değiştirin.

Altıncı günden sonra, gerçek zamanlı PCR kullanarak aşağı akış analizi için altıncı gün kontrol siRNA'sını ve altıncı gün SRC-2 siRNA transfekte hücre peletlerini RNA lizis tamponunda toplayın. Östrojen medroksiprogesteron asetat ve siklik adenozin monofosfat ile desidualizasyonun indüksiyonu, stromal hücrelerin uzamış fibroblastik hücrelerden yuvarlak epitel hücrelerine hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi ile sonuçlanır. Endometrial stromal hücrelerin falloidin boyaması, hES desidualizasyonunun aktif lif hücre iskeleti yeniden düzenleme karakteristiğini daha da ortaya koymaktadır.

Araçla tedavi edilen hES'de, hücreler görünüşte fibroblastik kalırken, EPC ile tedavi edilen hücrelerde hES epiteloid benzeri göründü. İn vitro desidualizasyon testinin etkinliğini doğrulamak için, desidualizasyon belirteçleri prolaktin ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein-1'in mRNA transkript seviyeleri 6 günlük bir süre boyunca değerlendirildi. İnsan endometriyal stromal hücrelerinin desidualizasyonu üzerine, prolaktin ve IGFBP1 seviyeleri zamana bağlı olarak artmıştır.

Salgılanan prolaktin düzeylerinin zamana bağlı artışı, hES doku kültürü ortamının ELISA yöntemi ile incelenmesiyle de doğrulandı. İnsan endometriyal stromal hücre desidualizasyonunun hücresel ve moleküler değişiklikleri üzerindeki gen spesifik yıkım etkileri, kontrol veya steroid reseptör ko-aktivatörü 2 siRNA ile 48 saatlik siRNA transfeksiyonundan sonra kültürün altıncı gününde değerlendirildi. Kontrol siRNA transfekte edilmiş hES, bir parke taşı morfolojik değişikliği ve desidualizasyon belirteçleri PRL ve IGFBP1'in artan transkript seviyeleri dahil olmak üzere uygun desidualizasyon ile tutarlı hücresel ve moleküler değişiklikler gösterdi.

SRC-2 siRNA yıkımında, hES, kontrol siRNA transfekte edilmiş hES'e kıyasla görünüşte fibroblastik kaldı ve PRL ve IGFBP1 transkript seviyelerinde önemli ölçüde azalma gösterdi. SRC-2 transkript seviyeleri, SRC-2 siRNA transfekte edilmiş hES'de kontrol siRNA'sı ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmıştır, bu da bu yöntemin gen susturma için uygulanabilirliğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, siRNA transfeksiyonu kullanılarak ilgilenilen belirli bir geni in vitro desidualizasyon ve nakavt etmek amacıyla endometriyal biyopsilerden primer stromal hücrelerin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.