Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Bu yöntem, hangi yolların kardiyo-miyogenezi desteklediğini veya onardığını belirlemek gibi kardiyak yeniden programlama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha önce yayınlanmış yöntemlerden daha yüksek verimlilikle fonksiyonel indüklenmiş kardiyomiyositler üretebilmemizdir. Bu kimyasal kalp hastalığı, kardiyomiyosit kaybına ve kalp fonksiyonlarının bozulmasına neden olur.

Bu nedenle, bu teknik, fibroblastları fonksiyonel olarak indüklenmiş kardiyomiyositlere dönüştürerek yüksek onarıma yardımcı olabilir. Retrovirüs üretimine başlamak için, PE ortamında Platin E veya PE hücreleri büyütün. 10 cm'lik bir tabakta, biyo-güvenlik seviyesi iki dolapta seçim işaretleyicileri ile destekleyin.

Her iki günde bir, hücreler bir ila dört veya bir ila beşinci dilrasyonda geçer. Planlanan transfeksiyondan bir gün önce, PE hücrelerini 10 CM'lik bir kültür kabında 10 ML büyüme ortamında tohumlayın ve ardından bulaşıkları hafifçe ileri geri sallayın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için bulaşıkları dikkatlice bir inkübatöre yerleştirin ve 24 saat boyunca inkübe edin.

Transfeksiyon gününde, GHMT2M kokteylini 1.5 ML'lik bir tüpe ekleyin. Daha sonra, ayrı bir 1.5 ML'lik tüpe 360 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Daha sonra, indirgenmiş serum ortamına 36 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırmak için tüpü hafifçe vurun.

Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Bu adımda kullanılan transfeksiyon reaktifi plastiğe bağlanır. Transfeksiyon verimliliğini önlemek için, transfeksiyon reaktifini doğrudan azaltılmış serum ortamına pipetlemeye dikkat edin ve pipet ucunu tüp duvarına dokunmaktan kaçının.

Daha sonra, indirgenmiş serum ortamı transfeksiyon reaktif karışımını GHMT2M DNA kokteyli içeren tüpe ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, transfeksiyon reaksiyonu karışımını PE hücrelerine damla damla ekleyin.

Çanağı 10 ila 15 saniye boyunca hafifçe döndürün. Kesilen hücreleri 37 santigrat derecede 16 ila 20 saat inkübe edin. Şimdi 60MM tabakları kollajenle kaplayın ve en az iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra taze çözülmüş fare embriyonik fibroblastlarını veya MEF'leri kollajen kaplı kaplara dağıtın. Ve 60 MM'lik tabak başına 4 ML'lik son hacme büyüme ortamı ekleyin. Bulaşıkları yavaşça sallayın ve kuluçka makinesine yerleştirin.

MEF'leri kaplarken, hücrelerin eşit şekilde kaplanması önemlidir. Bulaşıkları döndürmekten kaçının, bu düzensiz kaplamaya neden olabilir. Bunun yerine, çanağı hafifçe ileri geri sallayın ve dikkatlice kuluçka makinesine yerleştirin.

PE hücre transfeksiyonundan 24 saat sonra, hücreler tarafından üretilen retroviral ortamı toplamak için 30 ML'lik bir şırınga kullanın. İlk retroviral ortam koleksiyonunu 45 mikrometre dökme boyutlu bir filtreden 50 ML'lik konik bir tüpe geçirin. Ardından, PE hücrelerinin yerinden oynamamasına dikkat ederek tabağın duvarına 10 ML taze büyüme ortamı ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat daha inkübe edin. Daha sonra, viral süpernatan içeren 50 ML konik tüpe mililitre heksidin methrin bromür transdüksiyon reaktifi başına 7.2 mikrolitre 10 MG ekleyin. Şimdi besiyerini MEF'lerden aspire edin ve tabağa taze hasat edilmiş retroviral besiyerinden 4 ML ekleyin.

Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. PE hücrelerinin transfeksiyonundan 48 saat sonra, retroviral ortamı toplayın ve transdüksiyonu ilk toplamada olduğu gibi tam olarak aynı şekilde gerçekleştirin. İkinci retroviral ortam koleksiyonundan sonra PE hücrelerini atın ve retroviral ortamla temas eden tüm malzemelere% 10 ağartıcı ekleyin.

İnkübasyondan sonra, retroviral ortamı MEF'lerden aspire edin ve 05 mikromolar, TGF Beta Tip 1 reseptör inhibitörü içeren 4 ML ICM ortamı ekleyin. Daha fazla kullanılana kadar her iki günde bir ICM ortamını değiştirin. İmmün boyamaya başlamak için, ICM ortamını 14. günden itibaren yeniden programlanmış MEF'lerden aspire edin.

Daha sonra hücreleri, 12 oyuklu plakanın oyuğu başına 1 ML 1X buz gibi soğuk PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, PBS'yi aspire edin, hücreleri sabitlemek için 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Paraformaldehiti aspire ettikten sonra, hücreleri 1 ML PBS ile üç kez yıkayın.

PBS'yi aspire ettikten sonra, 500 mikrolitre% 02 Triton X 100 ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Triton X 100'ün aspirasyonunu takiben, hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 mikrolitre% 10 at serumu ile bloke edin.

Daha sonra, at serumunu aspire edin ve 500 mikrolitre seyreltilmiş birincil antikor ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Primer antikoru aspire ettikten sonra, 1ML PBS ile üç kez yıkayın.

PBS'nin son yıkamasından sonra, 500 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Plakayı folyoya sarın ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Son olarak, ikincil antikoru aspire edin ve 1 ML PBS ile üç kez yıkayın.

Plakayı folyoya sarın ve görüntüleme tamamlanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bu yöntem, MEF'lerin kardiyomiyositlere yüksek verimli dönüşümünü göstermektedir. Temsili bir akış sitometrisi analizi, transdüksiyondan sonraki dokuzuncu günü ekleyin, hücrelerin yaklaşık% 70'inde aktive edilmiş kardiyak Troponin T ekspresyonunu gösterir.

Benzer şekilde, kardiyak Alfa-aktinin ekspresyonu, GFP transdüksiyon kontrolü ile karşılaştırıldığında hücrelerin yaklaşık% 55'inde gözlenir. Ek olarak, transdüksiyondan iki hafta sonra gerçekleştirilen kardiyak belirteçler için immüno-boyama, hücrelerin çoğunun Troponin I, Alfa-aktinin ve Troponin T'yi eksprese ettiğini gösterir. Ayrıca, ICM'lerin Alfa-aktinin veya Troponin T ve Cx43 ile birlikte etiketlenmesi, komşu hücreler arasındaki boşluk bağlantılarının oluşumlarını ortaya çıkarır.

GHMT2M transdüksiyonu ve A83O1 ile tedavi, MEF'lerin bir kısmını sekizinci güne kadar atan hücrelere yeniden programlar. 11. günde, santimetre kare başına yaklaşık 10000 atan hücre gözlenir. Spontan kalsiyum geçişleri, atan kardiyomiyositlerde tespit edilir.

Beta adrenerjik agonist izoproterenol ilavesi, spontan kalsiyum geçişlerinin sıklığını önemli ölçüde artırır. Buna karşılık, L-tipi kalsiyum kanal blokeri nifedipin yayılması, kalsiyum geçişlerinin sıklığını önemli ölçüde azaltır. Bu videoyu izledikten sonra, fibroblastların yüksek verimlilikle fonksiyonel, indüklenmiş kardiyomiyositlere nasıl yeniden programlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.

Bu protokolü takiben, RNA dizilimi ve çip dizilimi de dahil olmak üzere diğer yöntemler, kardiyak yeniden programlama sırasında değiştirilen küresel gen ekspresyonu ve kromatin durumu gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Retrovirüs ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu protokol uygulanırken biyo-güvenlik seviye iki kabinde çalışmak, kişisel koruyucu ekipman giymek ve tüm retroviral atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi gibi önlemler her zaman uygulanmalıdır.