Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Bu teknik, protein dinamiklerinin ve organizasyonunun fonksiyonel adaptasyonda hangi rolü oynadığı gibi düzenleyici süreçlerdeki kilit soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde yapılabilmesi ve böylece tek molekül düzeyinde protein dinamiklerini ortaya çıkarmasıdır. Bu yöntem başlangıçta mitokondriyal zar proteinlerinin uzay-zamansal organizasyonu hakkında bilgi sağlamak için uygulanmış olsa da, diğer organeller ve diğer zar proteinleri için de uygulanabilir.

Tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Timo Appelhans olacak. Hücre numunelerini ve mikroskobu metin protokolüne göre transfekte ettikten ve hazırladıktan sonra, hazırlanan numuneyi floresan boncuklarla PTFE halkası ile kırmızı kauçuk halka arasındaki numune tutucuya monte edin. Mikroskobu, tüm donanım bileşenlerini ve mikroskopi için gereken tüm yazılımları başlatın.

Objektif lensi ve kapak kaymasının altını temizlemek için izopropanol püskürtülmüş taze, tüy bırakmayan bir doku kullanın. Ardından, objektif merceğin göz bebeğine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Ardından, boncuk numunesi ile numune tutucuyu, kapak kaymasının alt kısmı yağla temas edecek şekilde mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından iletim ışığı veya bir lazer çizgisi kullanarak boncuklara odaklanın. İki floresan kanalında benzer sinyal yoğunluğu elde etmek için iki uyarma lazerinin gücünü ayarlayın. Ardından, birçok farklı floresan sinyaline sahip bir alan arayın.

Kamera kontrol yazılımını kullanarak floresan kanallarının birleştirilmiş bir görünümünü oluşturun. Ardından, iki floresan kanalından gelen sinyallerin en iyi şekilde üst üste bindirilmesini elde etmek için dahili optik görüntü ayırıcıyı manuel olarak eğmek için görüntü ayırıcıdaki vidaları kullanın. TIRF mikroskop kontrol yazılımını başlatın ve canlı akış modunda tek tek kanalları görüntülemeyi seçin.

Anlık görüntü alın, tüm kanallarda heyecan verici floresanlar. Daha sonra dönüştürme matrisini oluşturmak için bu görüntüyü kullanın. Yazılım analiz eklentisini başlatın ve floresan boncukların önceden kaydedilmiş çift renkli görüntülerini yazılıma yükleyin.

Floresan kanalların kullanılan yönünü seçin. Görüntüleri kalibre etmeniz istendiğinde Evet'e tıklayın ve daha önce çekilmiş anlık görüntüyü seçin. Birim dönüştürme faktörlerini tanımlamak için birim yöneticisini açın, ardından yerelleştirme yöneticisini açın.

Nokta yayılma işlevini veya PSF'yi belirlemek için PSF Yarıçapı düğmesine basın. Açılan PSF Tahmincisi penceresinde, sayısal açıklığı ve emisyon maksimumunu tanımlayın. Ardından PSF Yarıçapını Tahmin Et'e tıklayın.

Ardından, elde edilen deneysel PSF'yi kabul edin. Değerlendirme kutusunu, söndürme döngülerinin sayısını ve hesaplama için bilgisayarın kaç çekirdeğinin kullanıldığını tanımlayın. Ardından, 2B simetrik Gauss fonksiyonu kullanarak tek parçacıkların yoğunluk dağılımını uydurmaya başlamak için Yerelleştir'e basın.

Kalibrasyon yöneticisini açın. İki kanalın oluşturulmuş, birleştirilmiş görüntüsünde, orijinal sinyal ve yerelleştirilmiş merkezler gösterilecektir. Afin modunu seçin.

Ardından, aynı floresan boncuktan kaynaklanan iki kanaldaki karşılık gelen lokalize merkez çiftlerini bir bağlantı hattı çizerek manuel olarak bağlayın. Görüş alanına dağıtılan ilgili sinyalleri bağlayın. Ardından Kabul Et'e basın ve dönüştürme matrisini kaydedin.

Mitokondriyal membran proteinlerinin tek moleküler görüntülemesini gerçekleştirmek için, numune kapak kızağını kauçuk ve PTFE halkaları arasına monte edin. Ardından hazneyi 0,5 ila 0,8 mililitre görüntüleme ortamı ile doldurun. Objektif merceğini ve kapak contasının altını temizleyin.

Ardından, lense bir damla yağ ekledikten sonra hücrelere odaklanmak için iletim ışığı veya bir lazer çizgisi kullanın. Ardından, benzer bir yoğunluk elde etmek için iki uyarma lazerinin gücünü ayarlayın ve birçok floresan sinyali olan bir alan arayın. Bir HILO sayfası aracılığıyla belirli bir ilgi alanını uyarmak için kritik açıdan veya TIR modundan daha küçük bir olay açısı oluşturmak için TIRF mikroskop kontrol yazılımındaki aydınlatma açısını ayarlayın.

HILO aydınlatmasını kullanarak hücre organellerini uyarmak için TIRF mikroskobunun aydınlatmasını uyarlamak, sinyal-arka plan oranının hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ve TIRF mikroskobundaki deneyimin yanı sıra hücre morfolojisi bilgisini gerektirir. EM kazancını ayarlayın ve kare başına yeterli foton toplayan deney için uygun bir pozlama süresi seçin. Ardından, yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için lazer gücünü ayarlayın, çünkü bu oran doğrudan yerelleştirme hassasiyetine karşılık gelir.

Hücre çevresinde örtüşmeyen, uzun mitokondri ve tek moleküllü sinyallere sahip bir alan bulun. Kanallardan birinde veya her ikisinde tek bir sinyal görünmüyorsa, ağartma tek moleküllü sinyallerin ortaya çıkmasına neden olana kadar bekleyin. Sadece bir kanalın ağartılması gerekiyorsa, bu kanalı kaydetmeden önce ağartmayı önlemek için diğer kanalın lazerini kapatın.

Makul bir devamlılık için sinyal sayısı çok düşük olana kadar kayıt yapın. Görüntüleme işleme yazılımını başlatın ve en az 1.000 kayıtlı kareden oluşan kümülatif işlenmiş toplam bir görüntü oluşturarak mitokondriyal yapıları kontrol edin. Yazılım analizi eklentisini başlatın.

Yerelleştirme ve izleme için veri işlemeyi gerçekleştirmek için ham verileri yükleyin. Çok renkli kontrol edin. Her iki kanalın da doğru yönünü seçin.

Görüntüleri kalibre et istendiğinde, dönüştürme matrisini yükleyin. Kanallar ayrı ayrı görüntülenecektir. Göster'e tıklayarak görüntü kabından ham verileri açın.

Ardından üst sekmede birim yöneticisini açın ve her kanalda birim dönüştürme faktörlerini tanımlayın. Üst sekmede yerelleştirme yöneticisini açın ve değerlendirme kutusunu ve deflasyon döngülerinin sayısını tanımlayın. PSF tahmincisini açmak için PSF Yarıçapı'na tıklayın.

Teorik PSF değerini elde etmek için sayısal açıklığı ve maksimum emisyonu ayarlayın. Kabul Et'e basın. Bu işlemi tüm kanallar için tekrarlayın.

Ardından, her iki kanalda kaydedilen sinyaller için tek parçacıklı lokalizasyonu başlatmak için Yerelleştir'e basın. Yazılımın bitmesini bekleyin. Şimdi, yazılım analiz eklentisinin görüntü kabında her kanal için süper çözümlenmiş bir görüntü elde edilir.

PINK1, mitokondriyal işlevselliği garanti eden önemli bir faktördür. Fonksiyonel ve disfonksiyonel mitokondride Tom20'ye göre PINK1'in lokalizasyonunu belirlemek için 1.000 karelik bir zaman serisi kaydedildi. Bir kanaldan zaman içinde tüm sinyallerin kümülatif görüntüsü, PINK1'in normal koşullar altında sitozolde, dış zarda ve mitokondri içinde, ancak tercihen depolarize mitokondrinin dış zarında lokalize olduğunu gösterdi.

Lokalize parçacıkların toplam görüntülerinin gösterdiği gibi, PINK1 esas olarak polarize mitokondri içinde dağıtılırken, Tom20 dış mitokondriyal zarda lokalizedir. Bu, lokalize Tom20 ve PINK1 parçacıklarının birleştirilmiş görüntüsünde daha da belirginleşir, bu da dış zar proteini Tom20'nin dağılımının çok daha geniş olduğunu gösterir. PINK1'in mitokondri içindeki lokalizasyonunu doğrulamak için, solunum kompleksinin 30 kilodaltonluk alt birimi fotoaktif GFP'ye kaynaştırıldı ve floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu ile kaydedildi.

Kümülatif üç renkli görüntü ve enine kesit dağılımı, tam uzunlukta PINK1'in içe aktarıldığını doğrulayarak, karmaşık bir ve PINK1'in kaplamasını gösterir. Bu veriler, PINK1'in alt popülasyonlarının birkaç mitokondriyal mikro bölmeyi işgal ettiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde yapılırsa, verilerin kaydedilmesi ve işlenmesi de dahil olmak üzere 20 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, organel hareketini test etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, proteinlerin nispi lokalizasyonu belirlenebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, mitokondriyal proteinlerin tek parçacıklı takibi alanındaki araştırmacıların, Z2'deki davranışlarını ve farklı metabolik koşulları ve stres altında gözlemlemelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, alt organel konumlarını ve kaçakçılığını ortaya çıkarmak için mitokondriyal proteinlerin çift sütunlu mikroskopisinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.