Name: Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde tek membran proteinlerinin çok renkli yerelleştirme mikroskobu yöntemini. Bu teknik yaklaşık 18 nm çözünürlükle organel içi protein dinamiklerini incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Biyofizik grup ve Jacob Piehler Üniversitesi Osnabrück sürekli desteği, teknik yardım ve malzeme hazırlanması için Wladislaw Kohl ve mikroskoplar kullanmak için sağlamak için CellNanOs yönetim kurulu için teşekkür etmek istiyorum. Proje SFB 944 tarafından finanse edildi.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences ">https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences </a> (2016).</li>
<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
<li>Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+mobility+in+mitochondrial+membranes+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Graham, F. L., van der Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52 (2), 456-467 (1973).</li>
<li>Wedeking, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+Controlled+Reorganization+of+Signaling+Complexes+in+the+Plasma+Membrane+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells.</a> Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).</li>
<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth1171">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159).</a> Nature Methods. 5 (5), 455(2008).</li>
<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, mobil zar proteinleri çift renk tek molekül yerelleştirme için bir teknik sunuldu. Aşağıdaki iletişim kuralı, membran proteinlerinin erimiş TMR ve onların anılan sıraya göre yüzeylerde Birleşik efendim rodamine boyalar ile reaksiyona proteinler Self Etiketleme için. Rodamine are parlak ve photostable boya ve böylece yinelenen görüntüleme1için izin verir. Başarılı performans için çeşitli koşullar ve kritik konular akılda tutulması gerek.
İlk olarak, uygun filtrel...

Bu iletişim kuralının amacı yerelleştirilmesine ve tek zar proteinleri canlı hücreleri içinde izlemek için bir görüntüleme yöntemi sağlamaktır. Bu yöntem1,2izleme ve yerelleştirme mikroskobu (TALM) diyoruz. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)3 ve floresan Photoactivation yerelleştirme mikroskobu ((F) PALM)4,5gibi TALM bir tek molekül tabanlı floresans yerelleştirme tekniktir. Ancak, zar proteinleri birlikte hareketlilik ile aynı yinelenen görüntüleme için mobil protein erişilemez microcompartment molekül farklı pozisyonlar ortaya çıkarır, etiketli şekilde farklıdır. Başka bir deyişle, protein mümkün yerelleştirmeler organel mimarisini ve protein1hareketliliğini tarafından ayarlanır. Yerelleştirme ve yörünge haritaları görüntüleme mobil proteinler tarafından ortaya çıkarır çünkü çeşitli diğer süper çözünürlük teknikleri6,7,8 ' e tamamlayıcı yöntemdir. Etiketleme başına sigara floresan genetiği füzyon protein kullanarak dayanmaktadır. Bu füzyon proteinler kovalent bir boya için Birleşik bir substrat ile reaksiyona enzimler Self Etiketleme. Bu yordam etiketleme derecesi olabilir avantajı vardır ekledi substrat miktarı kontrollü. Ayrıca, floresan, bağlı olarak seçilen konjuge boya rengini değiştirmek için izin verir. Birkaç kendini etiketleme enzim-mevcut9etiketlerdir. Tam olarak onlar ağartılmış kadar enzim-Etiketler Self Etiketleme, konjuge boyalar genellikle daha istikrarlı ve floresan proteinler1 ve bireysel proteinler bu nedenle artık kaydedilebilir daha parlak ve daha fazla kullanmanın bir diğer avantajı. Bu yörüngeleri mobil proteinlerin kaydı ve difüzyon katsayıları10,11çıkarılması için sağlar.
Burada, biz TALM fizibilite mitokondri zar proteinleri ile göstermek, ama aynı zamanda farklı hücre türleri12,13de dahil olmak üzere diğer içi ve ekstra cellular membran proteinlerinin için uygulanabilir. Biz çok renkli TALM daha da proteinler tamamlayıcı için varolan Süper çözünürlük floresans mikroskobu teknikleri14,15, içinde farklı subcompartments arasında eşzamanlı ayrım sağlar göstermek 16. TALM17Imaging canlı hücre ile uyumludur. Fotoğraf-fizik seçilen rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) ve silikon-Rhodamien (sır), özellikle onların parlaklık ve istikrar, sağlar kayıt tek zar proteinleri için yerelleştirme (ve yörünge) haritalar sağlayan birden çok çerçeve. Ancak, TALM hareket bulanıklığı çok yüksek olduğu ve kare başına toplanan fotonlar uygun yerelleştirme için çok düşük çözünür proteinler yüksek difüzyon katsayıları ile lokalizasyonu için sınırlıdır. Ayrıca, TALM Fototoksik etkileri azaltmak örneğin fırtına veya uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi6,7, daha az uyarma güç gerektirir. Fototoksik stres organellar morfoloji18 ve böylece mobilite analiz19kez etkiler bu yana bu önemlidir. Özetle, biz yerelleştirme mikroskobu yöntemleri fırtına/STED arasında bir boşluk doldurur bir teknik olarak çok renkli TALM canlı hücreler içinde mevcut / (F) PALM ve protein hareketlilik floresans kurtarma gibi photobleaching sonra analiz teknikleri (sıkı bağlamak)20 ,21, floresans korelasyon spektroskopisi (FCS)22ve floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS)11,23.

<table><tbody><tr><td>(2- (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinil) -etansülfonik asit, 1 M) (HEPES)</td> <td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: Dikroid ışın ayırıcı ve nbsp;</td><td>DC2 NC506031 Chroma</td><td>640 dcxr</td><td></td></tr><tr><td>: Polikroik Ayna, ışın ayırıcı</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td>, Dulbecco&<td>akut'un üretimini durdurdu</td></tr><tr><td>; s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 1x (Ca & olmadan Mg)</td> <td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>Earle&akut; fenol kırmızısı içermeyen, L-Glutamin içermeyen ve NaHCO3 içermeyen MEM %1 FBS, %0.1 HEPES, %0.1 NEAA, %0.1 Alanil-L-Glutamin ve %34.78 sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3 0.75g/l)</td><td></td><td></td> içeren <td>Görüntüleme ortamı</td></tr><tr><td>Earle ve akut; % 1 Fetal Sığır Serumu Superior (FBS),% 0.1 HEPES (2-(4- (2-hidroksietil) -1-piperazinil) -etansülfonik asit, 1 M) ve% 0.1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) içeren fenol kırmızısı ile minimum esansiyel ortam (MEM)</td><td></td><td></td> <td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>EF: Emisyon filtresi dörtlü bant geçiren</td><td>AHF analizi</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>EMCCD kamera</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>EMCCD kamera</td></tr><tr><td>Emisyon filtresi QuadView filtre küpleri, turuncu</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>bant geçişi 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Emisyon filtresi QuadView filtre küpleri, kırmızı</td><td>Chroma</td><td></td><td>bant geçişi 655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (Fetal sığır serumu) superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Floresan boncuklar: TetraSpeck&trade; Mikro küreler, 0.1 ve mikro; m, floresan mavi/yeşil/turuncu/koyu kırmızı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>floresan mikroküreler</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa hücreleri&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Hasta Henrietta'dan alınan servikal karsinom hücreleri</td></tr><tr><td>Hela hücrelerinden yoksun CI::p aGFP, stabil</td><td>Muster ve diğerleri, PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela hücreleri CV g::Halo7-Tag, kararlı</td><td>Appelhans ve diğerleri, NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela hücreleri Tom20::Halo7-Tag, kararlı</td><td>Appelhans ve diğerleri, NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü ayırıcı</td><td>Fotometri</td><td>Çift Görünüm QV2</td><td>görüntü ayırıcı emisyon</td></tr><tr><td>Görüntüleme işleme yazılımı&nbsp;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>ücretsiz</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma Yağı - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Ters epifloresan mikroskobu</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lazer 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm emisyon</td></tr><tr><td>Lazer 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm emisyon</td></tr><tr><td>Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi 2,2 g/L NaHCO3 ile MATLAB MathWorks sürüm R2013a MEM, 2,2 g/</td>L NaHCO3 içeren Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi ile PR <td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM olmadan stabil glutamin, stabil glutamin, Fenolred</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> MitoTracker&reg;<td></td></tr><tr><td> Koyu Kırmızı FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>boya</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Yeşil FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>boya</td></tr><tr><td>Çok modlu optik polarizasyon, monomod fiberi koruma</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml; bingen</td><td></td><td>lamel kaplama</td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Polietilen glikol) %10</td> <td>Carl Roth GmbH</td><td>Ürün No. 0263.1</td><td>lamel kaplama</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td></td> PINK1-Halo7-Etiket ifadesi için Biochrom<td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid</td><td>Beinlich ve diğerleri, ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin (1.2 mg / ml)</td> <td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>kedi. No.P9155</td><td>lamel kaplama</td></tr><tr><td>RGD Peptid (Ac-CGRGDS-COOH)</td> <td>Karot Sistemi Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>lamel kaplama / Intergrin reseptör motifi</td></tr><tr><td>HaloTag&reg;-Ligand (SiRHTL)&nbsp;</td><td>Kai Johnson'dan</td><td></td> kişisel hediye <td>boya</td></tr><tr><td>Yazılım analiz eklentisi</td><td>kendi yazdığı C. P. Richter, Biophysik Osnabr&uuml; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin / SNAP-Cell&reg; TMR-Star, SNAP-Ligand'a (TMRstar) bağlı&nbsp;</td><td>New England Biolab&reg;</td><td>S9105S</td><td>boya</td></tr><tr><td>HaloTag&reg;-Ligand (TMRHTL)&nbsp; ile bağlantılı tetrametilrodamin</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>boya</td></tr><tr><td>TIRF kondansatörü</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO Sistemi</td><td>TIRF kondansatörü</td></tr><tr><td>TIRF mikroskop kontrol yazılımı</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF objektif</td><td>Olympus</td><td>150x yağ objektifi (N.A. 1.45; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Su H2O %99,5 Rotipuran&reg; Düşük organik&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Sanat. Hayır. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Proteinlerin hücresel subcompartments lokalizasyonu hakkında bilgi belirli kendi işlevini anlamak çok önemlidir. Burada, yerelleştirme üreten ve haritalar bu proteinlerin izleme proteinler için erişilebilir microcompartments belirlenmesi için izin veren bir süper çözünürlük teknik mevcut. Ayrıca, çok renkli yerelleştirme mikroskobu tarafından yerelleştirme ve profilleri farklı subcompartments proteinlerin izleme aynı anda elde edilir. Teknik canlı hücreler için özgüdür ve tek mobil zar proteinleri tekrarlayan görüntüleme üzerinde temel alır. Proteinler ilgi genetik olarak belirli, sözde Self Etiketleme etiketleri ile erimiş. Bu etiketleri bir substrat ile kovalent bir şekilde tepki enzimlerdir. Bu yüzeyler için Birleşik floresan boyalar vardır. Reaksiyon ile floresan enzim öğesini proteinlerin etiketli yüzeylerde sonuçlar etiketli proteinler. Burada, Tetramethylrhodamine (TMR) ve silikon rodamine (sır) Floresan boyalar enzimler yüzeyler için bağlı olarak kullanılır. Substrat konsantrasyonu nM Aralık pM içinde kullanılarak, alt stokiometrik etiketleme farklı sinyaller de sonuçları elde edilir. Bu sinyaller ~ 15-27 ile yerelleştirilmiştir nm hassas. Sayede renk sayısını sınırlı kullanılabilir membran geçirgen boyalar ve enzimler Self Etiketleme repertuar tek moleküllerin çok renkli görüntüleme için tekniği sağlar. Biz kalite kontrol enzimi (Pten) lokalizasyonu belirlenerek teknik fizibilite göstermek-kinaz 1 (PINK1) ile ilgili olarak diğer membran proteinlerinin işleme sırasında farklı mitokondrial bölmeleri indüklenen. Farklı etiketlenmiş tek protein molekülünü perde veya ortak izleme arasındaki gerçek fiziksel etkileşim için test olsa da, düşük etiketleme derece aynı zamanda etiketli iki bitişik protein sahip olma olasılığını azaltmak için sınırlıdır. Teknik proteinler membran bölmeleri görüntüleme için güçlü olmakla birlikte, çoğu durumda son derece mobil çözünür proteinler lokalizasyonu belirlemek uygun değil.

Çok renkli görüntüleme ve colocalization analiz proteinlerin alt organellar yerelleştirme belirlemek için yardımcı olabilir. Biz bu daha önce sitozolik fosfataz ve tensin homologue, PINK1, mitokondrial proteaz17tarafından işleme nedeniyle farklı alt mitokondrial konumları olan ile gösterilmiştir. PINK1 mitokondriyal işlev34,35güvence altına alınması önemli bir faktördür. PINK1 sırasında işleme (<strong clas...

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Bu teknik, protein dinamiklerinin ve organizasyonunun fonksiyonel adaptasyonda hangi rolü oynadığı gibi düzenleyici süreçlerdeki kilit soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde yapılabilmesi ve böylece tek molekül düzeyinde protein dinamiklerini ortaya çıkarmasıdır. Bu yöntem başlangıçta mitokondriyal zar proteinlerinin uzay-zamansal organizasyonu hakkında bilgi sağlamak için uygulanmış olsa da, diğer organeller ve diğer zar proteinleri için de uygulanabilir.Tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Timo Appelhans olacak. Hücre numunelerini ve mikroskobu metin protokolüne göre transfekte ettikten ve hazırladıktan sonra, hazırlanan numuneyi floresan boncuklarla PTFE halkası ile kırmızı kauçuk halka arasındaki numune tutucuya monte edin. Mikroskobu, tüm donanım bileşenlerini ve mikroskopi için gereken tüm yazılımları başlatın.Objektif lensi ve kapak kaymasının altını temizlemek için izopropanol püskürtülmüş taze, tüy bırakmayan bir doku kullanın. Ardından, objektif merceğin göz bebeğine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Ardından, boncuk numunesi ile numune tutucuyu, kapak kaymasının alt kısmı yağla temas edecek şekilde mikrosk

multi-color-localization-microscopy-single-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Bu protokol, memeli Neuro-2a hücre hattı kullanılarak nöronal nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin ifadesi ve nicelendirilmesini açıklar. pH duyarlı floresan etiketler ve konfokal mikroskopi, plazma membranındaki reseptör lokalizasyonunun pH-nötr hücre içi bölmelerdeki ekspresyonlarla karşılaştırıldığında hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu da nAChR taşığı ve farmakolojik modülasyonun incelenmesini kolaylaştırır.

Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Öğrenin canlı hücrelerde tek membran proteinlerinin çok renkli yerelleştirme mikroskobu yöntemini. Bu teknik yaklaşık 18 nm çözünürlükle organel içi protein dinamiklerini incelemeyi sağlar.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Daha fazla video keşfet