Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş
August 8th, 2018
Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.
Bu tekniğin temel avantajı, otomatik optik mikroskopta hücrelere gerçek zamanlı olarak bakabilmenizdir. Bu tedavinin sonuçları, göçün bu hastalıklarda çok önemli bir rol oynadığı kronik yaraların veya kanserin tedavisine kadar uzanır. Yıkama başına beş mililitre steril magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile birleşik bir HaCaT hücre kültürünü iki kez yıkayarak başlayın.
Daha sonra, hücreleri 37 derece santigrat derece inkübatörde bir mililitre tripsin ile beş ila sekiz dakika inkübe edin. Işık mikroskobu altında ayrılmayı onayladıktan sonra, FBS ile desteklenmiş dokuz mililitre kültür ortamı ile enzimatik reaksiyonu durdurun. Ve hücreleri, 250 mikrolitre ortam artı FBS konsantrasyonu başına 7.5 kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin.
Daha sonra, yuvarlak tabanlı 48 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 250 mikrolitre hücre tohumlayın ve hücrelerin kuyu tabanlarına eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yavaşça bir yandan diğer yana kaydırın. Daha sonra plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kültürler% 90 ila 95'lik bir birleşmeye ulaştığında, her bir oyuktaki süpernatanı, mililitre mitomisin C başına 10 mikrogram ile takviye edilmiş 250 mikrolitre taze hazırlanmış ortamla değiştirin ve plakayı iki saat daha inkübatöre geri koyun.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın ve her oyuğa 250 mikrolitre taze PBS ekleyin. Ardından, her hücre tek katmanında bir dikey çizik yapmak için 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanın. Tüm tek tabakalar çizildiğinde, her bir oyuktaki PBS'yi ilgilenilen peptit uyaranı ile 250 mikrolitre ile değiştirin ve plakayı, kapağı sağlam bir şekilde optik bir kamera sistemine monte edin.
Optik kamerayı kurmak için edinme penceresini açın ve yara iyileşmesini seçin. Plaka tipini seçin ve kullanılmayan kuyucukların seçimini kaldırın. Ardından, odağı hücrelerin konumuna uyacak şekilde ayarlamak için etkinleştir'e tıklayın ve kuyucuklardan birine sağ tıklayın.
Resim aralığı altındaki görüntülerin zaman periyodunu ayarlayın ve tekrar sayısını istenen periyoda uyacak şekilde ayarlayın. Ardından uygun analiz türünü seçin. Ardından hücreleri görüntülemeye başlamak için başlat'a tıklayın.
Bir yara oluştuğunda, cilt hücreleri çoğalmaya başlar ve yarayı kapatmak için yara yatağı boyunca göç etmeye başlar, bu da optik kamera aracılığıyla gözlemlenebilen bir süreçtir. 48 saatlik bir inkübasyondan sonra endotelyal büyüme faktörü tedavisi, tedavi edilmemiş kontrol kuyucuklarında %38'lik bir kapanmaya ve laktoferrin ve laktoferrisin kültürlerinde sırasıyla %33 ve %62'lik bir kapanmaya kıyasla, yaranın yaklaşık% 95'lik bir kapanmasına neden olur. İlk çizikten itibaren boşluk genişliğindeki değişikliklerden belirlenen yara kapanma yüzdesi, her bir büyüme uyaranı için de çizilebilir.
Bu video, sağlıklı hücrelerden oluşan tek bir tabakada yapılan bir çizik boyunca keratinositlerin göçünü incelemek için basit ve etkili bir protokolü açıklamaktadır. Bu tahlilde kullanılan hücreler HaCaT hücreleri olsa da, yöntem, mikrotitre plakasının dibine yapıştıkları sürece diğer hücre hatlarına, mantarlara ve hatta bakterilere de uygulanabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, hücre göçünü in vitro ortamda test etmek için otomatik optik kameralı mikroskobu kullanan bir prosedürü açıklar. Scratch testi, zaman içinde hücre göçünü gözlemlemek için güvenilir bir yöntem olarak vurgulanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi
- In Vitro Teknikler
Arka Plan
- Scratch testi, hücre göçünü incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Otomatik optik mikroskoplar, hücrelerin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
- Hücre göçünün anlaşılması, kronik yaralar ve kanser tedavisinde önemlidir.
- Bu yöntem, hücre hareketini tespit etmek için maliyet-etkili ve güvenilirdir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre göçünü değerlendirmek için güvenilir bir yöntem göstermek.
- Kronik yara tedavisi ve kanser tedavisinde hücre göçünün etkilerini araştırmak.
- Gerçek zamanlı analiz için otomatik optik mikroskopi kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- HaCaT hücrelerinin konfluan kültürlerini PBS ile yıkama.
- Hücrelerin trypsin ile dekolasyon için inkübasyonu.
- Enzimatik reaksiyonun kültür ortamı ile durdurulması.
- Analizler için hücrelerin belirli bir konsantrasyonda seyreltilmesi.
Ana Sonuçlar
- Hücre göçünün gerçek zamanlı gözlemlenmesi sağlandı.
- Metot, scratch kapanmasını izlemek için etkili olduğu kanısına varıldı.
- Sonuçlar, kronik yaralar ve kanser için terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Otomatik mikroskop, göç değerlendirmelerinin güvenilirliğini artırır.
Sonuçlar
- Otomatik optik mikroskop, hücre göçünü incelemek için değerli bir araçtır.
- Bu teknik, kronik yara iyileşmesi ve kanser tedavilerinde araştırmayı ilerletebilir.
- Daha fazla çalışma, çeşitli biyolojik bağlamlarda uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
