Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş
8 Ağustos 2018
Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.
Bu tekniğin temel avantajı, otomatik optik mikroskopta hücrelere gerçek zamanlı olarak bakabilmenizdir. Bu tedavinin sonuçları, göçün bu hastalıklarda çok önemli bir rol oynadığı kronik yaraların veya kanserin tedavisine kadar uzanır. Yıkama başına beş mililitre steril magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile birleşik bir HaCaT hücre kültürünü iki kez yıkayarak başlayın.
Daha sonra, hücreleri 37 derece santigrat derece inkübatörde bir mililitre tripsin ile beş ila sekiz dakika inkübe edin. Işık mikroskobu altında ayrılmayı onayladıktan sonra, FBS ile desteklenmiş dokuz mililitre kültür ortamı ile enzimatik reaksiyonu durdurun. Ve hücreleri, 250 mikrolitre ortam artı FBS konsantrasyonu başına 7.5 kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin.
Daha sonra, yuvarlak tabanlı 48 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 250 mikrolitre hücre tohumlayın ve hücrelerin kuyu tabanlarına eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yavaşça bir yandan diğer yana kaydırın. Daha sonra plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kültürler% 90 ila 95'lik bir birleşmeye ulaştığında, her bir oyuktaki süpernatanı, mililitre mitomisin C başına 10 mikrogram ile takviye edilmiş 250 mikrolitre taze hazırlanmış ortamla değiştirin ve plakayı iki saat daha inkübatöre geri koyun.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın ve her oyuğa 250 mikrolitre taze PBS ekleyin. Ardından, her hücre tek katmanında bir dikey çizik yapmak için 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanın. Tüm tek tabakalar çizildiğinde, her bir oyuktaki PBS'yi ilgilenilen peptit uyaranı ile 250 mikrolitre ile değiştirin ve plakayı, kapağı sağlam bir şekilde optik bir kamera sistemine monte edin.
Optik kamerayı kurmak için edinme penceresini açın ve yara iyileşmesini seçin. Plaka tipini seçin ve kullanılmayan kuyucukların seçimini kaldırın. Ardından, odağı hücrelerin konumuna uyacak şekilde ayarlamak için etkinleştir'e tıklayın ve kuyucuklardan birine sağ tıklayın.
Resim aralığı altındaki görüntülerin zaman periyodunu ayarlayın ve tekrar sayısını istenen periyoda uyacak şekilde ayarlayın. Ardından uygun analiz türünü seçin. Ardından hücreleri görüntülemeye başlamak için başlat'a tıklayın.
Bir yara oluştuğunda, cilt hücreleri çoğalmaya başlar ve yarayı kapatmak için yara yatağı boyunca göç etmeye başlar, bu da optik kamera aracılığıyla gözlemlenebilen bir süreçtir. 48 saatlik bir inkübasyondan sonra endotelyal büyüme faktörü tedavisi, tedavi edilmemiş kontrol kuyucuklarında %38'lik bir kapanmaya ve laktoferrin ve laktoferrisin kültürlerinde sırasıyla %33 ve %62'lik bir kapanmaya kıyasla, yaranın yaklaşık% 95'lik bir kapanmasına neden olur. İlk çizikten itibaren boşluk genişliğindeki değişikliklerden belirlenen yara kapanma yüzdesi, her bir büyüme uyaranı için de çizilebilir.
Bu video, sağlıklı hücrelerden oluşan tek bir tabakada yapılan bir çizik boyunca keratinositlerin göçünü incelemek için basit ve etkili bir protokolü açıklamaktadır. Bu tahlilde kullanılan hücreler HaCaT hücreleri olsa da, yöntem, mikrotitre plakasının dibine yapıştıkları sürece diğer hücre hatlarına, mantarlara ve hatta bakterilere de uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, otomatik bir optik kamera mikroskobu kullanılarak in vitro hücre migrasyonunun test edilmesi için bir prosedürü açıklamaktadır. Scratch deneyi, zaman içindeki hücre migrasyonunu gözlemlemek için güvenilir bir yöntem olarak vurgulanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi
- In Vitro Teknikleri
Arka Plan
- Çizik testi, hücre göçünü incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Otomatik optik mikroskoplar, hücrelerin gerçek zamanlı gözlemini sağlar.
- Hücre göçünün anlaşılması, kronik yaralar ve kanser tedavilerinde kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, hücre hareketini tespit etmek için maliyet etkin ve güvenilirdir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre migrasyonunu değerlendirmek için güvenilir bir yöntem göstermek.
- Hücre migrasyonunun kronik yara tedavisi ve kanser terapisindeki etkilerini incelemek.
- Gerçek zamanlı analiz için otomatik optik mikroskopi kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Konflüen HaCaT hücresi kültürlerinin PBS ile yıkanması.
- Hücrelerin ayrıştırılması için tripsin ile inkübe edilmesi.
- Enzimatik reaksiyonun kültür ortamı ile durdurulması.
- Hücrelerin analiz için belirli bir konsantrasyona seyreltilmesi.
Temel Sonuçlar
- Hücre göçünün gerçek zamanlı gözlemi gerçekleştirilmiştir.
- Yöntemin, çizik kapanmasını izlemede etkili olduğu kanıtlanmıştır.
- Sonuçlar, kronik yaralar ve kanser için terapötik stratejilere ışık tutabilir.
- Otomatik mikroskopi, göç değerlendirmelerinin güvenilirliğini artırır.
Sonuçlar
- Otomatik optik mikroskop, hücre göçünü incelemek için değerli bir araçtır.
- Bu teknik, kronik yara iyileşmesi ve kanser tedavileri alanındaki araştırmaları ilerletebilir.
- İleri çalışmalar, tekniğin çeşitli biyolojik bağlamlardaki uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Hücre migrasyonu analizleri, yara iyileşmesi ve onkolojide terapötik adayların değerlendirilmesi için kritik öneme sahiptir; ancak geleneksel çizme (scratch) analizleri, kenar artefaktlarından ve manuel analiz darboğazlarından etkilenmektedir. Optimize edilmiş bu protokol, katyon aracılı hücre birikimini ortadan kaldırarak ve otomatik görüntülemeyi entegre ederek tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer ve tutarlı, kantitatif migrasyon sonuçları sağlar. Bu yaklaşım, pro-migratuar ve anti-migratuar bileşikler hakkında güvenilir ve gerçek zamanlı veriler sunarak erken evre hedef validasyonunu ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Laktoferrin veya büyüme faktörleri gibi uyaranlara yanıt olarak migrasyondaki değişimleri niceliklendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Otomatik optik görüntüleme yoluyla manuel çizik analizinden ve sıcaklık dalgalanmalarından kaynaklanan değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Zaman içinde özdeş çizik bölümlerinden standardize edilmiş, kantitatif yara kapanma metrikleri üretir.
- Operasyonel Değer: İş gücü yoğun görüntü döngüsü ve analizini ortadan kaldırarak bileşik tarama için işlem kapasitesini artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Epitel göçünü modellemek için hastalıkla ilişkili HaCaT keratinositlerini kullanır ve translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir, otomatik iş akışları aracılığıyla keşif aşamasından preklinik değerlendirmeye kadar analiz sürekliliğini sağlar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken keşif aşamasındaki hipotez testlerini destekleyerek ve ölçülebilir migrasyon inhibisyonu veya stimülasyonu yoluyla kantitatif öncü bileşik tanımlamasına olanak sağlayarak keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Peptit veya sitokin tedavilerine yanıt olarak migrasyonu bağımlı değişken olarak izole ederek yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Bileşik kütüphaneleri veya protein varyantları arasında karşılaştırmaya olanak tanıyan tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar (örneğin, % yara kapanması) sağlar.
- Analitikler: İstatistiksel karşılaştırma ve doz-yanıt modellemesine uygun zaman serisi migrasyon verileri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: İnsan keratinosit hücrelerinin ve yara iyileşmesi bağlamının kullanımı yoluyla preklinik uygunlukla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve hücre tipi genelinde migrasyon analizleri için yeniden kullanılabilir, otomatik bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Migrasyon deneylerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik görüntüleme ve tutarlı çizik hazırlama yoluyla standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Sürecin erken aşamalarında güvenilir, kantitatif migrasyon verileri sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış migrasyon etkilerine dayalı olarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Monotaba hazırlama için hücre kültürü ve steril teknik konusunda uzmanlık gerektirir.
- Zaman ayarlı çekim (time-lapse) ve analiz yeteneklerine sahip otomatik optik kamera sistemlerine bağımlıdır.
- Karşılaştırılabilir veriler elde etmek için kuyucuklar arasında çizik genişliğinin ve zamanlamanın standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı hücre hatlarında kenar artefaktlarını önlemek için PBS yıkama adımlarının optimizasyonunu içerir.
- Mikrotitrasyon plakası tabanına yapışmaya uygun adherent hücrelerle sınırlıdır.
