Name: Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Öğrenin, otomatik optik mikroskop kullanarak kazı-kazan tahlili ile HaCaT hücrelerinde hücre göçünü nasıl test edeceğinizi. Bu yöntem, kronik yara ve kanser tedavileri için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bağımsız araştırma, teknoloji ve üretim, Danimarkalı kurulu #4005-00029 vermek

Deneysel Kur etik ve yasal sınırlama yoktur vardır ve Roskilde Üniversitesi ile anlaşma yapılmıştır. Deneysel set-up bir bakış resim 1 ve Şekil 2optik kamera mekanizmaları görülebilir.
1. hazırlık
<ol><li>Tüm adımları bir steril laminar akış-tezgah tezgah ve tüm ekipmanları ile % 70 etanol başından önce deneme temizleyerek gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreler için en uygun koşulları sağlamak için % 5 CO2 37 ° C'de geleneksel bir kuluçka optik kamera yerleştirin.</li>
	<li>%10 FBS ve 1 x antibiyotik (penisilin ve streptomisin) bir T75 şişesi ile DMEM medyada HaCaT hücrelerin büyümesine.</li>
	<li>1 mL 1 x tripsin hücreleri bağlantısını kesin ve onları her 3-4 gün yetiştirmek hücresel katmanı üzerinden Dispergatör tarafından alt için kullanın. Oda sıcaklığına kullanmadan önce ön ısı.</li>
</ol>2. HaCaT Monolayer üreten hücreleri bir 48-kuyu Microtiter plaka
<ol><li>Orta T75 şişeye Pasteur pipet ile kaldırın.</li>
	<li>Şişeye yapışık hücreleri T75 şişesi 5 mL 1 x steril PBS ekleyerek yıkayın. Not: PBS kalsiyum ve magnezyum serbest olduğundan emin olun.</li>
	<li>PBS geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve Pasteur pipet ile çıkarın.</li>
	<li>2.2 2.3 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Şişesi için 1 mL 1 x tripsin ekleyin ve hücre katmanı dağıttı.</li>
	<li>Hücreleri müstakil kadar geleneksel bir kuluçka 37 ° C'de şişeye kuluçkaya (5-8 dk çoğu hücre hatlarında yeterli).</li>
	<li>Hücreleri müstakil ise mikroskop altında görüntüleyin. Hücreleri müstakil kez 9 mL % 10 ile düzenli kültür ortamının eklemek FBS 1 x tripsin devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Her iki hemasitometre, hücresiyle saymak coulter-sayaç veya benzer bir. Not: Trypan mavi ölü hücreleri görüntülemek için kullanılabilir. Ancak, 1 x tripsin HaCaT hücreleri vardır mükemmel yuvarlak zaman canlı.</li>
	<li>7.5 x 104 hücreleri/iyi 250 µL % 10 FBS medya 48-iyi doku kültürü yuvarlak popolu plaka (Standart plaka) aktarın. Not: tahlil de ayarlanabilir 6-, 12-, 24-veya hangi optik mikroskop altında denetlesinler 96-şey plakaları.</li>
	<li>Yavaşça plaka yan tarafında hücreleri aynı derecede içinde wells yayılır emin olmak için hareket veya hücreleri kuyuları Merkezi'nde bir araya gelecek. Hücre medyada eşit yayılmış emin olmak için hafif bir mikroskop altında incelemek</li>
	<li>Gecede veya hücreleri kuyu dibine yapıştırılır kadar geleneksel bir CO2 kuluçka 37 ° C'de plaka koymak.</li>
</ol>3. geçiş efektleri için bir çekim gücü eklenmesi
<ol><li>Kuyuları % 90-95 birleşmesi hafif bir mikroskop altında olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>10 µg/mL mitomycin C orta uygun bir miktarda hazırlamak. Not: Bu çalışmada, Mitomycin C 1 mg/mL, hisse senedi bir çözümde 4 ° C'de tutulur. 2-8 ° C'de karanlıkta bir hafta için Mitomycin C çözüm içinde depolanması</li>
	<li>Pasteur pipet ile harcanan medya her kuyudan çıkarın.</li>
	<li>5 µg/mL mitomycin C de 250 µL her şey için ekleyin.</li>
	<li>2 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Peptidler uyaranlara onları Orta uygun bir miktarda sulandrarak hazırlayın. Not: Bu çalışmada, insan ve sığır laktoferrin hem Lactoferricin 25 µg/mL 250 µL hacmine, test edildi</li>
	<li>Mitomycin C ile Pasteur pipet ile orta kaldırın.</li>
	<li>1 x 1 x PBS (Oda sıcaklığında) ve Kaldır yıkama bir Pasteur ile 250 µL ile pipet wells yıkayın.</li>
	<li>1 x PBS 250 µL ekleme ve el ile wells 200 µL pipet ucu ile dikey çizik. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 250 µL peptid uyaranlara ekleyin.</li>
	<li>Plaka plaka her iki tarafındaki vidaları ayarlayarak optik kamera sistemi monte. Kapak microtiter plaka üzerinde bırakın. Not: Kameranın açık gerekirse kapak ile çalışabilir.</li>
</ol>4. Program bilgisayarın optik kamera için ayarlama
<ol><li>Al soldaki görev çubuğundaki düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Görev çubuğundaki soldaki iyileşmesi işlevi seçin.</li>
	<li>Plaka tipi plaka illüstrasyonaşağı tıklatarak seçin.</li>
	<li>Wells, kullanılmadığı, onları işaretleyerek seçimini kaldırın ve ekranın üst sol tarafında, Etkinleştir ' i tıklatın. Not: Bütün wells varsayılan olarak seçilir.</li>
	<li>Hücrelerin konumunu bir kuyu üzerinde sağ tıklatarak sığdırmak için kuyu objektif odak noktası ayarlayın. Not: Otofokus da plaka illüstrasyon sağında çubuğunu taşıyarak el ile ayarlanabilir.</li>
	<li>Zaman dönemi Resim aralığı altında görüntü için ayarla (Örneğin (00: 30:00)).</li>
	<li>Tekrarı istenen dönem (Örneğin 97 tekrarlar) sığacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Run Başlat düğmesini sağ alt köşesine tıklatarak başlatın.</li>
</ol>

<ol><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li>
<li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li>
<li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+motility%3A+lessons+from+migration+in+confined+spaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li>
<li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li>
<li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+journal+of+dermatology%22%5BJournal%5D)">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li>
<li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li>
<li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells%3A+toxicity%2C+wound+healing%2C+uptake+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li>
<li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li>
<li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput%2C+interactive+imaging%2C+bright-field+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Räsänen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives%2C+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign%2C+not+in+malignant+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li>
<li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/biomat.2016.17.issue-1-2/bnm-2016-0002/bnm-2016-0002.xml">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li>
<li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li>
<li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin%2Flactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein%2Fpeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li>
<li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+properties+of+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li>
<li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+desmosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li>
<li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanali%2C+C+%22Whitepaper+a+Digital+Time-Lapse+Bright+Field+Technology+To+Drive+Faster%2C+Higher+Throughput+Bioanalysis%22">Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis</a>. , (2016).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geliştirme, yara iyileşmesi, immünoloji ve kanser araştırmaları göç önemi için birkaç farklı yöntem geçiş çalışma yol açmıştır. Geçiş ya da bir ifade genişleme veya boşluk hücreleri tarafından kapatılması olabilir. Bir monolayer hücreleri büyümek ve daha belirli form8hücrelerde büyüyen bir çizik bile yapmak daha kolay olduğu gibi en sık kapatılması çizik, mercek altına alındı. Tekniği Master kolay ve düşük maliyetli olduğu gibi bizim çalışma manuel tırmalamak için en iyi duruma getirilmiş bir yönt...

Geçiş birçok fizyolojik açıdan etkileyen önemli bir süreçtir. Yara iyileşmesinde, geçiş cildin yeniden epithelization kolaylaştırır. Kronik yaralar gibi Sigara şifa yaralar fırsatçı bakteriler yara enfeksiyonu neden ve açık yaralar bakteri büyüme ve biyofilm1,2oluşumu için idealdir. Biyofilm dirençli bakterilerin gelişimi nedenleri biri bizim modern toplumun3için en büyük tehdit olan biridir. Yara iyileşmesinde, bağışıklık hücreleri biyofilm aşamıyor. Kanser, kanser hücrelerinin geçiş metastaz, çok önemli bir adım olan ölüm solid tümör4,5olan hastalar için birincil nedeni olmasıdır. Bu nedenle, geçiş çalışma çok önemlidir.
Kazı-kazan tahlil kez çünkü ucuz ve kolay, fibroblast, endotel ve epitel hücre hatları6,7gibi yapışık hücre satırları üzerinde gerçekleştirmek için hücre göç sınamak için kullanılır. Bugün, çizikler8gerçekleştirmek için birkaç yöntem var ve farklı malzemeler kullanılmak üzere, kürdan9, hücre Kazıma aletleri10, lazerler11ve elektrik akımları12de dahil olmak üzere bildirilmiştir. Tüm yöntemleri farklı artıları ve eksileri var ve yöntem üzerine hücre türü, bütçe ve analiz aracına göre karar vermesi gerektiğini. Örnek olarak, kullanılan hücre tipi, el ile basınç kaldırma, kaplama gerektiriyorsa, Örneğin bir kürdan veya pipet ucu ile geçiş alanı içinde etkisi, farklı bir yöntem kullanılmalıdır. Bu çalışmada, el ile kazıma üzerinde durulacak.
El ile kazıma için bir zararı olmaz bu çizikler şekilleri ve çizik kenarlarında hücre birikimi, boyutu varyasyonu. Birçok protokoller bulunmaktadır ve hızlı artış ve/veya13çizilmemesi sonra ayrıntılı çamaşır yüksek atıf kağıt tavsiye eder. Buna ek olarak, hücrelerin çoğalması göç--dan ayırt edici olamaz ve bu nedenle yanlış pozitif sonuçlar göç verebilir beri yayılması, en aza indirmek için birkaç yöntem kullanılmıştır. Bazı yöntemler sıfırdan14 önceki ve serum15miktarı azalan serum açlık bildirilir. Ancak, bu yöntemlerin ikisi de hiçbir nükleer silahların yayılmasına karşı olduğundan emin olabilirsiniz. Bu nedenle, biz ön arıtma göç doğru sonuçlar sağlamak için mitomycin C içeren hücrelerin raporu. Mitomycin C DNA16ayıran engeller DNA ile kovalent bağ oluşturarak DNA sentezini engeller bir antibiyotiktir. Mitomycin C ile önceden tedavi ve çizilmemesi önce PBS ile yıkama, Gap algılanan kapatılması (Şekil 1) hücrelerinin doğru geçiş gösteriyor.
Tüm yöntemleri geçiş17süreci analiz etmek bir sistemi için ihtiyaç özelliğidir. Ortak bir ilerleme çözümlemek için ucuz bir yöntem ise bir görüntü yazılımı18,19boşluğu kapatılması bir analizini ve ardından önceden belirlenmiş zaman noktalarda çizik görüntülerini çekmek için ışık alan mikroskop kullanmak için. Bu yöntem zaman alan, aynı yerde ve odak fotoğraf çekmek açısından güvenilmez ve resimlerin çekildiği ise sıcaklık değişiklikleri döngüleri kuluçka hareketinden kamera için zorlar. Diğer yöntemler mevcut akışını ölçerek geçiş algılamak için geliştirilmiştir. Geçerli değişiklikleri hücreler olarak empedans20artış olarak okumak plaka üzerinde daha fazla yer kapsamaktadır. Empedans ölçüm, çevrenin hücrelerin etkilenmez ve yöntemi bu nedenle non-invaziv olarak kabul edilir. Bu yöntem pahalı, altın elektrotlar ile özel plakaları kullanır ama onlar hücresel bağlılık, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve hücre ölümü gibi birçok işlemlerin algılanmasını sağlar. Sıcaklık gibi faktörler empedansı üzerinde büyük bir etkiye sahip olarak empedans ölçüm doğrudan geçiş, göstermez bu yöntemin bir engel olduğunu. Empedans değişimler veri analizi daha zor hale yazılım tarafından incelenir değil çeşitli faktörler neden olabilir. Bu nedenle, görselleştirme eksikliği geçiş doğrulamak için geleneksel bir ışık mikroskobu gerektirir.
Birçok kullanılabilir teknikleri downsides üstesinden gelmek için gerçek zamanlı otomatik optik kamera kullanın. Optik kamera küçük bir platformda bir lens, aydınlatma ünitesi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile yüksek-den geçerek mikroskop ile algılama sistemidir. Göç ve diğer şeyler arasında nükleer silahların yayılmasına karşı test edebilirsiniz bir yerleşik yazılım vardır. Geçiş algılamak için iki algoritmaları büyüme ve hücrelerin çoğalması ve analizi, sırasıyla şifa yara adı verilen geçiş kinetik çözümlemek için kullanılır. Doku analizi (sarı renkle gösterilmiştir) cep kaplı alanlar arasındaki farkı bulmak için geçerlidir bir iki aşamalı görüntü segmentasyonu algoritma dayalı ve boş yayılması analizi arka plan alanları göre gelişmiş çubuk grafik analiz. Analiz şifa yara hücre monolayer algılar, yara boşluk bulur ve boşluk genişliğini belirler bir üç adım algoritmasına dayanan. Aşağıdaki adımları Kullanıcı tarafından belirlenen saat-noktalarda yapıldığı ve verileri kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı sunulur. Bu makine büyük avantajlarından biri21kamera açısı yüzünden sıvı ile yapışık hücreleri görüntüleme sağlar olduğunu. Resimleri odak noktası (Şekil 2) olduğundan emin olmak için bir z-yığını için tek bir z uçağı öngörülen kamera hareket ettirildiğinde lenstakes görüntüler oluşturmak. z-yığınlar yara kenarına ve tüm yara arasında dikey çekilen fotoğraflar (Örneğin 40) dizi birleştirme tarafından oluşturulur. Z-yığınlar hücre katmanı hem de bir odakta uçak derinliği yara yakalama sağlar. Ayrıca, resimleri dizi görüntüleri, video koleksiyonuna bir düğmeyi tıklamak ile birlikte konabilir.
Biz algılanması HaCaT keratinosit hücre doğrultusunda geçiş için en iyi duruma getirilmiş bir protokol göstermek. Laktoferrin ve onun N-terminal peptid, Lactoferricin, insanlar ve inekler, bu moleküller çok sayıda uygulama antimikrobiyal ve bağışıklık molekülleri22 oransal için gösterildiği şekilde geçiş üzerindeki etkileri analiz etmek için test , 23. dört bileşikler tedavi edilmezse HaCaT hücrelere karşılaştırıldı ve epidermal büyüme faktörü (EGF) olumlu bir denetim olarak kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Optik kamera</td></tr><tr><td>UniExplorer yazılımı&nbsp;</td><td>BioSense Çözümü ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT hücresi</td><td></td><td></td><td>Bispebjerg Hastanesi'nden bağışlandı</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>HaCaT FBS</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>için Orta Fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Mg + ve Ca2 +</td></tr> <tr><td>Pencillin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P0781 olmadan</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Tripsin (10x)</td> <td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Proliferasyonu Engeller</td></tr><tr><td>Mikrotitre plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37 & deg; C,% 5</td></tr><tr><td>CO2 Hemositometre</td><td>Yardımcı T</td><td></td><td>&uuml; rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet çocuk</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kazı-kazan tahlil vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Hücre göç sağlık, yara iyileşmesi ve kanser, gibi birçok yönünü etkileyen önemli bir süreçtir ve bu, bu nedenle, geçiş çalışma yöntemleri geliştirmek için çok önemlidir. Kazı-kazan tahlil uzun bileşikler ile anti ve pro migration özellikleri nedeniyle, düşük maliyetli ve basit yordamı sınamak için en yaygın vitro yöntemi olmuştur. Ancak, bir sık rapor tahlil hücreleri birikimi sıfırdan kenar boyunca bir sorundur. Ayrıca, tahlil verileri elde etmek için farklı pozlama görüntüleri bir süre içinde tam olarak aynı noktada göç hareketleri karşılaştırmak için alınması gerekir. Farklı analiz programları sıfırdan kapatılması tanımlamak için kullanılan, ancak emek yoğun, yanlış ve kuvvetleri döngüleri sıcaklık değişiklikleri. Bu çalışmada, geçiş etkisi, Örneğin doğal olarak meydana gelen proteinler insan ve sığır Laktoferrin ile ve epitel hücre satırındaki HaCaT onların N-terminal peptid Lactoferricin test etmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi göstermektedir. Çok önemli bir optimizasyon yıkayın ve söz konusu birikimi hücre kenarı boyunca ortadan kaldırır PBS sıfırdan etmektir. Bu özellikler, keratinosit hücre-hücre bağlantısı üzerinde etkisi olduğu gösterilmiştir kaldırma tarafından açıklanabilir. Geçiş doğru tespiti sağlamaktır, mitomycin C, DNA sentezi inhibitörü ile önceden tedavi protokolü için eklendi. Son olarak, aşırı sıcaklık döngüleri, ortadan kaldıran otomatik optik kamera, el emeği ile sıfırdan kapatma analizi, tekrarlanabilirlik üzerinde iyileştirilmesi ve zamanla çizik aynı bölümden analiz sağlanması sırasında göstermek.

HaCaT keratinosit hücre, deride en bol bulunan hücre türlerinden biri olan bir. Bir yara ortaya çıktığında, cilt hücrelerini çoğalırlar ve üzerinde yara (Şekil 3) kapatmak için yara yatağına geçirmek başlatın. Her iki süreç vardır, bu nedenle, uygun şifa için son derece önemlidir.
Optik kamera her iki süreç gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz. Geçiş için sistemi üç veri kümeleri verir: hücre k...

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Bu tekniğin temel avantajı, otomatik optik mikroskopta hücrelere gerçek zamanlı olarak bakabilmenizdir. Bu tedavinin sonuçları, göçün bu hastalıklarda çok önemli bir rol oynadığı kronik yaraların veya kanserin tedavisine kadar uzanır. Yıkama başına beş mililitre steril magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile birleşik bir HaCaT hücre kültürünü iki kez yıkayarak başlayın.Daha sonra, hücreleri 37 derece santigrat derece inkübatörde bir mililitre tripsin ile beş ila sekiz dakika inkübe edin. Işık mikroskobu altında ayrılmayı onayladıktan sonra, FBS ile desteklenmiş dokuz mililitre kültür ortamı ile enzimatik reaksiyonu durdurun. Ve hücreleri, 250 mikrolitre ortam artı FBS konsantrasyonu başına 7.5 kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin.Daha sonra, yuvarlak tabanlı 48 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 250 mikrolitre hücre tohumlayın ve hücrelerin kuyu tabanlarına eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yavaşça bir yandan diğer yana kaydırın. Daha sonra plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kültürler% 90 ila 95'lik bir birleşmeye ulaştığında, her bir oyuktaki süpernatanı, mililitre mitomisin C başına 10 mikrogram ile takviye edilmiş 250 mikrolitre taze

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Göç etme kapasitesi, mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinin temel bir işlevidir. Bununla birlikte, hasardan sonra göç kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek zordur. Bu protokol, hasardan sonra MSC göç kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek için titiz istatistikler kullanan, kolayca uyarlanabilir bir geçiş testini açıklar.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Hücre göç geliştirme, doku bakım ve onarım ve tumorigenesis için çok önemlidir ve büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler tarafından düzenlenmiştir. Bu iletişim kuralı nokta yöntemi, ekli, uyumlu cep yaprak yanıt microenvironmental ipuçlarını göçmen fenotip değerlendirmek için bir iki boyutlu, serbest geçiş tahlil açıklar.

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Bu çalışmada bir vitro modeli (arsenik etkisi hücresel geçiş gibi nasıl çevre kirletici maddeleri belirlemek için yara iyileşme sıfırdan testin) bir mekanizma olarak odaklanır. Bu içinde vitro tahlil değişiklikleri için in vivo deneyler önce hücresel göç hızlı ve erken belirtileri sağlar sonuçlar gösterilmektedir.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Ekipman yoğun yöntemler kullanılmadan hücre göçünün belirlenmesinde yeni bir yaklaşım sağlayan sıfırdan geçiş testini uygun maliyetli bir yöntem savuruyoruz. Bu protokolde fibroblastlar kullanılırken, ek hücre tipleri ve hücre göçü üzerindeki etkileri incelemek için uyarlanabilir ve kullanılabilir.

Maliyet Etkin ve Uyarlanabilir Çizilme Göçü Tsası

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Bu çalışma, iki boyutlu (2D) çizik yara migrasyon testini ve üç boyutlu (3D) küresel filizlenme testini, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya dahil olmak üzere ilgili aşağı akış analiz yöntemleriyle birlikte, in vitro anjiyogenezi incelemek için uygun testler olarak sunmaktadır.

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Öğrenin, otomatik optik mikroskop kullanarak kazı-kazan tahlili ile HaCaT hücrelerinde hücre göçünü nasıl test edeceğinizi. Bu yöntem, kronik yara ve kanser tedavileri için değerli bilgiler sunar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Daha fazla video keşfet