Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, memeli kan-beyin bariyerinin moleküler özelliklerini anlamayı amaçlayan biyokimyasal çalışmalar için serebral mikro damarları sıçan beyninden izole etmektir. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri fizyolojisi ve nörofarmakolojisinde, sağlık ve hastalıkta sıkı bağlantı proteinlerinin ve endojen taşıyıcıların düzenlenmesi, lokalizasyonu ve ekspresyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek tek hayvanlar arasındaki protein ekspresyonundaki doğal değişkenliği hesaba katarken, tek bir hayvandan yeterli sayıda yüksek kaliteli mikro damarı izole edebilmemizdir.

Bu tekniği gösteren, laboratuvarımdan seçkin bir lisans öğrencisi olan Bianca Reilly olacak. Metin protokolüne göre bir Sprague-Dawley sıçanını ötenazi yaptıktan ve başını kestikten sonra, tek bir enine kesi yaparak sıçan kafatasından cildi rezeke etmek için cerrahi makas kullanın. Rongeurs kullanarak, kafatası plakasını dikkatlice çıkarın ve beyni açığa çıkarın.

Ardından bir spatula ile organı çıkarın. Beynini ayırın ve izole edilmiş beyin dokusunu beş mililitre BMB ve 5.0 mikrolitre proteaz inhibitörü kokteyli içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Dokuyu işlemek için temiz bir Petri kabına aktarın.

Daha sonra, forseps kullanarak, serebral kortekse gevşek bir şekilde yapışmış olan dış meninksleri çıkarmak için beyni 12,5 santimetre çapında bir filtre kağıdına hafifçe yuvarlayın. Bu adım sırasında, beyin dokusu örneğinden tüm meningeal dokunun çıkarıldığından emin olmak için özen gösterilmelidir. Meninksler, beyin dokusundan kolayca çekilebilen şeffaf bir zar dokusu olarak görselleştirilebilir.

Beyin dokusunu filtre kağıdına hafifçe bastırın ve bu adımda filtre kağıdını sık sık çevirerek dokuyu tekrar yuvarlayın. Daha sonra, forseps kullanarak, koroid pleksusu serebral hemisferlerden ayırın. Ardından, beyin dokusunu tekrar nazikçe düzleştirin ve beyaz maddeye bitişik koku soğancıklarını çıkarmak için forseps kullanın.

Kortikal beyin dokusunu soğutulmuş bir cam havan içine yerleştirin. Ardından, proteaz inhibitörü kokteyli ile beş mililitre BMB ekleyin. Üstten güçlü bir homojenizatör kullanarak, harcın içine bir havan tokmağı yerleştirin ve 3.700 rpm'de 15 yukarı ve aşağı vuruş kullanarak beyin dokusunu homojenize edin.

Daha sonra homojenatı etiketli santrifüj tüplerine dökün. Numuneler arasında, havaneli temizlemek için% 70 etanol kullanın. Santrifüjleme işlemini gerçekleştirmek için, beyin homojenatı içeren etiketli her bir santrifüj tüpüne 8.0 mililitre% 26 dekstran çözeltisi ekleyin.

Tüpü iki kez ters çevirin ve ardından numuneyi iyice girdaplayın. Beyin homojenat çözeltisinin %26 dekstran çözeltisi ile iyice karıştırılmasını sağlamak için her bir numunenin girdaplanmasını birden fazla açı kullanarak gerçekleştirin. Numuneleri 5.000 g ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire edin ve peleti proteaz inhibitör kokteyli ile 5.0 mililitre BMB'de yeniden süspanse edin. Ardından, iyice karıştırmayı sağlamak için peleti girdaplayın. Daha sonra, her bir santrifüj tüpüne 8.0 mililitre% 26 dekstran ekleyin ve az önce gösterildiği gibi girdap yapın.

Ardından numuneleri tekrar santrifüjleyin. Bir vakum şişesi ve cam pipet kullanarak, süpernatanı aspire edin ve beyin mikro damarını içeren peletin bozulmadığından emin olun. Proteaz inhibitörü ile BMB'deki peleti yeniden süspanse edin ve ardından iki kez daha %26 dekstran yapın.

Son santrifüjlemeden sonra, numuneyi yeniden süspanse etmek için her pelet ve girdaba 5.0 mililitre BMB ekleyin. Bu videoda gösterilen protokol kullanılarak, sıçan beyninden sağlam mikrodamarların başarılı bir şekilde izole edilmesi gerçekleştirildi. Bu görüntüde, mikrodamar, beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin plazma zarında iyi eksprese edilen bir taşıyıcı olan Oatp1a4'e karşı bir antikor kullanılarak boyanmıştır.

Western blot ile gösterildiği gibi, dişi Sprague-Dawley sıçanlarından toplanan mikro damarlardan elde edilen membran preparatları, beyin mikrovaskülatürü için bir belirteç protein olan CD31 olarak da bilinen PECAM-1 ile zenginleştirildi. Bu protokolün optimizasyonu sırasında, iki ve dört dekstran santrifüjleme aşaması kullanılarak hazırlanan membran örneklerinde PECAM zenginleştirmesi gözlenmiştir. Bradford protein tahlili ile belirlendiği ve bu tabloda listelendiği gibi, membran preparatları tipik olarak mililitre başına 5.0 miligram ile mililitre başına 10.0 miligram arasında değişen protein konsantrasyonları verir.

Protein değerleri, standart olarak BSA kullanılarak oluşturulan standart bir eğriye göre belirlendi. Burada gösterilen, BBB taşıma proteini Glut1 için bir batı lekesidir. Her bir membran örneğinde bu yüksek oranda eksprese edilen BBB proteini için 54 kilodaltonda net tek bantlar tespit edildi.

Bu grafik, erkek ve dişi sıçanlarda BBB'de daha yüksek bir Glut1 ekspresyonunu göstermektedir. Erkek ve dişi hayvanlar arasında sodyum / potasyum ATPaz ekspresyonunda bir fark gözlenmemiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila 2 1/2 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, protokol boyunca tüm numuneleri buz üzerinde tutmayı unutmamak ve santrifüjleme adımlarından sonra mikrodamar peletinden süpernatanı aspire ederken dikkatli olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kan-beyin bariyerinde aynı protein kompleksi içindeki farklı proteinlerin ilişkisi gibi ek soruları yanıtlamak için mikro damar örnekleri üzerinde ko-immünopresipitasyon analizi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kan-beyin bariyeri fizyolojisi ve nörofarmakoloji alanındaki araştırmacıların, sağlıkta ve nörolojik hastalıkların kemirgen modellerinde kan-beyin bariyerinin moleküler özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlık ve hastalıkta kan-beyin bariyeri biyolojisi ile ilgili kendi çalışmalarınız için yüksek kaliteli mikro damarları sıçan beyninden nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.