Name: Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin, sıçan beyninden serebral mikrodamarları izole etmek için bu güvenilir yöntemi. Biyokimyasal analizlerle kan-beyin bariyeri moleküler özelliklerini inceleyin ve nörofarmakoloji araştırmalarınızı ilerletin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser PTR için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-NS084941) ve Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ADHS16-162406) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. WA geçmiş bir ulusal kurumları sağlık eğitim Grant'ın (T32-HL007249) için önceden doktora bir randevudan destek aldı.

Tüm yordamlar ana hatlar aşağı bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olan ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) ve hayvan araştırma için uygun: In Vivo deneyler (varış) yönergeleri raporlama. İletişim kuralı için yordamsal akışı şekil 1' de tasvir edilir.
1. kurulum yordamı için
<ol><li>Beyin microvessel arabellek (BMB) hazırlayın. Temiz bir ölçek 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA ve 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (yani, Tris) Bankası ağırlığında tarafından başlatın. 1.0 L deiyonize su ekleyin. Manyetik karıştırıcı kullanarak BMB arabellek bileşenleri karıştırmak. Bir kez belgili tanımlık eriyik iyice karışık, pH 7.4 1.0 M HCl kullanarak için ayarlayın.</li>
	<li>Hayvanlar anesthetizing önce % 26 dextran (MW 75.000) çözüm (w/v) hazırlayın. Dextran çözüm aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın. Not: Dextran yaklaşık 1,5-2 h sulu arabellekte çözülmeye alabilir, çünkü bu çözüm önceden hazırlamak kritik önemlidir.<ol>
<li>Temiz bir kabı içine toz dextran (100 mL arabellek başına 26 g) dışarı tartın.</li>
		<li>BMB uygun hacmi ölçmek ve ayrı, temiz kabı dağıtmak.</li>
		<li>Yavaş yavaş BMB toz dextran içeren kabı dökün. El ile bir cam heyecan çubuk kullanarak BMB dökme sırasında toz dextran karıştırın.</li>
		<li>PH 7.4 ile kullanmak için 1.0 M HCl hemen önceki için ayarlayın. Not: Beyin yüzdeki 12 bireysel Sprague-Dawley Rat üzerinden bir tipik yalıtım (erkek veya kadın; 3 ay-in yaş; 200-250 g) 200 mL dextran çözeltisi (yani, 52 g dextran BMB 200 ml) gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. çıkarma beyin dokusunun Sprague-Dawley Rat
<ol><li>İstenen deneysel tedavi aşağıdaki anestezi ketamin (50 mg/kg; 2.5 mL/kg ı.p.) ve xylazine kullanan Sprague-Dawley Rat (10 mg/mL; 2.5 mL/kg ı, p.). Sırasıyla ketamin ve son konsantrasyonları 20 mg/mL ve 4,0 mg/mL % 0,9 serum xylazine oranında seyreltin. Hayvanlar tarafından IACUC yönergelere uygun olarak bilenmiş bir Giyotin kullanarak işten çıkarma ötenazi. Hem erkek hem de dişi Sprague-Dawley Rat için aynı yordamı kullanın.</li>
	<li>Sıçan kafatası derisini Cerrahi makas kullanarak tek bir çapraz kesim yaparak çıkarabileceğim.</li>
	<li>Rongeurs kullanarak, dikkatle kafatası plaka kaldırmak ve beyin bulaşmasına neden.</li>
	<li>Bir spatula kullanarak beyin kaldırın. Cerebrum ayırmak ve izole beyin dokusu BMB 5 mL içeren 50 mL konik tüp yerleştirin. Proteaz inhibitörü kullanılmadan önce kokteyl BMB arabellek hemen 1.0 mL 1.0 μL ekleyin.</li>
</ol>3. beyin işleme
<ol><li>Beyin dokusu 50 mL konik tüp sizden temiz bir petri kabına aktarın.</li>
	<li>Forseps kullanarak, yavaşça beyin gevşek serebral korteks yapıştırılır vardır dış zarları kaldırmak için 12,5 cm Çap filtre kağıdı rulo. Yavaşça beyin dokusu filtre kağıdı karşı basın ve doku tekrar rulo. Filtre kağıdı bu adımı sırasında sık sık açmak.</li>
	<li>Choroid plexus serebral hemisferlerin forseps kullanarak ayırın. Not: Choroid plexus serebral ventrikül yüzeye yerelleştirilmiş bir açık membranöz doku olarak görünür.</li>
	<li>Yavaşça beyin dokusu dümdüz ve kalan meninkslerde ve olfaktör ampuller forseps kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Kortikal beyin dokusu soğutulmuş cam harç yerleştirin. BMB içeren proteaz inhibitörü kokteyl 5.0 mL harç için ekleyin.</li>
	<li>Bir genel gider güç homogenizer kullanarak, 15 vuruş yukarı ve aşağı 3.700 rpm'de kullanarak beyin dokusu lunaparkçı. Homojenizasyon bir 10 mL harç ve havaneli doku taşlama kullanarak gerçekleştirin. Tek tek her örnek homojenizasyon arasında % 70 etanol kullanarak havaneli temiz. Not: vuruş hızı açısından tutarlı olmalıdır homojenizasyon ve parlaklığı.</li>
	<li>Homogenate etiketli santrifüj tüpler içine dökün.</li>
</ol>4. Santrifüjü adımları
<ol><li>Beyin homogenate içeren her etiketli santrifüj tüpü 8.0 mL % 26 dextran çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Tüp iki kez ters çevir'i ve sonra iyice girdap örnek. Vortexing beyin homogenate çözüm % 26 dextran çözüm ile kapsamlı bir karıştırma sağlamak için birçok açıdan kullanarak her örneğinin kuralları.</li>
	<li>Santrifüj örnekleri, 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika Not: bazı analizleri için beyin yüzdeki beyin parankimi ile karşılaştırmak yararlı olur. Beyin parankimi ifadede protein değerlendirilmesi-meli var olmak gerekli, bu Santrifüjü adım (yani, beyin parenkima kesir) süpernatant toplanacak ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.</li>
	<li>Bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant kaldırmak ve Pasteur pipet cam. Not: Pelet rahatsız etmek dikkat alınmalıdır. Aksi takdirde, hangi önemli ölçüde bu yordamdan protein verim azalacak toplanan beyin yüzdeki miktarı azalacaktır.</li>
	<li>Pelet BMB içeren proteaz inhibitörü kokteyl (yani, 1.0 μL proteaz inhibitörü BMB arabellek 1.0 mL kokteyl) 5.0 ml resuspend. Girdap Pelet ayrıntılı karıştırma sağlamak için.</li>
	<li>% 26 dextran 8.0 mL her santrifüj tüpü ve girdap bu protokolü 4.1-4.2 adımlarda açıklandığı gibi ekleyin.</li>
	<li>Santrifüj örnekleri, 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika</li>
	<li>Bir vakum şişe ve cam pipet kullanarak, süpernatant Aspire edin ve beyin microvessel içeren bu Pelet değil bozulur emin olun. Not: tüp duvara yapıştırılır aşırı malzeme yüzdeki içermiyor ve dikkatle temizlenmesi ve kaldırıldı.</li>
	<li>Ek bir 4,8 4,5 adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Bir kez 4 dextran Santrifüjü adım tamamlanmıştır, her Pelet ve örnek resuspend girdap BMB 5.0 mL ekleyin. Not: adım 4,10 tamamlanmasını takiben, protein yerelleştirme analizi için bütün yüzdeki toplanabilir. Bu 50 μL yeniden askıya alınmış microvessel Pelet aliquot alarak ve cam mikroskop slaytta bulaşması gerçekleştirilebilir. Yüzdeki o zaman ısı için bir ek 10 dk. slaytlar sonra çalışmalar görüntüleme için gerekli kadar 4 ° C'de depolanan için buz gibi etanol fiksasyonu ardından Isıtma blokta 10 min 95 ° C'de sabit vardır.</li>
</ol>5. ultrasantrifüj toplam beyin mikrovasküler membranlar örnekleri hazırlamak için
<ol><li>Örnekleri soğutulmuş cam homogenizer aktarın.</li>
	<li>Bir genel gider güç homogenizer kullanarak, 8-10 vuruş aşağı yukarı 3000 rpm'de kullanarak beyin dokusu lunaparkçı. Homojenizasyon bir 10 mL harç ve havaneli doku taşlama kullanarak yapılır. Tek tek her örnek homojenizasyon takip % 70 etanol kullanarak havaneli temiz.</li>
	<li>Ultracentrifuge tüpler temizlemek için örnekleri aktarın. Numara ve bireysel her tüpün tartın. Denge ve tüpler yükleme ultracentrifuge rotor içine önce çift. Not: Tüm ağırlığında ve ultracentrifuge tüpler eşleştirme kapaklar ile üzerinde tüp ağırlıklar doğru ölçüm sağlamak için yapılmalıdır.</li>
	<li>Santrifüj örnekleri 150.000 x g 4 ° C'de 1 h için de</li>
	<li>Bir vakum şişe ve cam Pasteur pipet, kullanarak Aspire süpernatant kullanarak bakım kapiller membran Pelet bozmaya değil.</li>
	<li>Pelet boyutuna göre deiyonize su ve BMB bir 1:1 (v/v) oranı oluşur depolama arabellek uygun bir birimi ekleyin. Genellikle, granül 400-500 μL depolama arabellek içinde resuspended. Proteaz inhibitörü kokteyl 1.0 μL depolama arabellek 1.0 mL başına oranında depolama arabellek ekleyin.</li>
	<li>Girdap örnekleri Pelet depolama arabellek resuspend.</li>
	<li>Bir cam Pasteur pipet kullanarak, kapiller membran örnekleri etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
	<li>Geçiş örnek bir iğne aracılığıyla şırınga 5 x örnek iyice karıştırılır ve hücresel yok toplamları bulunduğundan emin olun.</li>
	<li>Örnekleri-80 ° analiz için gerekli kadar C'de depolayın. Not: Her microvessel membran örnek Protein içeriği Bradford yöntemi kullanılarak ölçülür.</li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection%3A+Relevance+to+Treatment+of+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cent+Nerv+Syst+Dis%22%5BJournal%5D)">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802(2017).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transporters%3A+promoting+blood-brain+barrier+repair+in+response+to+oxidative+stress+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury.</a> Brain Res. 1623, 39-52 (2015).</li>
<li>Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypoxia-reoxygenation+on+rat+blood-brain+barrier+permeability+and+tight+junctional+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+oligomeric+assemblies+at+tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier+are+altered+by+hypoxia+and+reoxygenation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress.</a> J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).</li>
<li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li>
<li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li>
<li>Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+inhibition+prevents+inflammatory+pain+induced+changes+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier.</a> Brain Res. , 6-13 (2008).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li>
<li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain%3A+a+role+for+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li>
<li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li>
<li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+%28Oatp1a4%29+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+to+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li>
<li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li>
<li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li>
<li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li>
<li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li>
<li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li>
<li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+%28Mrp1%29+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li>
<li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier%3A+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makalede, taze sıçan beyin dokusundan izole yüzdeki membran protein örnekleri hazırlama basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. İzole microvasculature sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve/veya membran hazırlıklar nesil için çeşitli yaklaşımlar içinde edebiyat13,20,21,22 bildirilmiştir , 24. microvessel yalıtım Protokolü yukarıda açıklanan ilke olarak benzer ols...

Kan - beyin bariyerini (BBB), merkezi sinir sistemi (MSS) ve sistemik dolaşımı arasındaki arayüzü var ve beyin homeostazı bakım içinde önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, BBB işlevleri tam olarak kontrol çözünen konsantrasyonları beyin hücre dışı sıvı ve verimli bir şekilde beyin dokusu tarafından CNS1önemli metabolik taleplerini yerine getirmek için gerekli olan bu besin kaynağı. Öncelikle mikrovasküler endotel hücre düzeyinde var, BBB, potansiyel olarak zararlı xenobiotics yapamadığı sağlarken beyin parankimi erişmek bazı maddelerin etkinleştirmek ayrık mekanizmaları sahip olması gereken bu roller ima birikir. Nitekim, beyin mikrovasküler endotel hücreleri Poşlu değildir ve sigara seçici geçirgenlik2eksikliği sağlar sınırlı pinocytosis sergilemek. Ayrıca, beyin microvessel endotel hücreleri hızlı bir fiziksel "bitişik endotelyal hücreler arasında mühürle" ve büyük ölçüde kan kaynaklı maddeler paracellular Difüzyon beyin içine kısıtlamak formu için hareket sıkı Kavşağı ve adherens junction proteinler parankimi. Nitekim, seçici geçirgenlik endojen ve eksojen maddelerin alımı ve sızma taşıyıcı3fonksiyonel ifade gerektirir. Genel olarak, sıkı kavşaklar, adherens kavşaklar ve Işınlayıcılar konser BBB benzersiz bariyer özelliklerini korumak için çalışır.
BBB fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bir engeldir. Örneğin, hipoksi/reoxygenation stres vasküler işaretçileri için artan paracellular geçirgenliği ile ilişkili olduğu ifade (occludin,Yani, zonulae occluden-1 (ZO-1)), kritik sıkı kavşak proteinlerin modüle için gösterilen olarak sukroz4,5,6. Travmatik beyin hasarı7 ve çevresel enflamatuar ağrı8,9ortamda BBB, benzer gözlemler yapılmıştır. Bu aynı hastalıklar da taşıma mekanizmaları BBB10,11,12,13,14modüle. Nitekim, hipoksi/reoxygenation yaralanma organik anyon polipeptit 1a4 taşıma fonksiyonel ifade artırır (Oatp1a4) BBB, hangi yol açabilir için belirli Oatp taşıma yüzeylerde kan beyin taşımacılığının önemli artışlar gibi taurocholate atorvastatin ve13. BBB özellikleri, farmakoterapi kendisi, ilaç-ilaç etkileşimleri ve beyinde uyuşturucu etkinliği her iki derin değişiklikler için bir temel oluşturabilir bir mekanizma tarafından da değiştirilebilir. Örneğin, asetaminofen hedefleri nükleer reseptör sinyal mekanizmalar beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde kritik sızma ışınlama P-glikoprotein (P-gp) fonksiyonel ifade artırır ve zamana bağımlı analjezi değiştirir morfin tarafından doğan, bir opioid analjezik ilaç ve kurulan P-gp substrat15taşımacılığı. Hastalıklar veya uyuşturucu indüklenen, BBB değişiklikleri kapsamlı bir anlayış aynı zamanda kimlik ve bu değişiklikleri denetleyen belirli düzenleyici mekanizmaları karakterizasyonu gerektirir. Nitekim, ayrık sinyal yolları sıkı kavşak proteinler16,17 ve Işınlayıcılar15, moleküler ifade denetleyen beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde tespit edilmiştir 18,19. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler karmaşık moleküler yolları BBB sıkı kavşak düzenlenmesi ve Işınlayıcılar sağlık ve hastalığında katılmaktadırlar gösterir.
BBB çalışmanın önemli bir mücadelesine izole yüzdeki beyin dokusundan deneysel hayvan ve membran örnekleri sonraki hazırlanması elde edilmesi için basit ve etkili bir yöntem mutlak zorunluluktur. Böylece onlar hem beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ve diğer hücre tipleri huzurunda sınırlı bu örnekler hazırlanmalıdır. Son birkaç yıl içinde--dan kemirgen beyin microvasculature yalıtım için birden fazla metodolojiler içinde bilimsel literatür13,20,21,22bildirilmiştir. Bu makalede bir basit, sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi protein ifade analiz için kullanılabilecek endotel membran zenginleştirilmiş örnekleri hazırlanması ve yüzdeki--dan sıçan beyin yalıtım için. Bir avantaj bu microvessel yalıtım protokol örnek hazırlıklar kaliteli ve yeterli protein verim ile bireysel bir deneysel hayvan edinmek için yeteneğidir. Bu protein ifadesindeki arası hayvan değişkenlik dikkate sağlar. Protein değişiklikleri BBB, gerçek büyüklükte aşırı tahmini (veya altında tahmin) şimdi önlenebilir çünkü böyle bir önceden bu iletişim kuralı yer sağlamlık BBB çalışmaların büyük ölçüde iyileşmiştir. Ayrıca, birden çok Santrifüjü adımı dextran ile eklenmesi nöronlar gibi istenmeyen hücresel bileşenlerin kaldırılmasını kolaylaştırmak ise deneysel örneklerinde yüzdeki geliştirilmiş zenginlik sağlar.

<table><tbody><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Dekstran (MW 75,000)</td> <td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Mikrodamarları beyin parankiminden ayırmak için santrifüjleme adımlarında kullanılan Dextran</td></tr><tr><td>Zetamin</td><td>MWI Hayvan Sağlığı</td> <td># 501072</td><td>Genel anestezik</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Batı Tıbbi Malzeme</td> <td># 5530</td><td>Genel anestezik</td></tr><tr><td>% 0.9 salin çözeltisi</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>Genel anestezi seyreltici</td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı (12,5 cm çap)</td><td>VWR</td> <td># 28320-100</td><td>Beyin dokusundan meninkslerin çıkarılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri</td><td>Sarstedt</td> <td># 60.540.386</td><td>Dekstran santrifüjleme adımları için kullanılan tek kullanımlık tüpler</td></tr><tr><td>Pierce & trade; Coomassie Plus (Bradford) Testi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Membran preparatlarında protein konsantrasyonunun ölçümü</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homojenizatör</td><td>DWK Yaşam</td> <td>Bilimleri#903475</td><td>Numunelerin homojenizasyonu için gereklidir</td></tr><tr><td>10.0ml cam havan ve havaneli doku öğütücü</td><td>DWK Yaşam</td> <td>Bilimleri#358039</td><td>Numunelerin homojenizasyonu için gereklidir</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Tamponların pH ayarlaması için gereklidir</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td># 23210</td><td>Bradford Testi için protein standardı</td></tr><tr><td>Standart Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td> <td># 91100-12</td><td>Beyin dokusunun diseksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Güzel Bilim Araçları</td> <td># 16020-14</td><td>Beyni izole etmek için kafatasını açmak için kullanılır</td></tr><tr><td>50 ml konik santrifüj tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td># 352070</td><td>İzolasyonu takiben beyin dokusunun toplanması için kullanılır</td></tr><tr><td>Cam Pastör Pipetleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td># 13-678-20C</td><td>Dekstran dönüşlerini takiben hücresel kalıntıların aspirasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Etanol, susuz</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 459836</td><td>Doku öğütücüyü temizlemek için kullanılır; damıtılmış su</td></tr> <tr><td>ile% 70 oranında seyreltilmişUltrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman-Coulter#</td><td>41121703</td><td>Numunelerin ultrasantrifüjlenmesi için kullanılır</td></tr></tbody></table>

membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Kan - beyin bariyerini (BBB) çeşitli patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bariyer dokudur. Bu uyaranlara kaynaklanan bu tür değişiklikler büyük ölçüde ilaç dağıtım beyne modüle ve, uzantısı tarafından (CNS) hastalıkları merkezi sinir sistemi tedavisinde önemli sorunlar neden. Farmakoterapi, etkileyen birçok BBB değişiklikler lokalize ve endotel hücre düzeyinde ifade proteinleri içerir. Gerçekten de, böyle bir bilgiye BBB fizyolojisi sağlığı ve hastalıkları üzerinde insan bu membran proteinlerinin büyük ilgi yol açtı. Bir temel bilim araştırma açısından bu deneysel hayvan--dan hasat beyin dokusundan yüzdeki yalıtım için basit ama güçlü ve tekrarlanabilir bir yöntem için bir gereklilik anlamına gelir. Taze izole yüzdeki membran örnekleri hazırlamak için bu örnek hazırlıklar endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ama nörovasküler birimi (astrocytes, microglia, nöronlar, varlığında diğer hücre tipleri sınırlı esastır perisitlerden). Bir yararı protein ifadesi deneysel bir nüfus içinde gerçek değişkenliği yakalamak için bireysel hayvanlardan örnekleri hazırlamak için yeteneğidir. Bu el yazması kullanılmaktadır sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntem ile ilgili ayrıntılar sağlanmaktadır. Örneklerinden elde edilen, microvessel zenginleştirme dextran örnek arabellekte nerede dahil dört Santrifüjü adımlar kullanılarak elde edilir. Bu iletişim kuralı diğer laboratuvarlar için kendi özel uygulamalar tarafından kolayca adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı oluşturulan örnekleri üzerinden BBB yanıt fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara karşı anlayış büyük ölçüde yardımcı olabilir protein analizi deneyler sağlam deneysel veri vermeye gösterilmiştir.

Deneysel akışı sıçan beyin yüzdeki izolasyonu ve microvessel membran örnekleri hazırlanması için şekil 1' de gösterilmiştir. Burada sunulan yordamını kullanarak--dan sıçan beyin sağlam yüzdeki başarılı yalıtım gösterilmiştir (şekil 2A). Bu gemiler Santrifüjü dextran ve hemen ultrasantrifüj membran örnekleri (yani, aşağıdaki tamamlanma adımının 4.10) hazırlamaya başlamadan önce tamamlanmasının ardından elde edilmiştir. Bu görüntüd...

Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

Bu prosedürün genel amacı, memeli kan-beyin bariyerinin moleküler özelliklerini anlamayı amaçlayan biyokimyasal çalışmalar için serebral mikro damarları sıçan beyninden izole etmektir. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri fizyolojisi ve nörofarmakolojisinde, sağlık ve hastalıkta sıkı bağlantı proteinlerinin ve endojen taşıyıcıların düzenlenmesi, lokalizasyonu ve ekspresyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek tek hayvanlar arasındaki protein ekspresyonundaki doğal değişkenliği hesaba katarken, tek bir hayvandan yeterli sayıda yüksek kaliteli mikro damarı izole edebilmemizdir.Bu tekniği gösteren, laboratuvarımdan seçkin bir lisans öğrencisi olan Bianca Reilly olacak. Metin protokolüne göre bir Sprague-Dawley sıçanını ötenazi yaptıktan ve başını kestikten sonra, tek bir enine kesi yaparak sıçan kafatasından cildi rezeke etmek için cerrahi makas kullanın. Rongeurs kullanarak, kafatası plakasını dikkatlice çıkarın ve beyni açığa çıkarın.Ardından bir spatula ile organı çıkarın. Beynini ayırın ve izole edilmiş beyin dokusunu beş mililitre BMB ve 5.0 mikrolitre proteaz inhibitörü kokteyli içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Dokuyu

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hasarlı BBB'yi geçen ve beyne ulaşan florofor etiketli albümini intravenöz olarak enjekte edin.

Kan-Beyin Bariyer Bütünlüğünün Elektron Mikroskobu Analizi için Sıçan Beyni Kesitlerinin Hazırlanması

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve enzimatik sindirim yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak bir sıçan beyninden mikro damarların izolasyonunu sunar. İzole edilen mikro damarlar, endotel hücre kolonileri elde etmek için kollajen ve fibronektin matrisi ile önceden kaplanmış bir kültür şişesinde kültürlenebilir.

Sıçan Beyin Mikrodamarlarından Endotel Hücre Kültürü: Sıçan Beyninin Mikro Damarlarından Endotel Hücrelerini İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu video, nöronlar ve glial hücrelerle birlikte kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturan bir farenin beyninden sağlam damarların izolasyonunu göstermektedir. İzole edilmiş damarlar, beyin homeostazının korunmasındaki rollerini incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Fare Beyin Damarlarının İzole Edilmesi: Murin Beyin Örneğinden Sağlam Damarları İzole Etmek İçin Bir Protokol

Bu video, sıçan beyinlerinden mikroglia'yı izole etmek ve kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir. Mikrogliaya özgü bir monoklonal antikor ile kaplanmış plakalar kullanılarak mikroglia'yı diğer nöronal ve nöronal olmayan hücrelerden ayırmayı gerektirir.

Sıçan Beyinlerinden Serumsuz Besiyeri Kullanılarak Mikroglia İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, ötenazi uygulanmış sıçanlardan beyin mikro damarlarını izole etme sürecini göstermektedir. Beynin diseksiyonunu, dokunun temizlenmesini ve mekanik sindirimi ve ardından mikro damarların saf fraksiyonunu izole etmek için tekrarlanan santrifüjlemeyi içerir.

Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

Bu video, donmuş sıçan beyin dokusunun enzimatik sindirim ve mekanik öğütme kullanılarak tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasını göstermektedir. Hazırlanan hücreler, akış sitometrisi veya gen ekspresyon analizi gibi sonraki uygulamalar için etanol ile sabitlenir ve geçirgenleştirilir.

Donmuş Sıçan Beyin Dokusundan Tek Hücreli Süspansiyon Elde Edilmesi

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.

Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması

Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

Öğrenin, sıçan beyninden serebral mikrodamarları izole etmek için bu güvenilir yöntemi. Biyokimyasal analizlerle kan-beyin bariyeri moleküler özelliklerini inceleyin ve nörofarmakoloji araştırmalarınızı ilerletin.

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

Daha fazla video keşfet