Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

Bu model, üst sindirim sistemleri için konakçı mikro yönleri ayarlamada bir sonraki adımdır. Mekanik araştırma sorularının ele alınmasına izin veriyor ve gıda, ilaç ve nutrasötik endüstrisi ve ayrıca toksikoloji için birçok fırsat sunuyor. Bu tekniğin ana avantajı, gastrointestinal sistemin bir modelini, karmaşık bir mikrop topluluğu içeren konakçı mikro arayüzü ile birleştirmesidir.

Çok uygulanabilir ve aynı zamanda çok esnektir. Bu metodoloji, patojen canlılığını ve sonraki bilgileri değerlendirmek için diğer hücre tipleri kullanılarak benimsenebilir. Değişiklikler ayrıca probiyotik karışımların kolonizasyon kapasitesine ve nihayetinde bakterilerin sistemik dolaşım başına potansiyel etkisine yardımcı olmak için de kullanılabilir.

Başlamak için, ortamı otoklavlayın ve ardından mililitre başına beş mikrogram ve mililitre menadion başına bir mikrogram ekleyin. Ortamın dokuz mililitresini Hungate tüplerine dağıtın ve tüpleri bir lastik tıpa ve bir alüminyum kapakla kapatın. Daha sonra tüpleri% 90 nitrojen ve% 10 karbondioksit karışımı ile yıkayın.

Bir mililitre anaerobik ortam almak için şırıngayı kullanın ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Her bakteri türünün tek kolonilerini seçin ve bunları ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra kolonileri anaerobik modifiye BHI'ye aktarın ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kültürleri mililitre başına 10 ila beşinci hücreye seyreltmek için filtrelenmiş sterilize edilmiş PBS kullanın. Ardından, hücre sayısını ölçmek için siber yeşil propidyum iyodür boyası ile akış sitometrisini kullanın. Mikrobiyom topluluğunun bileşimini ve canlılığını değerlendirmek, deneyimizdeki önyargıyı önlemek için çok önemlidir.

Hücre kültürü ortamını şişelerden çıkarın, ardından hücreleri bir kez yıkamak için kalsiyum veya magnezyum içermeyen beş mililitre PBS kullanın. Hücrelere iki mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi hafifçe hareket ettirerek çözeltiyi dağıtın.

Daha sonra 1.5 mililitre tripsin çözeltisini çıkarın ve şişeyi 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol ettikten sonra, tripsini etkisiz hale getirmek için şişeye beş mililitre takviye edilmiş hücre kültürü ortamı ekleyin ve homojen bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunun 50 mikrolitrelik bir alikotunu hemen steril% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile KCO2 hücreleri için 1: 1 hacim / hacim oranında 1: 5 hacim / hacim oranında HT29MTX için karıştırın.

Pipetleme ile karıştırın ve hücreleri mikroskop altında saymadan önce süspansiyonu bir sayma odasına yükleyin. KCO2 ve HT29MTX hücre süspansiyonlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, süspansiyonları homojenize edin ve karşılık gelen hacimde KCO2 ve HT29MTX hücrelerini, takviye edilmiş hücre kültürü ortamı ile önceden doldurulmuş steril bir kaba ekleyin. Önceden inkübe edilmiş ortamı önceden hazırlanmış odanın apikal tarafından aspire edin.

Hücre süspansiyonunu pipetleme ile nazikçe karıştırın ve 1,5 mililitreyi hazne eklerinin apikal bölmesine aktarın ve sürekli homojenizasyonu sağlamak için hücre süspansiyonunu her bir ila üç kuyucukta bir karıştırın. Hücreleri kuyuya eşit şekilde yaymak için plakaları yavaşça ileri geri ve sonra sağdan sola hareket ettirin. Plakaları inkübatöre aktarın ve plakaların hareketini tekrarlayın.

Hücrelerin oturtulması, kuyucukta eşit bir yayılma sağlamak için hücre süspansiyonunun sürekli homojenizasyonu ile yapılmalıdır. ASA'ya başlamadan önce epitel bariyeri bütünlüğünü ölçmek için, ölçümlere başlamadan önce kademe ekipmanının tam olarak şarj edildiğinden emin olun. Katman ekipmanını güç kaynağından ayırın ve plastik bir otoklav torbası ile örtün.

Elektrodu ölçüm cihazındaki giriş portuna sokmak için torbada bir delik açın. Ardından, katman ekipmanını akış kabinine aktarmadan önce torbaya %70 etanol püskürtün. Elektrodu dezenfekte etmek için elektrot uçlarını 15 dakika boyunca %70 etanole batırın.

Uçların 15 saniye kurumasına izin verin, ardından elektrodu durulamak için hücre kültürü ortamını kullanın. Hücrelerin akış kabini içinde oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Sayacın şarj cihazıyla bağlantısının kesildiğinden emin olun, ardından mod anahtarını Ohm'a ayarlayın ve güç anahtarını açın.

Elektrodu, daha kısa ucu ek parçaya ve daha uzun ucu kuyudan dışarı çıkaracak şekilde daldırarak hücre direncini ölçün. Elektrodu plaka ekine 90 derecelik bir açıyla tutun. Oral sindirimi simüle etmek için, bakteri topluluğunun üç mililitresini 50 mililitrelik steril bir tüpe aktarın ve üç mililitre simüle edilmiş tükürük sıvısı veya SSF ile karıştırın.

İnsan tükürüğü tip 9A'dan mililitre başına 75 birim alfa-amilaz ve domuz midesi tip 2'den litre başına iki gram müsin ekleyin. Karışımı 37 santigrat derece ve 100 RPM'de iki dakika inkübe edin. DNA ekstraksiyonu ve akış sitometrisi ölçümü için iki mililitrelik bir numune toplayın.

Mide sindirimini simüle etmek için, üç mililitre bakteriye dört mililitre simüle edilmiş mide sıvısı veya SGF ekleyin. Gerekirse pH'ı üçe ayarlamak için bir molar HCl kullanın. Numuneyi 37 santigrat derece ve 100 RPM'de iki dakika inkübe edin.

Sonra iki mililitrelik bir numune toplayın. İnce bağırsak sindirimi için, bakterilere dört mililitre simüle edilmiş bağırsak sıvısı veya SIF ekleyin. Gerekirse pH'ı ayarlamak için sodyum hidroksit kullanın.

Daha sonra numuneyi 37 santigrat derece ve 100 RPM'de iki dakika inkübe edin. Ve iki mililitrelik bir numune toplayın. İnce bağırsak sindiriminin hücre yoğunluğunu metin protokolüne göre yıkadıktan ve ayarladıktan sonra, apikal ortamı transwell sisteminden çıkarın ve 1.5 mililitre bakteri süspansiyonu ekleyin.

Sistemi genel hücre kültürü koşulları altında iki saat boyunca birlikte kültürleyin. İnkübasyonun ardından, videoda daha önce gösterildiği gibi epitel bariyerinin bütünlüğünü değerlendirmek için katman değerlerini ölçün. HT29MTX tarafından üretilen mukusu çözündürmek ve yapışan bakterileri geri kazanmak için 0.5 mililitre 10 milimolar n-asetilsistein ve HPSS ekleyin.

Plakaları çalkalama altında bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. NAC HPSS'yi bir mikrosantrifüj tüpünde geri kazanın ve hücreleri iki kez yıkamak için bir mililitre DPBS kullanın. Tek katmanların üzerine 0,5 mililitre %0,5 triton-x100 ekleyin ve pipetleme yaparak hücreleri parçalayın.

Ardından, girdaptaki sıvıyı bir dakika boyunca hızla geri kazanın. Deterjanla bakteri hücrelerine zarar vermemek için hız çok önemlidir. Örnekleri metin protokolüne göre analiz edin.

Burada bildirildiği gibi, tek tek suşlardan elde edilen bozulmamış hücrelerin sayısı, sentetik topluluğun oluşturulmasından önce mililitre başına yaklaşık 10 ila sekizinci hücre iken, çok türlü mikrokozmos, topluluğun kurulması sırasında% 90'ın üzerinde yaşayabilir hücreler içeriyordu. Canlı ölü miktarına bağlı olarak, mide geçişi sırasındaki asit pH'ının ve ince bağırsak sindirim sıvılarında bulunan biyo-tuzların bir sonucu olarak her sindirim adımından sonra bakteri canlılığı azalır. Mide ve ince bağırsak sindiriminin zorlu koşulları, bakterileri canlı hale getirebilir, ancak büyümeyen veya bölünmeyen canlı bakteriler olan kültürlenebilir hücrelerde değil.

Bu şekilde gösterildiği gibi, mukozal arayüzden geri kazanılan canlı hücreler, akış sitometrisi grafiğinde mavi renktedir. Bununla birlikte, bu mukus örnekleri kaplanırken herhangi bir büyüme gözlenmedi. Bakterilerin daha yüksek canlılık oranları gösterdiği fraksiyon, plaka sayımı ile ortaya çıkan hücresel döküntülerdir.

Koloni sayısı değişken olabilir, ancak metabolik olarak aktif bakterilerin varlığı daha az seyreltilmiş numunelerde bulunur. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, konakçıyı mikrokozmik olarak incelemek için nutrigenomik veya farmakomikrobiyom alanlarından araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Bu protokolü takiben, başarılı kolonizasyon sürecinde buna göre mekanik anlayış elde etmek için transkriptom veya metabolik analiz gibi diğer teknikler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, konakçı hücreler ve mikrobiyomun geri kalanı arasındaki çapraz konuşma da dahil olmak üzere sindirim süreçlerini temsil eden karmaşık in vitro modelin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenik bakterilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve biyo-güvenlik önlemlerini dikkate almanın önemli olduğunu unutmayın.