Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Bu yöntem, endokrinoloji alanındaki temel soruların yanı sıra, beynin endokrin sinyallerine verdiği yanıtları gözden geçirmek için yaptığımız araştırma gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, endokrin sinyallerin diğer dokulardan ayrılan beyin üzerindeki doğrudan etkilerini inceleyebilmenizdir. Bu işleme başlamak için, diseksiyondan sonra larva beyninin ventral ganglionunun daha kolay monte edilmesi için bir çukur oluşturmak üzere plastik bir kültür kabının alt merkezini çizmek için forseps kullanın.

Bir kürdan ile, göçüğün her iki tarafına küçük bir damla süper yapıştırıcı yerleştirin ve yapıştırıcıya bir tungsten çubuk takın. Ardından, küçük bir macun benzeri yeniden kullanılabilir yapıştırıcı parçası kullanarak, göçüğü çevreleyen dairesel bir duvar yapın. Larva beynini incelemek için, yumurtlamadan 90 ila 120 saat sonra larvaları toplayın ve yapışan yiyecek artıklarını gidermek için en az üç kez damıtılmış suyla yıkayın.

Ardından, buz gibi PBS ile doldurulmuş bir buçuk inçlik kare bir saat camına bir larva yerleştirin. Larvaların orta kısmını nazikçe tutmak için bir çift forseps kullanın. Beyni içeren larvanın ön kısmını vücudun geri kalanından ayırmak için ağız kancalarını nazikçe tutmak ve çekmek için başka bir forseps kullanın.

Daha sonra ön ucu forseps ile tutun ve larvaları ters çevirin. Hayali diskler, yağ cisimleri ve halka bezi gibi beyne bağlı yabancı dokuları çıkarın. Beyni ağız kısımlarından nazikçe ayırın.

Daha sonra görüntüleme haznesinde daha önce hazırlanan yapışkan halkanın iç kısmına 200 mikrolitre PBS uygulayın. Diseke edilmiş beyni PBS ile nazikçe bir Pasteur pipetine emdirin ve görüntüleme odasına aktarın. Görüntüleme odasında, ventral gangliyonlardan uzanan kas liflerini tutun ve beyni tungsten telinin altındaki çukura nazikçe yerleştirin.

Ardından, beyni görüntüleme için doğru konuma yerleştirmek için tungsten telini hafifçe yukarı çekin. Kalsiyum floresan görüntüleri elde etmek için, beyin eksplantını içeren görüntüleme odasını mikroskop altına yerleştirin. Objektif lensi PBS'ye değene kadar indirin ve parlak alan aydınlatması altında beyni konumlandırın ve odağa getirin.

Floresan ışığa geçin ve GCaMP başarı etiketli hücrelere odaklanmayı ayarlayın. Çekimi 250 ms/kare hızında, su soğutmalı modda 512 x 512 piksel çözünürlükte başlatın. Ardından, CCD kamera dinamik aralığı içinde floresan değerlerini elde etmek için pozlama süresini ayarlayın, ancak 16 bit görüntülerle 1000 rastgele birimden daha düşük olmamalıdır.

Görüntüleme parametreleri belirlendikten sonra, temel sinyal yoğunluklarını tespit etmek için peptit uygulamasından önce görüntüleri bir dakika boyunca alın. Daha sonra, hazırlanan peptit çözeltisinden 100 mikrolitre larva banyosuna pipetleyerek test peptidini doğrudan uygulayın. GCaMP başarı emisyonunu birkaç dakikalığına kaydedin.

Verileri analiz etmek için analiz yazılımını açın ve peptit uygulamasından önceki ilk çerçeveyi referans görüntü olarak kullanın. Ardından, Eklentiler, TurboReg'i seçin. Source (Kaynak) olarak serial image (Seri görüntü) dosyasını ve Target (Hedef) olarak referans imajı seçin.

Ardından, işleme yöntemi ve kalitesi için sırasıyla Sert Gövde ve Doğru'yu kontrol edin. Ardından, görüntü işlemeyi başlatmak için Batch'e tıklayın. Görüntü tepsisinde Analiz, Araçlar, ROI Yöneticisi'ni kullanarak birden çok ilgi alanı seçin.

Ardından, ROI Yöneticisi penceresinde Daha Fazla, Çoklu Ölçüm, Tamam'a tıklayarak piksel yoğunluğunu ölçün. Bu deneyde, Vahşi tip beyin CCHa2, Ghrelin ve Nosiseptin'e maruz bırakılırken, CCHa2 Reseptörü mutant beyin CCHa2'ye maruz bırakıldı. İnsülin üreten hücrelerdeki GCaMP6 sinyalleri, 250 ms / karede konfokal mikroskopi ile tespit edildi ve burada seçilen zaman noktalarının hareketsiz görüntüleri verilmiştir.

Her bir zaman noktasında ROI yoğunluğunun temel sinyal yoğunluğuna değişiminin oranı çizildi. ROI'ler, aynı odak düzleminde tespit edilen hücre gövdelerinde ayarlanır. Düz çizgiler, beş ila 10 örneğin ortalamasını gösterir ve noktalı çizgiler, ortalamanın standart hatasının üst ve alt sınırlarını işaretler.

Gölgeli alanlar, deneylerdeki sinyallerin değişimini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde oluşturulmuşsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, zarar görmemesi için beyin örneğini hızlı bir şekilde hazırlamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedür, reseptör özgüllüğü gibi ek soruları yanıtlamak için genetik ile birleştirilebilir. Bu protokolde kullanılan sistemin hazırlanması kolaydır ve tekrar kullanılabilir. Bu nedenle, bu protokol taramada olduğu gibi faydalı olacaktır.

Geliştirildikten sonra bu teknik, endokrinoloji ve sinirbilim alanındaki araştırmacıların Drosophila'da beyin fonksiyonlarını kontrol eden hormonal ağları keşfetmelerinin yolunu açtı.