Name: Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Keşfedin Drosophila larva beyninde kalsiyum görüntüleme ile endokrin sinyallere nöronal yanıtları. Bu yöntem hormonların beyin fonksiyonlarını doğrudan incelemeyi ve ilaç taramalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser oldu Grants-in-Aid tarafından bilimsel araştırmalara (15 K 07147, 17 K 07419) JSP'ler üzerinden (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), bir Inamori Vakfı araştırma hibe (HI) ve ortak kullanım/Araştırma Merkezi Program gelişimsel tıp için desteklenen Enstitüsü Moleküler Embriyoloji ve genetik, Kumamoto Üniversitesi (HS için). Biz Dr Azusa Kamikouchi ve Bay Daichi Yamada görüntüleme sistemi kullanarak onların yardım için teşekkür ederiz.

1. larva beyin Explants hazırlanması
<ol><li>Bir görüntüleme odası yapmak. Not: İstikrarlı kayıt beyin explants gergin gerekir. Burada, düşük maliyetli, el yapımı görüntüleme odası görüntüleme sistemi Ca2 + içinde kullanılır.<ol>
<li>Forseps kullanarak, alt bölümünde ortada bulunan bir göçük montaj daha kolay (adım 1.3, Şekil 1) yapma larva beyin ventral sinir düğümü için oluşturmak için bir plastik kültür çanak (35 mm x 10 mm) kaşı.</li>
		<li>Bir kürdan ile yapıştırıcı küçük bir damla çukuru her iki yanına koyun ve bir tungsten çubuk (0,125 mm çap, 6-7 mm uzunluk) tutkal için ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Küçük bir parça macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı kullanarak, yapmak dairesel duvar (10 mm çapında ve 3 mm yüksek) (Şekil 1) dent çevreleyen. Not: Duvar içinde boşluk daha sonra fosfat tamponlu tuz ile doldurulur (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M PO43 -, pH 7.4 ± 0,05 25 ° c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvan hazırlık Not: kalsiyum görüntüleme için sık doku özgü GAL4 ve UAS-GCaMP6sbileşimlerini kullanarak elde edilir faiz hücre tipi kalsiyum göstergesi, GCaMP6s, ifade edilir. Sinyal aday reseptör aracılı emin olmak için GCaMP6s da bir mutant reseptör içinde arızalı ile ifade edilir.<ol>
<li>Deneysel karşılaştırmalar vahşi türü ve mutantlar gibi farklı genotip için gerekli olduğunda, maç test larva GCaMP6 ifade düzey varyasyonları ve fizyolojik farklılıklar gelişim dönemleri nedeniyle önlemek için yaş.</li>
		<li>Ebeveyn sinekler (30 sinekler her seks için) standart sinek gıda gıda yüzeyinde yumurta döşeme izin vermek 8 h için içeren bir kültür şişe bulundurun. 25 ° C ve 60-%70 bağıl nem bir 12-h koyu döngüsü altında kitle kültürü larvaları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larva beyin diseksiyon<ol>
<li>90-120 h (AEL) döşeme yumurta sonra larva toplamak ve en az 3 kez yapisan gıda enkaz kaldırmak için distile su ile yıkayın.</li>
		<li>Yer bir larva bir kare 1.5-inç izle cam buz soğuk PBS ile dolu. Not: Sonraki iki adımı bu seyretmek cam diseksiyon mikroskop altında devam etmektedir.</li>
		<li>Forseps yavaşça larva orta parçası kapmak için kullanın. Başka bir forseps ağız kanca al ve yavaşça beyin vücudun geri kalanından içeren larva ön bölümünü ayırmak için ağız kanca çekmek için kullanın. Not: Alternatif olarak, cerrahi makas kullanılabilir.</li>
		<li>Ön uç forseps tarafından tutun ve larva mahvedecekler. Imaginal diskler, yağ organları ve yüzük bezi gibi beyin bağlı yabancı dokuyu. Yavaşça beyin ağız ayırın.</li>
		<li>PBS 200 µL macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı görüntüleme odasında yapılan halka içine uygulanır. Yavaşça Pasteur pipet disseke beynine PBS ile emmek ve ardından görüntüleme odanın içine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin görüntüleme odasına ayarlama<ol>
<li>Forseps kas lifleri ventral gangliyon uzanan kapmak için kullanın. Beyin yavaşça göçük altında tungsten kabloyu takın.</li>
		<li>Başka bir forseps kullanarak, çekme tungsten tel biraz ilâ yer beyin (Şekil 1) görüntüleme için doğru konumda.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 + floresans görüntüleri edinimi
Not: PBS içinde dalmış beyin explants 20 X su-daldırma objektif lens ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak yansıma (N.A. 0,5 =). PBS beyin hücrelerinde etkinleştirmez. Z ekseni görüntüleri gerekiyorsa, objektif lens piezoelektrik aktif lens nakliyeci ile monte edilir. Bir iplik disk confocal kafa zaman çözünürlüğü arttırmak için kullanılır. Düşük ışık görüntüleme için şarj kuplajlı cihaz kamera çarparak bir elektron mikroskobunun monte edilir. GCaMP6s floresan görüntüleme (uyarma/emisyon: 488/509 nm) uyarma bir dikroik ışın ayırıcı ve bir emisyon filtre ile 488-nm lazer gerektirir (Örn., 528 ± 38 nm bant bant filtre).
<ol><li>Beyin explant mikroskop altında içeren görüntüleme odası yerleştirin.</li>
	<li>PBS dokunana dek objektif lens indirin. Alan parlak aydınlatma altında beyin getirin ve odak haline getirmek. Floresan ışık geçiş ve GCaMP6s etiketli hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın. Not: GCaMP6s bazal yeşil floresans görünür olmalıdır.</li>
	<li>Edinme, 250 ms başlatmak/çerçeve uygun satın alma yazılımı kullanılarak su soğutmalı modunda 512 × 512 piksel çözünürlükte (Örn., µManager). CCD kamera dinamik alanı değerlerinin floresans elde, ama (rasgele adet), 1000'den daha düşük değil için pozlama süresi 16-bit görüntüleri (dinamik aralığı 0-65. 535 ') ile ayarlayın. Not: Düşük çekim hızı fotoğraf-GCaMP6s ağartma en aza indirmek için kullanılır. GCaMP6 ifade düzeyleri ve algılama sistemi duyarlılığını bağlıdır gibi çekim hızı her deneyde optimize edilmelidir. Bizim deneme kullanarak 100 ms olduğunu dilp2 > GCaMP6s. Z-bölümler için belirli bir görüntüleme derinliği gerekli olduğunda, birkaç z-bölümü görüntü pozlama zaman ve çerçeve aralıkları bağlı olarak elde edilebilir. Kamera yeterli Uzaysal Çözünürlük varsa, çekim hızı azaltmak için binning büyüklüğü (kasalar bir dijital piksel binned yonga üzerinde sayısı) artırılmalıdır.</li>
	<li>Bir kez görüntü parametreleri belirlenir, peptid yönetim temel sinyal yoğunluklarda (F0) tespit etmek için önce 1 dk. için görüntüleri almak.</li>
	<li>Test peptid uygulanır; Bunun için 100 µL PBS peptid çözümün dağıtılması ve en iyi bir konsantrasyon vermeye larva banyo hemen içine pipette. Not: Yavaş yavaş peptid çözüm enjekte (Örneğin, akış hızı 20 µL/s) içine bir pipet kullanarak banyo çözüm. PBS içinde çözünmüş ilgisiz sentetik peptid bir negatif kontrol kullanılır.</li>
	<li>Kayıt GCaMP6s emisyon birkaç dakika için.</li>
</ol>3. veri analizi
Not: Görüntüleme verileri çevrimdışı ImageJ ile analiz edilir. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında taşımak larva beyin pipetting neden olur. Bu nedenle, seri görüntülerin pozisyonel aberasyonları analiz daha önce düzeltilmelidir. Düzeltme gibi bir ImageJ eklenti, TurboReg kullanarak gerçekleştirilebilir.
<ol><li>Analiz yazılımı açın ve ilk kare (peptid uygulamadan önce) referans görüntü olarak kullanın.</li>
	<li>Eklentileri seçin | Kayıt | TurboReg.</li>
	<li>Seri resim dosyasının kaynak ve hedefolarak başvuru yansıması seçin.</li>
	<li>Katı vücut (paralel deplasman ve görüntülerin rotasyon) ve ("Hızlı" Bunun yerine hızlı analiz kaba) doğru işleme yöntemi ve kalite için sırasıyla kontrol edin.</li>
	<li>Toplu görüntü işleme başlamak için tıklatın.</li>
	<li>Analiz kullanarak ilgi (ROIs) birden fazla bölgesini seçin | Araçlar | ROI Yöneticisi ImageJ içinde.</li>
	<li>Piksel yoğunluğu daha tıklatarak ölçmek | Multi ölçü | Tamam ROI Yöneticisi penceresinde.</li>
	<li>ΔF/F0 hesaplamak = (F - F0) nereye F yatırım getirisi şiddeti uyarıcı anda ise F0 belirli bir deneysel olayından hemen önce bir zaman penceresi yoğunlukta /F0, (Örneğin, 30 kare önceki uyarıcı başlangıçlı).</li>
	<li>Birden fazla beyin örnekleri kullanarak, ortalama ve standart hata, her zaman bir noktada ortalamaya (SEM) elde etmek için istatistiksel işleme iletken denemeyi tekrarlamak.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li>
<li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li>
<li>Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100081">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).</li>
<li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100044">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).</li>
<li>Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100019">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).</li>
<li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors%3A+current+knowledge+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li>
<li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+peptide+hormones%3A+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10731132">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li>
<li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila%3A+where+DIMM+fits+in%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896(2008).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8381210">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252(2013).</li>
<li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26020940">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209(2015).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Sabado, V. aN., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015(2018).</li>
<li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan yöntemi Imaging Ca2 + işlev hormonların beyinde sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu. İçinde vivo, beyin hormon çeşitli endokrin organ alır. Buna ek olarak, beyin sürekli artan spontan nöronal etkinleştirme Nedenleri duyusal bilgileri algılar. Bu ex vivo sistem böyle gürültü ortadan kaldırır ve in vivo görüntüleme daha daha iyi bir sinyal/noise oranı verir. Bu sistemde moleküllerin tek başına veya birlikte test edilebilir. Peptid hormonlar yanı sıra, doğal vey...

Organ organ iletişim çevresel değişiklikler ile başa çıkmak için homeostazı korumak için evrimsel korunmuş bir stratejidir. İnsanlarda, endokrin bezleri hormon arereleased çeşitli kan dolaşımı içine. Bu hormonların birçoğunu metabolik süreçleri ve1,2besleme gibi temel davranışları düzenleyen beynin hipotalamus hedef. Birçok hormon memeli modelleri kullanarak tespit edilmiştir. Ancak, kendi eylem, özellikle içinde onlar katılmak, interorgan ağlar mekanizmaları büyük ölçüde belirsiz kalır.
Drosophila melanogaster organ organ iletişim eğitim için yararlı bir model olarak ortaya çıkmıştır. Böcekler, birçok fizyolojik süreçleri hormonlar tarafından kontrol edilir. Büyüme ve metamorfoz odaklanarak erken çalışmaları büyük böcekler kullanılır. Bu çalışmalarda, kaldırma veya belirli organ nakli arası organ sinyal molekülleri varlığını tahmin; daha sonra Juvenil hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) ve Ecdysone biyokimyasal olarak saflaştırılmış3,4,5idi. Hücreler arası sinyal peptidler büyük bir ailenin böcek ömrü6,7sırasında çeşitli fizyolojik olaylara karışmış olduğu düşünülmektedir. Belirli GPCRs geleneksel yaklaşımları kullanarak tanımlamak başlangıçta zor olmasına rağmen bu peptidler çoğunu G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), hareket. Drosophila tüm genom dizisi8 yayın Drosophila biyoaktif peptidler onların Homoloji diğer böcekler içinde bulunanlara göre tanımlaması etkin atılım oldu. Ayrıca, birkaç peptidler reseptörleri hücre kültür esaslı GPCR-ligand bağlayıcı deneyleri kullanarak genom tahmin GPCRs üzerinden tespit edilmiştir. Daha sonra ifade analizleri Bu peptidler ve reseptörler tarafından elde edildi organ organ yolları öngördü. Özellikle, birçok sözde peptid reseptörlerinin beyin peptid hormonlar9uğrak bir olduğunu düşündüren beyindeki ifade edilir. Ayrıca, Drosophila gelişmiş genetik araçlarında peptid GPCR kombinasyon fizyolojik rolleri tanımlama için katkıda bulunmuştur. Örneğin, GAL4 ve LexA tabanlı ikili transkripsiyon sistemler gen nakavt veya overexpression dağınık şekilde ve geçici denetimli bir biçimde etkinleştirin. GAL4, Maya, tanımlanan bir transkripsiyon faktörü ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS) adı verilen belirli bir CIS düzenleyici dizisine bağlanır. GAL4/UAS sisteminde doku özel sürücü hattı oluşturur veya Yanıtlayıcı satır ve sahne-özel GAL4 ifade taşır UAS akıntıya karşı gen faiz veya sürücü shRNA ifade için yapı. LexA/LexAop sistem benzer bir mekanizma dayanmaktadır. Doku özgü peptid-nakavt ve doku özgü GPCR nakavt hayvanların fenotipik analizleri peptid GPCR'ın sinyal modu ve site eylem hakkında bilgi ortaya çıkarabilir. Ancak, sadece genetik veri tarafından ulaşılabilir sonuçları sınırlıdır. Öte yandan, bir kez bir belirli peptit hormon sözde hedef bir doku veya hücre türüne aşağı daralmış, organ explants Imaging ex vivo kalsiyum peptid GPCR sinyal tarafından aracılı organ organ iletişim aydınlatmak için kullanılabilir. Gq birleştiğinde GPCR harekete geçirmek, açıklaması, Ca2 + ER10nedeniyle intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu artar. Beyinde, sinir harekete geçirmek de intrasellüler Ca2 + düzeyleri yükseltir. Böyle Ca2 + artar bir kalsiyum sensör, huzurunda floresans emisyon11' kaynaklanan Ca2 + konformasyon değişiklikler geçer GCaMP tarafından tespit edilebilir.
Bu makalede, Drosophila beyin kullanarak görüntüleme yöntemi explants bir kalsiyum açıklanmıştır. Belirli nöronların harekete geçirmek bir peptid yeteneğini test etmek için bir test peptid GCaMP ifade beyin explant için uygulanır ve floresan değişiklikler confocal mikroskobu tarafından izlenir. GPCR katılımı sonra GPCR eksik bir mutant beyin kullanarak aynı tahlil gerçekleştirerek doğruladı. Bu görüntüleme ve genetik organ organ iletişim hakkında kesin bilgi peptidler tarafından sağlar-GPCRs. olası değişiklikler ve uygulamaları bu protokolün de ele alınmıştır.

<table><tbody><tr><td>Tungsten çubuk</td><td>A-M sistemleri, Sequim, WA, ABD</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, Fransa</td><td>3049100</td><td>macun benzeri yeniden kullanılabilir yapıştırıcılar</td></tr><tr><td>Saat camı, kare, 1 5/8 Carolina</td><td>Biological Supply Company, Burlington, NC, ABD</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japonya</td><td>T900</td><td>Fosfatlı tamponlu tuzlar</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japonya</td><td></td><td>Custum sentezlenmiş peptit</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptid enstitüsü Inc., Osaka, Japonya</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nosiceptin</td><td>Peptit enstitüsü Inc., Osaka, Japonya</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Görüntüleyici A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td>Axio Görüntüleyici A2</td><td>floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Objektif W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td>420957-9900-000</td><td>suya daldırmalı objektif lensi</td></tr><tr><td>Uzun hareket menzilli P-725 PIFOC objektif tarayıcı</td><td>Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Almanya</td><td>N/A</td><td>piezoelektrikle etkinleştirilen lens taşıyıcı</td></tr><tr><td>Konfokal Tarayıcı Ünitesi CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japonya</td><td>CSU-W1</td><td>eğirme diski konfokal kafa</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japonya</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD kamera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Tutarlı, Santa Clara, CA, ABD</td><td>1178770</td><td>488 nm lazer</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock, Rochester, NY, ABD</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dikroik ışın ayırıcı</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine tek bantlı bant geçiren filtre</td><td>Semrock, Rochester, NY, ABD</td><td>FF01-528/ 38-25</td><td>emisyon filtresi</td></tr> <tr><td>ve mikro; Yönetici</td><td>Açık Görüntüleme, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&eacute; venaz, Biyomedikal Görüntüleme Grubu, İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü Lozan</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo endokrin drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Endokrin sinyal tarafından organ organ iletişim Örneğin, çevre beyne homeostazı korumak için çok önemlidir. Endokrin araştırma modeli hayvan, hangi genetik araçları ve genom bilgileri gelişmiş sahiptir, Drosophila melanogaster, giderek kullanılıyor. Bu makalede Drosophila beyin explants kalsiyum görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem, bir hormon beyne doğrudan sinyal algılama sağlar. İyi birçok peptid hormonlar G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), kimin harekete geçirmek artışa neden olmaktadır intrasellüler Ca2 +toplama yoluyla hareket bilinmektedir. Sinirsel harekete geçirmek de intrasellüler Ca2 + düzeyleri, Ca2 + akını ve endoplazmik retikulum (ER) depolanan Ca2 + sürümü yükseltir. Bir kalsiyum sensör, GCaMP, bu Ca2 + değişiklikleri izleyebilirsiniz. Bu yöntemde, GCaMP faiz nöronlarda ifade edilir ve GCaMP ifade larva beyin disseke ve kültürlü ex vivo. Test peptid sonra beyin explant için uygulanır ve GCaMP floresan değişiklikler CCD fotoğraf makinesi ile donatılmış dönen disk confocal mikroskop kullanarak algılanır. Bu yöntemi kullanarak, suda çözünen herhangi bir molekül test edilebilir ve sinirsel harekete geçirmek ile ilişkili çeşitli hücresel olaylar uygun floresan göstergeler kullanarak yansıma. Ayrıca, görüntüleme odası değiştirerek, bu yöntem diğer Drosophila organ veya diğer hayvanların organlarını görüntü için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralını kullanan, beyin insülin üreten hücreleri (IPCs) tarafından peptid hormon, CCHa2, aktivasyonu incelenmiştir. IPCs vahşi-türü beyin GCaMP6s ile etiketli dilp2 -GAL412 (Dr. Rulifson hediyesi) ve UAS-GCaMP6s13 (Dr. Kim hediyesi) bir birleşimini kullanarak. Larva beyin explants sentetik bir CCHa2 peptid ile tedavi edildi ve floresan GCaMP6s üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Bu deneyde, bir tek odak...

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Bu yöntem, endokrinoloji alanındaki temel soruların yanı sıra, beynin endokrin sinyallerine verdiği yanıtları gözden geçirmek için yaptığımız araştırma gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, endokrin sinyallerin diğer dokulardan ayrılan beyin üzerindeki doğrudan etkilerini inceleyebilmenizdir. Bu işleme başlamak için, diseksiyondan sonra larva beyninin ventral ganglionunun daha kolay monte edilmesi için bir çukur oluşturmak üzere plastik bir kültür kabının alt merkezini çizmek için forseps kullanın.Bir kürdan ile, göçüğün her iki tarafına küçük bir damla süper yapıştırıcı yerleştirin ve yapıştırıcıya bir tungsten çubuk takın. Ardından, küçük bir macun benzeri yeniden kullanılabilir yapıştırıcı parçası kullanarak, göçüğü çevreleyen dairesel bir duvar yapın. Larva beynini incelemek için, yumurtlamadan 90 ila 120 saat sonra larvaları toplayın ve yapışan yiyecek artıklarını gidermek için en az üç kez damıtılmış suyla yıkayın.Ardından, buz gibi PBS ile doldurulmuş bir buçuk inçlik kare bir saat camına bir larva yerleştirin. Larvaların orta kısmını nazikçe tutmak için bir çift forseps kullanın. Beyni içeren larvanın ön kısmını vücudun geri kalanından ayırmak için ağız kancalarını nazikçe tutmak ve çekmek için başka bir forseps kullanın.Daha sonra ön ucu forseps ile tutun ve larvaları ters çevirin. Hayali diskler, yağ cisimleri ve halka bezi gibi beyne bağlı yabancı dokuları çıkarın. Beyni ağız kısımlarından nazikçe ayırın.Daha sonra görüntüleme haznesinde daha önce hazırlanan yapışkan halkanın iç kısmına 200 mikrolitre PBS uygulayın. Diseke edilmiş beyni PBS ile nazikçe bir Pasteur pipetine emdirin ve görüntüleme odasına aktarın. Görüntüleme odasında, ventral gangliyonlardan uzanan kas liflerini tutun ve beyni tungsten telinin altındaki çukura nazikçe yerleştirin.Ardından, beyni görüntüleme için doğru konuma yerleştirmek için tungsten telini hafifçe yukarı çekin. Kalsiyum floresan görüntüleri elde etmek için, beyin eksplantını içeren görüntüleme odasını mikroskop altına yerleştirin. Objektif lensi PBS'ye değene kadar indirin ve parlak alan aydınlatması altında beyni konumlandırın ve odağa getirin.Floresan ışığa geçin ve GCaMP başarı etiketli hücrelere odaklanmayı ayarlayın. Çekimi 250 ms/kare hızında, su soğutmalı modda 512 x 512 piksel çözünürlükte başlatın. Ardından, CCD kamera dinamik aralığı içinde floresan değerlerini elde etmek için pozlama süresini ayarlayın, ancak 16 bit görüntülerle 1000 rastgele birimden daha düşük olmamalıdır.Görüntüleme parametreleri belirlendikten sonra, temel sinyal yoğunluklarını tespit etmek için peptit uygulamasından önce görüntüleri bir dakika boyunca alın. Daha sonra, hazırlanan peptit çözeltisinden 100 mikrolitre larva banyosuna pipetleyerek test peptidini doğrudan uygulayın. GCaMP başarı emisyonunu birkaç dakikalığına kaydedin.Verileri analiz etmek için analiz yazılımını açın ve peptit uygulamasından önceki ilk çerçeveyi referans görüntü olarak kullanın. Ardından, Eklentiler, TurboReg'i seçin. Source (Kaynak) olarak serial image (Seri görüntü) dosyasını ve Target (Hedef) olarak referans imajı seçin.Ardından, işleme yöntemi ve kalitesi için sırasıyla Sert Gövde ve Doğru'yu kontrol edin. Ardından, görüntü işlemeyi başlatmak için Batch'e tıklayın. Görüntü tepsisinde Analiz, Araçlar, ROI Yöneticisi'ni kullanarak birden çok ilgi alanı seçin.Ardından, ROI Yöneticisi penceresinde Daha Fazla, Çoklu Ölçüm, Tamam'a tıklayarak piksel yoğunluğunu ölçün. Bu deneyde, Vahşi tip beyin CCHa2, Ghrelin ve Nosiseptin'e maruz bırakılırken, CCHa2 Reseptörü mutant beyin CCHa2'ye maruz bırakıldı. İnsülin üreten hücrelerdeki GCaMP6 sinyalleri, 250 ms / karede konfokal mikroskopi ile tespit edildi ve burada seçilen zaman noktalarının hareketsiz görüntüleri verilmiştir.Her bir zaman noktasında ROI yoğunluğunun temel sinyal yoğunluğuna değişiminin oranı çizildi. ROI'ler, aynı odak düzleminde tespit edilen hücre gövdelerinde ayarlanır. Düz çizgiler, beş ila 10 örneğin ortalamasını gösterir ve noktalı çizgiler, ortalamanın standart hatasının üst ve alt sınırlarını işaretler.Gölgeli alanlar, deneylerdeki sinyallerin değişimini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde oluşturulmuşsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, zarar görmemesi için beyin örneğini hızlı bir şekilde hazırlamayı unutmamak önemlidir.Bu prosedür, reseptör özgüllüğü gibi ek soruları yanıtlamak için genetik ile birleştirilebilir. Bu protokolde kullanılan sistemin hazırlanması kolaydır ve tekrar kullanılabilir. Bu nedenle, bu protokol taramada olduğu gibi faydalı olacaktır.Geliştirildikten sonra bu teknik, endokrinoloji ve sinirbilim alanındaki araştırmacıların Drosophila'da beyin fonksiyonlarını kontrol eden hormonal ağları keşfetmelerinin yolunu açtı.

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Bu videoda, GCaMP kullanılarak Drosophila nöronlarında in vivo kalsiyum görüntüleme açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol klibi, bir koku alma koşullandırma deneyi sırasında mantar vücut nöronlarından GCaMP floresansındaki değişikliklerin nasıl kaydedileceğini gösterir.

Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Bu videoda, sineklerde sinaptik olarak lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Sinekleri mikroskopi için hazırlamak, koku alma koşullandırması yapmak ve koku kaynaklı kalsiyum akışını görselleştirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Lark, A. R., et. al., Biyolüminesan Kalsiyum İndikatörü GFP-aequorin'e Dayalı İn Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşımı. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video, Green kullanarak kalsiyum dinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesini göstermektedir. Drosophila'nın derin beyin yapılarında floresan protein-aequorin biyolüminesansı.

Drosophila Beyin Yapılarında Kalsiyum Geçişlerini İncelemek için Biyolüminesans Görüntüleme

Drosophila'nın ön ayakları ve hortumu, tat alma duyusal nöronlarının zengin bir repertuarını içerir. Burada, canlı sineklerin ön bacak ve hortumundaki duyusal nöronlardan gelen fizyolojik tepkileri ölçmek için kalsiyum görüntüleme kullanan bir yöntem sunuyoruz.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında 2+ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Burada, epileptiform aktiviteleri izlemek için GCaMP6 eksprese eden yetişkin Drosophila'da ex vivo kalsiyum görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila'daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Drosophila Epilepsi Modeli için Kalsiyum Görüntüleme

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Keşfedin Drosophila larva beyninde kalsiyum görüntüleme ile endokrin sinyallere nöronal yanıtları. Bu yöntem hormonların beyin fonksiyonlarını doğrudan incelemeyi ve ilaç taramalarını kolaylaştırır.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Daha fazla video keşfet