Name: Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans üreme hattının otomatik 3D analizini; çekirdek dağılımı, protein ve sitoiskelet yapısını inceleyin. Bu yöntem analiz süresini kısaltır, örnek boyutunu artırır ve hataları azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Monash Microimaging onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bazı suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu eser bir Monash Üniversitesi Biyomedikal keşif Bursu, NHMRC proje desteği (GNT1105374), NHMRC üst düzey araştırma bursu (GNT1137645) ve veski yenilik bursu tarafından desteklenmiştir: Roger Pocock VIF 23.

1. hazırlık ve solucan yetiştiriciliği
Not: Tüm ürün bilgileri için Malzemeler tablo bakın.
<ol><li>OP50 Escherichia coli kültür: Lysogeny suyu (LB) (% 1'tryptone, % 0.5 Maya, %0,5 NaCl, pH 7,0) gecede 37 ° C'de Antibiyotikler olmadan OP50 bakteri kültürü.</li>
	<li>400 µL OP50 bakterilerin nematodunun büyüme medya (NGM) levhalar (1,5 gr NaCl, agar, pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL etanol, 1 mL 1 M MgSO4 5 mg/mL kolesterol 1,25 g 8.5 gram tohum ve 1 M KPO4 arabellek 25 mL) ve hava kuru bakteri 48 h için.</li>
	<li>Solucanlar numaralı seribaşı NGM plakaları almak ve 15 ° C veya 20 ° c kuluçkaya<ol>
<li>Yetişkin hermafrodit germline analizi için iyi beslenmiş L4 solucanlar bakteriyel çim için almak ve bir gecede 20 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Solucanlar L4/yetişkin tüy dökme ulaşana kadar sperm sayı hünsa içinde puanlama için L4 solucanlar için 12 h 20 ° C'de kuluçkaya. Solucanlar L4 sahneye eşitlemeye, çamaşır suyu çözüm (1 M NaOH ve çamaşır suyu 1:1 oranında) yumurta bir sürü yetişkin solucanlar seçerek yumurta hazırlamak. Yumurta yumurtadan ve L4 hayvan deney için almak izin verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teflon mikroskop slaytlar poly-L-lizin çözüm 25 µL slaytta yerleştirerek ve çözüm de, bir pipet ucu kullanarak yayılan hazırlayın. Kağıt havlu ile Poli-L-lizin aşırı kaldırdıktan sonra kurutma ve slaytlar için 15-20 dk 65 ° C'de kuluçkaya slaytların izin.</li>
</ol>2. Germline diseksiyon ve boyama6,13
<ol><li>10 µL % 0,01 (anestezik) tetramisole 22 mm × 22 mm coverslip üzerinde bir nokta ve o içine bir - gün eski yetişkin solucanlar seçin.</li>
	<li>Bir şırınga (5 mL) ve bir iğne (24 "x 1") kullanarak sakin olur gibi kuyruk, solucan teşrih ve germline zarar görmediğinden emin olun. Not: negatif basınç solucan ve kurt hareketi yardım germline çýkartýlmasýný böylece solucan tamamen felç olur önce diseksiyon yapılmalıdır. Sperm puanlama için önlemler spermatheca zarar vermemesi için iğne tarafından diseksiyon sırasında alınması gerekir. Spermatheca sonra diseksiyon noktası dışındaki iğne ile germline dokunmaktan kaçının. Germline kompartımanda kırmak veya herhangi bir deşarj germline görülmektedir varsa germline analiz için kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Ters coverslip disseke germline slayt üzerinde tutmak bir Poli-L-lizin kaplamalı slayt üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Coverslip altında aşırı sıvı 1 dk. hızlı bir şekilde kaldırmak için slayt üzerinde germlines ile bir iğne kullanarak coverslip bir kağıt Kulesi coverslip sonra yer slayt köşesinde sıvı azot yerleştirerek kaldırın.</li>
	<li>Slaytları-20 ° C metanol için 30-60 s bir odasında içine, daha sonra 30 dk içinde taze hazırlanmış sabitleme çözüm (1 fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren 0,08 M HEPES pH 6,9, 1.6 mM MgSO4, 0.8 mM etilen glikol bis(beta-aminoethyl x için kuluçkaya eter)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA) ve % 3.7 paraformaldehyde) oda sıcaklığında.</li>
	<li>1 x PBS, pH 7.4 içeren bir odaya yerleştirerek slaytları yıkama %0,1 ile ara-20 10 dakika süreyle tekrarlamak bu adım bir kez.</li>
	<li>Germlines ile 30 µL çözüm engelleme engellemek (keçi serum 1700 µL içinde keçi serum 900 µL ekleyerek hazırlanan % 30'u H2O distile ve 10 x PBS 300 µL), oda sıcaklığında 30 dk için plastik bir kutu içinde ıslak kağıt havlu koyarak hazırlanan bir nemli odasında.</li>
	<li>REC-8 antikor çözüm olarak her örnek için bir oranı %1:300 30 keçi Serumda hazırlanan 50 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Slaytları yıkayın 1 x PBS % 0.1 ile içeren bir odasında yerleştirerek ara-20 10 dk. için bir kez yineleyin ve aşırı sıvı slayt köşesinde bir kağıt havlu koyarak kaldırmak.</li>
	<li>İkincil antikor çözüm yeşil fluorophore (488 nm emisyon dalga boyları) konjuge ikincil antikor (1: 1000), phalloidin (aktin leke, 1:4000) ve DAPI (DNA leke, 1:4000) % 30 normal keçi serum içinde sulandrarak hazırlayın.</li>
	<li>İkincil antikor çözüm 50 µL slayda ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Slaytları yıkama iki kez 1 x PBS % 0.1 ile içeren bir odaya yerleştirerek ara-20 10 dakika süreyle silin aşırı sıvı.</li>
	<li>Reaktif bir slayda sabitleme 30 µL ekleyin ve 12 mm2 x 1,5 µm coverslip üstüne yerleştirin ve slaytlar 4 ° C'de gecede kuru.</li>
</ol>3. confocal mikroskobu
<ol><li>Confocal mikroskop, lazerler, rezonans tarayıcı ve confocal mikroskop bilgisayar yazılımı açın. Lekeli germlines ile slaytlar slayt sahibi 63 X amaç yukarıda yerleştirin.</li>
	<li>Bir germline, odak üstünde germline bulun ve confocal mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak işaretler. Benzer şekilde germline dibinde odaklanmak ve toplam germline kalınlığı kurmak için işaretler.</li>
	<li>Görüntü en çok 0,5 µm. Mark tam germline ve başlangıç Alım her dilim kalınlığı tanımlayarak tüm germline. Her dilimin 8 kere tarama ve görüntü kalitesini artırmak için değerlerin ortalamasını. Rezonans tarayıcı tarama hızlı görüntüleme sırasında ağartma önlemek için izin verir. Mikroskop bir rezonans tarayıcı varsa, tarama sayısı dört ağartma önlemek için azaltmak.</li>
</ol>4. mesaj çekirdeği analiz görüntüleme numarasını ve dağıtım
Not: Ekran görüntüleri kullanılan düğmeler ve yazılım araçları için ek resim 1 bakın.
<ol><li>Görüntü Imaris 8.4.1 veya yazılımın sonraki sürümleri için alın.</li>
	<li>Mitotik bölge, geçiş bölgesi, segregasyonun bölge, oosit bölge ve germline spermatheca her bölgede nükleer Morfoloji belirleyerek tanımlayın.</li>
	<li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yüzey function butonu (ek şekil 1A) ilgi bölgeyi seçmek için kullanın.</li>
	<li>Otomatik yüzey oluşturma Sihirbazı iptal etmek ve el ile görüntünün ilk ve son dilim ilgi bölge üç boyutlu yığın çizin.</li>
	<li>Oluştur yüzey' i tıklatın. Not: Yazılım otomatik olarak ilk ve son yığını arasında yığınları gelişecektir.</li>
	<li>DAPI hariç tüm kanallar maskesi kanalı düğmesini (Ek şekil 1B-C) maske.</li>
	<li>Spot function butonu (ek şekil 1A) kullanarak nükleer boyutu parametreleri tanımlayın. Mitotik bölgesi için Z çapı tanımsız bırakarak bir XY çapı 2 µm tanımlayın. Geçiş bölgesi için bir XY çapı 2 µm ve Z çapı 1,5 µm. (ek şekil 1 d) tanımlayın. Not: büyütme ve belirtme-in mikroskop göre çapları ile ilgili sorunları giderme. Geçerli protokol için kullanılan objektif 63 X yapıldı ve fazladan 1,70 kez büyütme görüntüleme sırasında sağlanan. Amaç, örneğin 40 X, değişirse çapları buna göre değiştirilmelidir. Sorun giderme doğru parametreleri kurmak için wildtype germlines ile yapılmalıdır. Bir vahşi tipi germline kolu Mitotik bölgesi yaklaşık 250 çekirdeği vardır. Çapı bu değer elde etmek için değiştirilmesi gerekir. En az 15 germlines çapı en uygun değerini belirlemek için kullanın. Benzer bir yaklaşım geçiş bölgesi (150-170 çekirdeği) ve segregasyonun bölge (600-700 çekirdeği) kalibre için kullanılır.</li>
	<li>Noktalar tespiti minimum eşik (ek şekil 1E) tanımlayarak sınırlayın. Kullanım DAPI ilk nokta dışında germline görünene kadar en az üç boyutlu işleme eşik artırarak minimum eşiği belirlemek için vahşi türü germlines lekeli.</li>
	<li>Görüntü kaydetmek ve çekirdek sayısı otomatik olarak yazılım tarafından oluşturulan tablo elde etmek. Görüntüler TIF dosyaları olarak dışa aktarma.</li>
</ol>5. analiz Sperm ve kromozom sayısı puanlama için Imaging post
<ol><li>Faiz bölgesi olarak spermatheca seçerek üç boyutlu işleme gerçekleştirin. Her sperm tespit, spot çapı 0,75 arasında-tanımlamak için 1.0 µm x ve Y-ekseni Z çapı tanımsız kalır iken,. Noktalar function butonu ek şekil 1' de gösterildiği gibi kullanın.</li>
	<li>Yanında tıkırtı arka plan arka plan çıkarmak kutusu ve yazılım (ek şekil 1 d) tarafından hesaplanan arka plan düzeltme değerlerini kullanarak çıkarın. Not: Imaris yazılım ilk yüksek yoğunluklu puan alır, bölgenin ilgi ve arka plan arasında anlamlı bir fark var olduğu sürece bu nedenle arka plan etkisi en az düzeydedir. Arka plan düzeltme tanımlarken, burada uygun değerleri için arka plan için verilebilir bir ikinci yöntemdir. El ile arka plan düzeltme bağımsız örnekleri yoğunluğunu karşılaştırma ihtiyacı varsa uygun olacaktır.</li>
	<li>Tüm lekeli DAPI sperm spermatheca (tamamlayıcı şekil 1E) tespit etmek için üç boyutlu işleme eşik ayarlayın.</li>
	<li>Kromozom sayımı için spot çapı tanımla < x 0,75 µm ve üç boyutlu modelleri geliştirmeden önce Y-eksen.</li>
	<li>Görüntü kaydetmek ve TIF dosyası olarak verin.</li>
</ol>6. post Germline hücre iskeleti yeniden inşası için analiz görüntüleme
<ol><li>İlgi germline bölge tanımlamak ve phalloidin dışında tüm kanallar tıklayarak kanal maskesi maske.</li>
	<li>0.25 µm yüzey detayını yüzey function butonu (ek şekil 1) kullanarak tanımlayın. Not: Bu üç boyutlu modelleri içine her 0.25 µm işlenip anlamına gelir. Yüzey ayrıntı germline nerede üç boyutlu yüzey manken-ecek var olmak mahluk her 0.25 µm için herhangi bir bölge için sabit olabilir. Ancak, oosit bölgesi için yüzey ayrıntı için 0,35 - artırılabilir iyi tanımlanmış aktin iplikleri bu bölgedeki varlığı nedeniyle 0.5 µm.</li>
	<li>Yanında tıkırtı arka plan arka plan çıkarmak kutusu ve yazılım (ek şekil 1 d) tarafından hesaplanan arka plan düzeltme değerlerini kullanarak çıkarın.</li>
	<li>Üç boyutlu işleme eşik analizi (ek şekil 1E) gerektiren yapısına bağlı olarak ayarlayın.</li>
	<li>Gelişmiş üç boyutlu görüntü kaydetmek ve TIF dosyası olarak verin.</li>
</ol>

<ol><li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+germ+line%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419785">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li>
<li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li>
<li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372(2014).</li>
<li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+sperm%2Foocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li>
<li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-3+and+control+of+the+mitosis%2Fmeiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li>
<li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).</li>
<li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22872476">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-1%2C+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation%2C+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li>
<li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li>
<li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li>
<li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1%2C+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li>
<li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li>
<li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li>
<li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S6K+links+cell+fate%2C+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li>
<li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çatışma bildirin.

Bu iletişim kuralı doğruluğunu geliştirmek ve germline analiz için gereken süreyi azaltmak için hedeftir. Disseke germlines standart hazırlanması sonra germline çekirdeği üç boyutlu bir model Hesaplamalı işleme tarafından hazırlanmıştır. Germline çekirdeği dağıtım uzay gözlem izin verirken, üç boyutlu işleme germline belirli bölgelerinde, çekirdeği sayısını hesaplar. Önemli bir özelliği, bizim yöntemi çekirdek boyutu ve şekli parametreleri doğru tanımıdır. Bu boyama ve kullanılan büyütme netlik üzerinde bağlıdır görüntü ...

Yollar memeliler ile sinyal koruma C. elegans birden çok biyolojik süreçlerin1,2eğitim için mükemmel bir model yapar. Bizim laboratuarımızda kök hücre gelişimi, Apoptozis ve gen ekspresyonu çalışmaya C. elegans germline kullanın. Germline üç boyutlu bir yapıdır, birçok çalışma iki boyutlu üç boyutlu analiz zaman alıcı ve emek yoğun doğası gereği vardır. İki boyutlu analiz germline vivo içinde olayları yanlış muhtemeldir. C. elegans yetişkin hermafrodit iki germline kolu, her biri bir farklılaşmamış devlet3,4distal germ hücreleri korur somatik distal ucu hücre (DTC) evler vardır. Bu germ hücreleri nüfuzunu, kaçan DTC'yi uzak hareket olarak ayırt etmek başlar ve germline proksimal sonuna ulaşmak yumurta ve sperm hale gelir. Bu işlem sırasında germ hücre çekirdeği mitoz, mayoz5,6için geçiş önce tabi. Sperm üretimini geçmesi sırasında yetişkinlik yumurta üretilmektedir gelişiminin larva aşamasında 4 (L4) tarafından tamamlanır. Sperm yumurta embriyo oluşturmak için nereye gübreliyorlar spermatheca içinde depolanır.
C. elegans değişiklikler çekirdek sayısı, apoptotik olaylar, kromozom dinamikleri ve protein ifade ve/veya Yerelleştirme7 sayısı sonuçlanan germline geliştirme etkileyebilir birden çok genetik ve çevresel faktörler ,8,9,10,11. Bu olayların analizi her aşamasında nükleer morfoloji ve dağıtım göre farklılaşma tanımlaması gerekir. Doğru bir şekilde bu parametreler büyük örnek boyutu ile el ile çözümlemek için emek ve zaman alıcı. Bu sakıncaları engelleyecek ve analiz tutarlılığını sağlamak için otomatik yöntemi C. elegans germline sayma çekirdekleri, çekirdek dağıtım, protein ifade, üç boyutlu incelenmesi için geliştirdiğimiz ve hücre iskeleti yapısı. Confocal mikroskobu ile üç boyutlu render birleştirerek, boyutu ve şekli parametreleri her aşamasında germ hücre farklılaşma tanımlanması için oluşturulan. Ayrıca, bu yöntem germ hücre çekirdeği ve sperm sayım artı kromozom sayısı her yumurta içinde Puanlama sağlar.
Bir çok önemli germline germline yuvası, AIDS sitoplazmik akarsu ve koruma germline çekirdeği12istikrar sağlar sitoiskeleti yapıdır. Hesaplamalı işlemesini kullanan, biz germline sitoiskeleti üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulandı ve farklı hücre iskeleti özellikle germline içinde teşhis etti. Burada, biz nasıl sayısal analiz confocal görüntüleme sağlar kapsamlı analiz C. elegans germline ile kombine göstermek için adım adım bir protokol tanımlamak.
C. elegans germline (şekil 1) üç boyutlu analizi için hızlı bir yöntem öneriyorum. Üç boyutlu analizi kullanılarak, otomatik germline çekirdeği (Şekil 2 ve şekil 3), üç boyutlu dağılımı hücreleri (Resim 2), ( germline sitoiskeleti yeniden inşası sayma çalışma olanağı vardır Şekil 3), proteinler (şekil 4) ve spermatheca sperm ve yumurta (şekil 5) kromozom sayısı puanlama dağıtımını. Yöntem sadece germline kolay ve doğru miktar sağlar ama fizyolojik ilgili fenotipleri tanımlar.

<table><tbody><tr><td>C. elegans suşları: vahşi tip (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli bakteri</td><td>Ev Yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>poliklonal tavşan anti-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 keçide yükseltilmiş konjuge antikor</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Hücre iskeleti boyası phalloidin&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermofisher Bilimsel&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES tamponu, pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>%37 Paraformaldehit çözeltisi</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield sabitleme reaktifi&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol & nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&derece; C & 25&deg; CInbspator&nbsp;</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop ve nbsp; &nbsp;</td>Imaris suit 8.4.1 veya sonraki sürüm ile donatılmış <td>herhangi bir marka (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bilgisayar, yazılımı ve Matlab yazılımını kullanmak için tam lisans.</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfo tamponlu salin, pH 7.4</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon mikroskop slaytları&nbsp;</td><td>Tekdon&nbsp;</td><td>&nbsp; 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya caenorhabditis elegans germline sayısal analizi

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline kök hücre geliştirme, Apoptozis ve kromozom dinamikleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak önemli işlemleri incelemek için kullanılır. Germline mükemmel bir model olsa da, genellikle iki boyutlu zaman ve emek üç boyutlu analiz için gerekli nedeniyle analizidir. Bu tür çalışmalarda önemli dökümanları numarası/konumunu çekirdeği ve protein dağıtım germline içinde vardır. Burada, otomatik sayı ve germline her bölgede çekirdeği konumunu belirlemek için confocal mikroskobu ve Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak germline analizini gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut. Bizim yöntem da farklı genetik geçmişleri protein ifade üç boyutlu incelenmesi sağlar germline protein dağıtım analiz eder. Ayrıca, bizim çalışma belirli kayma gelişimsel gereksinimleri karşılamak germline farklı bölgelerinde hücre iskeleti mimaride varyasyonlar gösterir. Son olarak, bizim yöntemi otomatik her germline spermatheca Sperm sayımı etkinleştirir. Birlikte ele alındığında, bizim yöntemi C. elegans germline hızlı ve tekrarlanabilir fenotipik analizini etkinleştirir.

Şekil 1 üç boyutlu germline analiz için gereken süreyi gösterir. 20 ° C'de inkübe L4 hünsa germlines yalıtmak için disseke ve DAPI, phalloidin ve germline proteinler karşı antikor lekeli. Germlines kullanarak confocal mikroskobu görüntüsü. Boyama ve confocal mikroskobu gerektirir yaklaşık 24 h sayısal analiz için tam germline sayısını ve konumunu çekirdeği saymak, protein dağıtım tanımlamak, puan ve hücre iskeleti yapısını analiz için 10-15 dk gerektirir sper...

Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Bu yöntemin genel amacı, çekirdeğini, proteinini ve hücre iskeleti dağılımını incelemek için bir Caenorhabditis elegans germ hattının analizini otomatikleştirmektir. Bu yöntem, C.Elegans alanındaki çekirdek ve sperm sayısı, nükleer dağılım ve germ hattının hücre iskeleti yapısı hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, analiz süresini kısaltması, numune boyutunu artırması ve manuel analizle ilişkili insan hatasını ortadan kaldırmasıdır.Örnekleri görüntülemek için, lekeli germ çizgileri olan slaytları, konfokal bir mikroskobun 63X hedefinin üzerindeki slayt tutucusuna yerleştirin ve bir germ hattı bulun. Germ hattının üst kısmına odaklanın ve konfokal mikroskop yazılımı ile işaretleyin. Toplam germ hattı kalınlığı belirlendiğinde, her dilimin kalınlığını 0,5 mikrometreye kadar tanımlayın ve tüm germ hattını işaretleyin.Ardından, görüntü kalitesini artırmak için her dilimi sekiz kez tarayarak ve değerlerin ortalamasını alarak alıma başlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, görüntüleri uygun bir görüntü analizi yazılım programına aktarın ve mitotik bölgeyi seçmek için yüzey işlevi aracını kullanın. Germ hattının distal ucunun bir görüntüs

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Biz disseke C. aktif ERK mekansal ve zamansal lokalizasyonu için immünofloresan görüntüleme bazlı yöntem mevcut elegans gonad. Burada açıklanan protokol C herhangi bir sinyal görüntülenmesi veya yapısal protein için uyarlanabilir elegans yumurtalık, uygun bir antikor reaktifi kullanılabilir sağladı.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Öğrenin Caenorhabditis elegans üreme hattının otomatik 3D analizini; çekirdek dağılımı, protein ve sitoiskelet yapısını inceleyin. Bu yöntem analiz süresini kısaltır, örnek boyutunu artırır ve hataları azaltır.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

Daha fazla video keşfet