Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Bu yöntem, mikroakışkan sistemin kombinatoryal tekniğinde ve mikroakışkan cihazlar ve asimetri PCR yöntemi gibi moleküler biyoteknoloji alanındaki anahtar soruların yanıtlatılabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, yüksek homojenleştirilmiş mikrokürelerin verimli üretimi ve ek ayırma adımları olmadan tek iplikli DNA üretimidir. Bu tekniğin etkileri çeşitli hastalıkların tanı veya tedavisine kadar uzanır.

Tek iplikçikli DNA üretimi ap-ta-mo-sis tahlilleri için anahtar olduğundan, algılama ve tedavi için kullanılabilir. Bu yöntem MEMS'de üç boyutlu mikroakışkan sisteme ışık sağlasa da, hastalığın saptanması ve tedavisi için kullanılan diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler düzgün ters yönde akan sıvıları kontrol etmek için mücadele edecek.

Bu yöntemin görsel gösterimi, oluşan mikrokürelerin akış odaklı geometrisinde ve katılaşmasında mikrosfer oluşumunu gözlemlemek için çok önemlidir. İlk olarak, baz polimer ve katalizör 10-bir oranında karıştırarak sıvı PDMS pre-polimer 20 mililitre hazırlayın. Mikroakışkan ağın üst kısmı için silikon gofret üzerine hazırlanmış bir SU-8 kalıbına 10 mililitre sıvı PDMS dökün.

Alt düz parçası için, bir kalıp yapısı olmadan silikon gofret üzerinde sıvı PDMS aynı hacimde dökün. Önceden ısıtılmış bir ocak üzerine sıvı PDMS ön polimer ile kaplanmış iki silikon gofret yerleştirin ve 30 dakika boyunca 75 santigrat derecede tedavi. Bunu takiben, SU-8 kalıbından kürlenmiş PDMS tabakasını elle soyun.

Makro-sıvı örnekleri ile mikron ölçekli akış kanalları nın birbirine bakması için çoğaltılmış mikroakışkan ağdaki yağ portuna 1,5 milimetre çapında yuvarlak delik delme aracını hizalayın. Sonra el ile delik dışarı yumruk. Delme işlemini üç kez tekrarladıktan sonra, numune başına birkaç saniye boyunca el koronası tedavi edici kullanarak hem üst hem de alt PDMS katmanlarında hidrofilik yüzey tedavisi uygulayın.

İki plazma ile işlenmiş PDMS katmanını ve 90 santigrat derecede, PDMS-PDMS yapıştırma işlemi için bir ocakta 30 dakika ısı yığın. Vorteks ve kısaca standart tek iplikli DNA akridite etiketli prob ve 19-to-bir akrilamid bis stok çözeltisi santrifüj. %40 akrilamid bis çözeltisinin 25 mikrolitresini, 10 mikrolitre tek iplikli DNA'yı, 10 mikrolitre 5X TBE tamponu ve beş mikrolitre suyu karıştırarak çözeltiyi hazırlayın.

%20 amonyum persülfat 50 mikrolitre ile çözelti iki hazırlayın. Çözelti bir ve çözüm iki ile ayrı ayrı doldurulmuş iki şırınga hazırlayın ve mikroakışkan platforma çözelti akışları tanıtmak için şırınga pompası üzerine monte. Mikrosferin yüzey katılaşması için %0,4 TEMED ile karıştırılmış mineral yağı hazırlayın.

Mineral yağ ile bir cam şişe doldurduktan sonra, mikroakışkan rezervuar olarak cam şişenin kapağında pnömatik ve sıvı portları iki tüp takın. Tüpleri cam şişe ile mikroakışkan cihazdaki yağ portu arasında bağlayın. Şırınga pompalarından iki çözelti tedarik etmek için tüpleri mikroakışkan cihazdaki iki çözelti portuna bağlayın.

Daha sonra üretilen mikrosferi kabın içine aktarmak için tüpleri çıkış noktasına takın. Daha sonra, şırınga pompasının akış hızını saatte 0,4 ila 0,7 mililitreye ayarlayın. Bir regülatör kullanarak kompresör basınçlı hava basıncını ayarlayın.

Bir ocak üzerine manyetik karıştırma çubuğu ile bir cam kabı yerleştirin ve dönme hızını ayarlayın. Şırınga pompasını çalıştırın ve harici bir kompresör tarafından üretilen basınçlı havayı elektromanyetik vananın açık-kapalı kontrolünü kullanarak cam şişeye tedarik edin. Dijital mikroskop kullanarak, akış odaklı geometride mikrokürelerin oluşumunu ve cam kabında üretilen mikrokürelerin katılaşmasını gözlemleyin.

Mikrokürelerin oluşumunu gözlemlemek en kritik adımlardan biridir, çünkü bu çalışmada mikroküreler ve mikroakışkan sistem üretmek için önemli bir süreçtir. Bunu takiben, 100 mikrolitre mikroküreyi 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne aktarın. Sonra nazik santrifüj ve pipetleme ile supernatant çıkarın.

100 mikromolar son konsantrasyonelde etmek için 1X TE tampon 100 mikrolitre kullanarak ücretsiz prob modifiye siyan-3 resuspend. Daha sonra, AP kopolimerize mikroküreler içeren steril 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüp tamamlayıcı prob modifiye siyan-3 100 mikromolar ekleyin. Bir saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında karıştırmak ve kuluçka için tüp birkaç kez dokunun.

Kuluçkadan sonra, supernatant atın ve pipetleme yoluyla artık tampon kaldırın. Daha sonra 500 mikrolitre TE tamponu ile üç kez durulayın. Mikroküreleri görüntülemeden önce 75 ila 50 milimetrelik bir cam kaydırağa yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplayın.

40X büyütmeli Bir ışık mikroskobu kullanarak mikroskobik sayma yoluyla yaklaşık 25 mikroküre elde edin. Bunu takiben, metin protokolünde açıklandığı gibi tüm reaktifleri birleştirin. Numuneleri bir termocycler'a yerleştirin ve asimetrik PCR'yi uygun koşullarda çalıştırın.

Asimetrik PCR'den sonra süpernatant ın toplanması en kritik adımlardan biridir, çünkü mikrosferile tek iplikçikli DNA üretmek için önemli bir süreçtir. Amplifikasyondan sonra, her numuneye sekiz mikrolitre 6X yükleme arabelleği ekleyin. Her numunenin 15 mikrolitresini %2 agarose jeliniçine yükleyin.

Daha sonra 1X TAE tampon 35 dakika boyunca 100 volt elektroforez gerçekleştirin. Melezleştirilmiş mikroküreleri bir tutucuya yerleştirin ve tutucuyu konfokal mikroskop aşamasına bağla. Lazerseçin ve lazer kontrolünde açın.

Mikroskop kontrolünde objektif lensi seçin. Ardından, konfigürasyon kontrolünde siyan-3 ve kanal için istenilen filtreyi seçin. Son olarak, deneye başlayın ve örneği gözlemleyin.

Fabrikasyon polimerik damlacık esaslı mikroakışkan platform iki PDMS katmanından oluşur. Üç çeşit mikroakışkan kanal ağı, akış odaklı geometri, bir ve iki çözeltiyi karıştırmak için bir serpantin kanalı ve mikrosfer katılaştırması için bir polimerizasyon kanalı olan mikroküreler üretmek için kullanılır. Mikroakışkan platformda mikrokürelerin üretilmesi için mineral yağın sürekli akışı için laboratuvar tabanlı pnömatik kontrol sistemi ve çözelti akışı için iki şırınga pompası kullanılmıştır.

Eğer mikroküreler beş asal akrilit DNA sondası ile doğru bir şekilde işlevsel hale getirilmişse, bu floresan görüntülerde gösterildiği gibi hibridizasyon deneyi sırasında yüzeydeki floresan aktivitenin kapsamına sonuçlanmalıdır. Kopolimerizasyon doğru şekilde gerçekleşmezse, optik mikrosfer görüntüsü mikrokürelerin içinde iç kontaminasyon sergiler. Mikrokürelerin 3Boyutlu yüzeyini DNA oligo-probuile manipüle etmek çok daha hızlı bir süreçtir ve akışlı bir mikrosfer sentez platformu tek iplikçikli DNA amplifikasyonu ve arınması için bir araç sağlayabilir.

Başlangıçta kopolimerize beş prime AP, tamamlayıcı şablonuna göre ikna edildikten sonra DNA polimerizasyonu için üç asal hidroksil ucu sağlar. Asimetrik PCR deneyinde çift iplikçikli DNA kirleticileri gözlendi. Mikrosfer PCR'den biriken tek iplikçikli DNA, jel elektroforez analizi ile sentetik boyut belirteçleri ile karşılaştırıldığında gösterilmiştir.

Bu yordamı denerken, bu yöntemde amplifikasyon döngüsünü, sıcaklığı annelize etmek ve sonda dizisini elde etmek için PCR deneylerini optimize etmek için yaygın olarak gerekli olan protokoller ve ayarlamalar hakkında önceden bilgi sahibi olmak önemlidir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra tanı ve tedavi alanında araştırmacıların moleküler biyoteknoloji ve biyotıp alanlarında iki bölgeyi birbirine bağlamasının önünü açmıştır. Akrilamid solüsyonu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü takmagibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.