Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

Bu biyokonjugasyon yönteminin genel amacı, disülfit içeren virüs benzeri partikülleri floresanla fonksiyonelleştirmektir. Bu yöntem, fonksiyonelleştirilebilen sınırlı sayıda amino asit kalıntısına sahip virüs benzeri partiküller için biyokonjugasyon reaksiyonundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir reaksiyon kullanılarak yeni fonksiyonel grupların tanıtılabilmesi ve aynı anda konjugasyon kaynaklı floroforların oluşturulabilmesidir. Q-Beta'nın yanı sıra, bu reaksiyonun disülfit bağlarına sahip tüm virüs benzeri partiküllere uygulanabileceğine inanıyoruz.

Q-Beta bakteriyofajı ekspresyon prosedürüne başlamadan önce, tezgah alanını 1:1 çamaşır suyu:etanol çözeltisi ile silin. Aseptik bir ortamda, E.coli BL21 tek kolonilerini SOB besiyerine ekleyerek iki adet üç mililitrelik başlangıç kültürü hazırlayın. Kültürleri 37 °C ve %0 bağıl nem içeren bir odada, 250 rpm hızında çalkalayarak gece boyunca büyütün. Ertesi gün, her iki üç mililitrelik başlangıç kültürünü çalkalayıcıdan çıkarın ve aseptik bir ortamda her bir başlangıç kültürünü, bir litre taze SOB besiyeri içeren iki litrelik baffled Erlenmeyer flask içerisine dökün. İnoküle edilmiş besiyerlerinin bulunduğu iki flaskı 37 °C ve %0 bağıl nem içeren odada 250 rpm hızındaki çalkalayıcıya yerleştirin. Bakterileri, 600 nanometredeki optik yoğunlukları veya OD 600 değerleri 0,9 ila 1,0'a ulaşana kadar büyütün. Bu işlem genellikle yaklaşık beş saat sürer. Kültürler istenen OD 600 değerine ulaştığında, protein ekspresyonunu indüklemek için bir P1000 pipet kullanarak her bir flaska bir mililitre bir molar IPTG ekleyin. Flaskları sıcak odadaki çalkalayıcıda gece boyunca bırakın.

Ertesi sabah, erlenmayerleri çalkalayıcıdan çıkarın, her bir erlenmeyerin içeriğini bir litrelik bir şişeye aktarın ve hücreleri toplamak için dört °C'de, bir saat boyunca 20.621 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, bakterileri öldürmek için yaklaşık beş mL çamaşır suyu içeren bir erlenmeyere dökerek süpernatanı atın.

Hücre peletini toplamak için, bir spatula kullanarak hücre peletini santrifüj şişesinin tabanından sıyırın ve peleti 50-mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Q-Beta saflaştırma prosedürüne başlamak için, her bir hücre peletini 20 ila 30 mililitre 0.1-molar potasyum fosfat tamponu (pH 7) ile yeniden süspande edin. Resüspansiyonun içinde topak kalmadığından emin olun. Hücreleri, üretici protokolüne uygun olarak bir mikroakışkan işlemci (microfluidizer) kullanarak lizleyin. Partikül verimini artırmak için hücreleri en az iki kez lizleyin. Lizatları 250 mililitrelik santrifüj şişelerine aktarın ve dört santigrat derecede, bir saat boyunca 20.621 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Süpernatan hacmini mililitre cinsinden ölçün. Bu değeri 0,265 ile çarpın ve süpernatana bu miktarda (gram cinsinden) amonyum sülfat ekleyin. Proteini çöktürmek için bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde, dört santigrat derecede, 200 rpm hızda en az bir saat karıştırın. 250 mililitrelik şişelerde, dört santigrat derecede, bir saat boyunca 20.621 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yaklaşık 40 mililitre 0.1-molar potasyum fosfat tamponu (pH 7) ile yeniden süspande edin. Kaba numuneye eşit hacimde 1:1 kloroform: n-Bütanol ekleyin ve birkaç saniye boyunca vorteksleyerek karıştırın. Karışımı 38 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dört santigrat derecede, 30 dakika boyunca 20.621 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Üstteki sulu fazı geri kazanmak için bir pipet kullanın. Sulu ve organik fazlar arasında oluşan jel benzeri tabakadan herhangi bir miktar almamaya dikkat edin.

Ardından, önceden hazırlanmış %65'ten %40'a sakkaroz gradyanlarını çözdürün. Her bir gradyana yaklaşık iki mililitre ekstrakt yükleyin.

Serbest yavaşlama ile 4 °C'de 16 saat boyunca 99.582 ×g'de ultra-santrifüjleyin. Ultra-santrifüj işlemi tamamlandığında, mavi bir bandın görünür olduğunu onaylamak için her tüpün altına bir LED ışık tutun. Bu partikülleri geri kazanmak için uzun iğneli bir şırınga kullanın. Partikülleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 370.541 ×g'de ultra-pelletleyin. Elde edilen saflaştırılmış partikül peleti şeffaf olmalıdır. Süpernatan ı discard edin ve peleti pH 7, 0.1-molar potasyum fosfat tamponu ile yeniden süspande edin.

Bu şematik, gösterilecek olan konjugasyonu göstermektedir. Bir miligram Q-Beta içindeki disülfitlere oranla 10 eşdeğer Tris(2-karboksietil)fosfin veya TCEP, tüm disülfitleri indirgeyerek oda sıcaklığında bir saat içinde indirgenmiş Q-Beta kapsidlerini oluşturmak için kullanılır. Q-Beta üzerindeki disülfitlerin indirgenmesinden hemen önce taze bir TCEP çözeltisi hazırlayın.

100X stok çözelti hazırlamak için 0,002 gram TCEP'i bir mililitre ultra saf suda çözün. Bir mikrosantrifüj tüpüne 5 mg/mL Q-Beta'dan 200 mikrolitre ekleyin. Ardından, mikrosantrifüj tüpüne 20 mikrolitre 100X TCEP stok çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bu süre zarfında, indirgenmiş disülfitlerin yeniden köprülenmesi reaksiyonu için dibromo-maleimid polietilen glikol veya DB-PEG çözeltisini hazırlayın. 0,0017 gram DB-PEG'i 100 µL dimetilformamid içinde çözün. 680 µL 10 mM sodyum fosfat çözeltisi (pH 5) ekleyin. Ardından, indirgenmiş Q-Beta'yı DB-PEG çözeltisine ekleyin ve karıştırma işlemini el tipi 365 nm UV lamba altında gözlemleyin. Karıştırma üzerine, hemen parlak sarı bir floresan görülmelidir. Reaksiyonun oda sıcaklığında, bir rotisery üzerinde gece boyunca sürmesine izin verin.

Ertesi sabah, reaksiyon karışımını 4 °C'de, 3.283 ×g'de 20 dakika boyunca 1X PBS kullanarak santrifüj filtresi ile saflaştırın. Son olarak, konjugasyonu indirgenmemiş SDS poliakrilamid jel elektroforezi ve doğal agaroz jel elektroforezi ile izleyin.

Q-Beta üzerine DB-PEG konjugasyonu, UV ve Coomassie blue boyama ile indirgenmemiş SDS poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak doğrulanmıştır. Tüm floresan bantlar Coomassie blue boyama ile aynı konumda yer almış ve bu durum başarılı bir konjugasyonu temsil etmiştir. Q-Beta-PEG konjugatlarının bütünlüğü, doğal agaroz jel elektroforezi ve transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulanmıştır.

Üstteki mikrograf Q-Beta-maleimid veya Q-Beta-M'yi ve alttaki mikrograf Q-Beta-PEG'i göstermektedir. 0,1 molar potasyum fosfat tamponu içindeki Q-Beta-M ve Q-Beta-PEG'in floresan spektroskopisi, 400 nanometre civarında bir eksitasyon maksimumu ve 540 ila 550 nanometre civarında bir emisyon maksimumu göstermiştir. Q-Beta-PEG, serumsuz DMEM ortamındaki fare makrofaj hücreleri ile inkübe edilip ardından nükleer boyama yapıldığında, ko-lokalizasyon görüntüleri sarı floresan partiküllerin hücreler tarafından alındığını ve dört saatlik inkübasyonun ardından takip edilebildiğini göstermektedir.

Buna karşılık, fonksiyonelleştirilmemiş Q-Beta virüs benzeri partiküller ihmal edilebilir düzeyde floresan göstermektedir.

Bu protokol, araştırmacıların Q-Beta'yı dört gün içinde saflaştırmalarına ve gece boyunca süren yeniden köprüleme konjugasyon reaksiyonunu gerçekleştirmelerine yardımcı olabilir. Bu prosedürü uygularken, konjugasyon reaksiyonunun pH 5 gibi asidik koşullar altında en iyi şekilde çalıştığını hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, Q-Beta VLP'nin nasıl saflaştırılacağı ve floresan işaretli bir VLP üretmek için disülfit bağlarının dibromo-maleimid bileşikleriyle nasıl yeniden köprüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, araştırmacılara bakteriyofaj Q-Beta'nın dış yüzeyini çift işlevselleştirmek için kullanılabilecek ek bir fonksiyonel tutamak sağlamıştır.